熒光 PCR 檢測非洲豬瘟病毒的注意事項

（山西省太原市動物疫病預(yù)防控制中心， 山西太原 030027）

非洲豬瘟（African Swine fever,ASF）是由非洲豬瘟病毒引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。自2018年底我國發(fā)生非洲豬瘟疫情以來，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大經(jīng)濟損失[1]。利用熒光PCR檢測非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）是當(dāng)前診斷最有效的手段，對基層疫情排查、養(yǎng)殖場安全監(jiān)管、屠宰場宰前檢測都有重要意義。但是，由于基層實驗室人員素質(zhì)參差不齊、操作經(jīng)驗不足、設(shè)備條件有限，為提高檢測準(zhǔn)確性，本文將檢測中常見問題及注意事項逐一分析，總結(jié)如下。

1 實驗室及人員條件

PCR操作室應(yīng)與其他實驗室分離，且按準(zhǔn)備區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸擴增區(qū)等劃分，且人料分離，均單向移動。各區(qū)內(nèi)均應(yīng)安裝通風(fēng)設(shè)備、紫外燈等消毒設(shè)備。各區(qū)內(nèi)儀器、耗材須獨立使用。

操作人員應(yīng)進行崗前培訓(xùn)，了解分子生物學(xué)基本知識，養(yǎng)成規(guī)范化操作的習(xí)慣，能夠在實驗室正確操作檢測設(shè)備、防止污染、出現(xiàn)狀況及時解決。不同區(qū)域操作應(yīng)穿本區(qū)域的工作服，試驗中不得在不同區(qū)域無序流動，避免無關(guān)人員出入實驗室。

2 方法的選擇

2.1 熒光PCR快速檢測

常用于縣級以下獸醫(yī)實驗室、屠宰廠、養(yǎng)殖廠等。此法免去提取核酸的步驟，具有檢測時間短的優(yōu)勢。但為提高結(jié)果準(zhǔn)確性，在操作中盡量用新鮮的血液或組織樣品。為避免血紅素對擴增結(jié)果的干擾，全血與血清所用的劑量，應(yīng)嚴(yán)格按說明書區(qū)分取樣。在離心后如遇果凍狀樣品無法繼續(xù)實驗時，可將樣品減少使用劑量后（如10 μL縮至8 μL，目的是減少樣品在溶液中的濃度）重新加液離心。若室溫達不到20℃，可適當(dāng)延長1～2 min的室溫孵育時間。

2.2 熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)檢測

目前，實驗室多采用此方法檢測，具有準(zhǔn)確度高、Ct值相對穩(wěn)定等特點。以下幾點注意事項主要針對此方法[2,3]。

3 樣品采集

3.1 血液樣品

3.1.1 抗凝血

用含有EDTA-K2（紫蓋）的采血管從豬的頸靜脈、前腔靜脈或耳靜脈抽取全血。EDTA在全血溶液中若濃度過大，會對擴增結(jié)果造成干擾，導(dǎo)致假陰性出現(xiàn)，采血時溶液盡量達到采血器刻度線，若量不足，樣品前處理時加生理鹽水補齊到刻度線即可。避免使用含肝素（綠蓋）的抗凝管，肝素會抑制PCR反應(yīng)，造成假陰性。如自配 EDTA 溶液，為減少其濃度過高對擴增結(jié)果的影響，應(yīng)控制 EDTA 溶液體積占采血管溶液總量的 10%以內(nèi)。剛死亡的生豬可以采集心臟血，但注意防止污染環(huán)境。采血后，采血管上下勻速翻轉(zhuǎn) 2 次，防止局部抗凝血不良。不建議剪耳收集血液，溢出的血液易造成環(huán)境污染。全血 4℃保存送檢，全血不宜直接低溫保存，可離心取上層血清凍存[2-4]。

3.1.2 血清

使用不含抗凝劑的采血管 （紅蓋） 采血，方法同3.3.1。采樣后建議就地傾斜靜置一段時間，防止采樣后直接運送，車程顛簸造成溶血。返回實驗室室溫傾斜放置，析出血清后，收集血清 （1 mL），可用試驗或冷凍長期保存。

3.2 其他體液樣品

由于唾液中病毒含量受采樣時飲食影響較大，且受唾液內(nèi)核酸酶影響[5]，使非洲豬瘟病毒核酸的降解較快，因此除疫病發(fā)生的早期檢測需要，其他情況不建議采集唾液。鼻拭子采樣，用棉棒采集鼻中隔后深處分泌物，然后將棉棒置于含有 100 μg/mL 青霉素和鏈霉素的PBS （保證棉棒浸潤后管內(nèi)仍有大約 250 μL 液體即可）EP 管中，冷藏運輸。若采集精液，也應(yīng)冷藏運輸，待固化又液化后使用。

3.3 組織樣品

首選脾臟、淋巴結(jié)，其次是扁桃體、腎臟、心臟、肝臟和肺，剪取病變部位明顯拇指蓋大小即可。對于死亡時間較長的動物可采集骨髓。組織樣品采取冷藏運輸，實驗室可冷凍保存。

