豬胚胎冷凍技術(shù)的研究歷程與未來展望

（吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062）

胚胎工程是一項(xiàng)綜合性的動物繁育技術(shù)，對于畜牧業(yè)生產(chǎn)有著十分重要的意義。胚胎冷凍保存是胚胎工程中的重要環(huán)節(jié)，也是動物保種、基因庫建立的必要手段。利用胚胎冷凍保存技術(shù)能夠保存珍稀動物品種和優(yōu)良生產(chǎn)性能家畜的遺傳資源，促進(jìn)克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究方面的發(fā)展，推廣胚胎移植技術(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。生豬生產(chǎn)作為我國畜牧產(chǎn)業(yè)重要組成部分，同時(shí)也是生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)重要的實(shí)驗(yàn)動物來源。豬的克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)在體細(xì)胞克隆、異種器官移植和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等方面具有良好的研究前景。值得注意的是，胚胎冷凍技術(shù)也是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。目前，在大多數(shù)哺乳動物中胚胎冷凍技術(shù)已逐漸成熟和穩(wěn)定，利用玻璃化冷凍技術(shù)對各個(gè)發(fā)育階段的胚胎進(jìn)行冷凍保存均已獲得成功。然而，由于豬胚胎的特殊理化性質(zhì)，導(dǎo)致豬胚胎冷凍保存的研究進(jìn)展十分緩慢。因此，建立和優(yōu)化豬的胚胎冷凍體系的研究既具有重要的理論意義也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 豬胚胎常規(guī)冷凍

胚胎的冷凍保存是指將胚胎和冷凍劑裝入凍存管中，經(jīng)過降溫后使胚胎的生命活動暫時(shí)靜止，并能夠通過升溫恢復(fù)正常生命活動的保存過程。哺乳動物胚胎冷凍技術(shù)最先使用的方法是緩慢冷凍法，Whittingham等[1]通過逐漸降溫（0.3～2℃/min） 到 - 80℃后投入液氮中，將小鼠胚胎保存8 d后，取出冷凍的胚胎，通過胚胎移植后可成功繁殖后代。這一方法使哺乳動物胚胎的冷凍保存成為可能。但是由于降溫控制和實(shí)驗(yàn)設(shè)備等要求較為苛刻，距離實(shí)際應(yīng)用還有一定距離。之后，Willadsen等[2]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良并開發(fā)了快速冷凍法，將胚胎置于冷凍劑中，1℃/min -的速度緩慢降溫至 40℃時(shí)投入液氮中保存。在解凍時(shí)，直接放入25℃的溫水中快速解凍。這種方法由于操作過程時(shí)間較短，操作流程簡便，因此得到廣泛應(yīng)用。這2種常規(guī)程序化冷凍方法在牛[3]、羊[4]、馬[5]甚至人類[6]胚胎中成功應(yīng)用并繁殖了后代。

傳統(tǒng)的胚胎冷凍方法在豬繁殖方面一直無法成功應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，豬胚胎具有低溫敏感性，當(dāng)達(dá)到一定生理溫度（15℃）時(shí)，便會造成不可逆轉(zhuǎn)的生理損傷。Wilmut[7]和Polge等[8]首次提出胚胎的低溫耐受性與脂質(zhì)含量有關(guān)。Fujino[9]和Nagashima等[10]的研究證實(shí)在豬胚胎發(fā)育過程中不同時(shí)期胚胎內(nèi)脂質(zhì)含量存在顯著差異。胚胎在發(fā)育初期脂質(zhì)含量高，耐低溫能力差。直至發(fā)育至桑葚胚后，脂質(zhì)含量顯著下降，胚胎才能夠冷凍保存，因此，發(fā)明了離心冷凍法。通過離心將細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)離心至胚胎的一側(cè)，然后通過顯微操作將聚集的脂質(zhì)液滴從胚胎中去除。去脂后，顯著提高了豬胚胎的低溫耐受性。基于這一方法，研究人員成功將2～8細(xì)胞期的胚胎以常規(guī)緩慢冷凍法保存[11-14]。然而，研究一直未能成功通過胚胎移植獲得后代，或成功率極低且試驗(yàn)無法重復(fù)。這一問題直到玻璃化冷凍技術(shù)的出現(xiàn)，才得以解決。在我國研究歷史中，張德福等[15]通過開放式拉長細(xì