3.4 環(huán)境樣品

主要采集養(yǎng)殖場、屠宰場等可能污染的環(huán)境樣品，采集以易污染環(huán)境的“邊、角、縫”為主。養(yǎng)殖場員工鞋底、衣物、頭發(fā)、鼻孔也可采集。多點取樣，每點大于5 cm2。用濕潤的無菌脫脂棉球涂擦，更易吸附病毒，浸潤于10倍體積的生理鹽水中送檢，樣品的保存同體液樣品一致。

3.5 豬肉制品等其他樣品[3]

3.5.1 豬肉制品

豬肉：打孔器多點取樣，外部表層可用刀片刮?。伙溩樱杭糸_面皮取紅肉部分；午餐肉、肉脯：采集多塊，每塊分不同位置多點取樣；火腿：前中后及腸衣都要截??；臘肉：取瘦肉即可。以上樣品均取黃豆粒大小即可。

3.5.2 飼料

原料玉米、魚粉均可采集，成品飼料采集同一批次不同部分混合放于一個自封袋即可。

4 試驗操作

4.1 樣品前處理

4.1.1 液體樣品

取抗凝血、血清、唾液、鼻拭子液體、精液等豬體液及環(huán)境樣品的液體0.5 mL，高速冷凍離心機12 000 r/min離心3 min，或普通離心機2 000-3 000 r/min離心5 min均可，取上清液200 μL，用于核酸提取。

4.1.2 固體樣品

取0.2 g左右的豬肉（及制品）或飼料（及原料），加入10倍體積生理鹽水（約1～2 mL）中勻漿，取0.5 mL勻漿液按4.1.1方式和劑量離心、取上清液用于核酸提取。飼料等稠度大的可適量增加生理鹽水的量。

4.1.3 注意事項

①勻漿和離心的必要性。很多試驗操作為節(jié)省步驟，前處理時不離心，直接取樣本原液用于試驗，這樣易造成溶解不充分，各部位病毒不均勻，且原液含有的雜質(zhì)或血紅素等非特異性的干擾，極易造成試驗結(jié)果不準(zhǔn)確或產(chǎn)生假陰性。

②混樣量。早期非洲豬瘟患病豬癥狀明顯，病毒載量多，采樣檢測Ct值較小，混養(yǎng)數(shù)量可較多；隨著臨床癥狀不明顯的樣品增多，樣品Ct檢測值逐漸增大。當(dāng)混樣數(shù)量太多，混樣后的Ct值大于35時極易造成假陰性。為提高檢測準(zhǔn)確性，當(dāng)本地單個樣品Ct值大于或等于35時，建議混樣量不超過10個。若按本地經(jīng)驗數(shù)量混合后檢測，Ct值均未超過35，可延續(xù)混樣經(jīng)驗值。

4.2 核酸的提取

4.2.1 不同提取法

目前提取核酸的主要方法有柱式法和磁珠法，各有優(yōu)劣。柱式法人為操作影響因素大，對實驗人員經(jīng)驗要求高。磁珠法，人為干擾因素較小，但儀器成本高，采用此方法試劑盒需在使用前提前半小時取出回溫。

4.2.2 注意事項

控制樣品及核酸污染。①試驗加樣要盡量選能滿足需要且較大容量的槍，防止加樣過程中槍頭液體過滿產(chǎn)生倒流而污染移液器；②提前取出EP管，置于加樣架上，嚴(yán)禁操作過程中手直接伸進EP管袋中取管，如有需要，用鑷子夾取；③樣品量過滿的采樣管盡量兩手開蓋，小心液體污染拇指，造成上下樣品間污染；④同一樣品滅活后檢測Ct值會增大，屬正常現(xiàn)象；⑤核酸提取后，所有耗材及液體均要置于含消毒液的自封袋中，封口包裝，避免直接接觸空氣，造成實驗室核酸的氣溶膠污染；⑥核酸提取后室溫易降解，最好直接用于擴增檢測或- 20℃保存。

4.3 PCR反應(yīng)體系的配制

①提前30 min將試劑盒置于室溫，待各反應(yīng)管中液體充分回溫融化后再操作；②選擇合適劑量的移液器，精準(zhǔn)取樣，防止槍尖液體掛壁太多導(dǎo)致試劑不夠用；③加樣加到PCR反應(yīng)管底部，防止氣泡產(chǎn)生影響擴增結(jié)果；④陽性對照管必須進行瞬時離心再開管，加樣時盡量使用帶濾芯的10 μL長槍頭，防止污染，所有樣品加完后最后加陽性對照；⑤明確所用PCR儀采光方向，防止人為的標(biāo)記記號影響采光，導(dǎo)致結(jié)果差異；⑥擴增后待反應(yīng)管涼透再取，切記不要打開反應(yīng)管，防止氣溶膠污染，按生物安全相關(guān)要求處理即可。

4.4 結(jié)果常見問題分析

擴增是在陰陽性樣品成立的條件下，樣品在指定范圍內(nèi)出現(xiàn)特異性的擴增曲線為標(biāo)準(zhǔn)，但試驗受環(huán)境、樣品、機器和操作等多種因素影響，常見問題有以下4種。

4.4.1 假陽性

①出現(xiàn)假陽性的主要原因是污染，實驗室分區(qū)和人員流向不合理，未按規(guī)定走向順序移動，人為引發(fā)核酸污染；②實驗室長期使用，生物安全措施執(zhí)行不規(guī)范，造成實驗室核酸氣溶膠污染；③體系配制過程中陽性對照未離心就使用或開管、蓋口朝下放置等人為操作問題，造成陽性對照污染樣品及環(huán)境。④試驗操作不當(dāng)，樣品中陽性擴散污染其他樣品。

4.4.2 假陰性

①樣品未加入反應(yīng)體系中。由于加樣量少，加樣時應(yīng)確保樣品槍頭深入體系液中，全部注入；②樣品含抑制劑（如EDTA、血紅素等）干擾熒光信號，應(yīng)盡量降低此類物質(zhì)在樣品中的含量；③Ct值大于35的檢測樣品受環(huán)境、操作等人為因素影響較大，且隨著保存時間延長可能導(dǎo)致復(fù)檢結(jié)果陰性；④人工標(biāo)記的記號阻礙熒光信號采集方向；⑤不同廠家陽性樣品交叉使用，造成陽性擴增失敗；⑥樣品的儲存、前處理、提取方法的不合理及不同人員的操作均可能導(dǎo)致假陰性。

4.4.3 復(fù)檢結(jié)果不一致

①同一樣品的Ct值滅活后檢測較滅活前大；②試劑多次凍融后復(fù)檢測；③唾液樣品受酶干擾大，降解快，Ct值變化快；④全血冷凍保存后再次檢測；⑤血液樣品受血紅素干擾大，溶血樣品前后檢測的溶液中血紅素含量差異大；⑥混樣量太多，樣品濃度太低，導(dǎo)致每次取樣誤差大。

4.4.4 其他

①整體或部分翹尾現(xiàn)象，大多由于實驗室形成核酸氣溶膠污染。②樣品和陽性對照都無曲線時，應(yīng)重新核查擴增時程序的設(shè)置、試劑購進后的保存及使用過程中反復(fù)凍融等人為因素；③陽性對照成立但樣品無擴增曲線，應(yīng)考慮樣品及耗材的問題，如在提取核酸時避免用含 EDTA 的管洗脫等錯誤操作。

5 PCR實驗室的生物安全

5.1 消毒

試驗前應(yīng)對生物安全柜開紫外燈照射30 min，試驗臺廢液缸內(nèi)套袋，內(nèi)倒消毒劑，試驗過程中用過的吸頭等廢棄物品棄入廢液缸，且浸泡于消毒液中，試驗過程中有污染隨時用消毒劑擦拭；試驗操作結(jié)束，及時用普通消毒劑和核酸祛除劑擦拭操作區(qū)域及使用過的移液器等物品。每次試驗結(jié)束后地面、桌面及使用過的儀器均應(yīng)用含有消毒劑的水整體清潔；試驗服每周消毒、清洗，且不同區(qū)域不得交叉使用。

5.2 控制核酸污染

5.2.1 核酸污染的危害

在核酸（DNA或RNA）的提取和擴增中，如不規(guī)范操作，核酸可存在于桌面、儀器、耗材以及空氣中，尤其是氣溶膠攜帶的核酸片段在空氣中漂浮，很難消除，也是造成試驗假陽性的重要原因之一。

5.2.2 避免污染產(chǎn)生的方法

為了避免污染，除做好常規(guī)消毒外，建議使用專門祛除核酸的清潔劑，置于不同操作間及生物安全柜中，尤其是核酸提取、體系配制和擴增區(qū)域。每次操作結(jié)束及時噴涂擦拭。在操作完后應(yīng)繼續(xù)讓生物安全柜通風(fēng)至少10 min，過濾操作過程中產(chǎn)生的氣溶膠性污染，通風(fēng)結(jié)束再開紫外燈消毒。嚴(yán)禁將含有核酸的耗材用高壓鍋消毒，高壓鍋放氣時會直接污染實驗室。核酸提取使用過的耗材和PCR管，直接放入含消毒劑的自封袋內(nèi)密封處理。室內(nèi)環(huán)境要時常開窗通風(fēng)，保證實驗室空氣的流通。

5.3 耗材及廢棄物的處理

使用過的實驗器材和液體廢棄物應(yīng)先經(jīng)過消毒液浸泡處理后密封。剩余樣品等固體廢棄物應(yīng)在生物安全柜中密封包裝，經(jīng)表面消毒后再移出，按醫(yī)療廢棄物途徑銷毀。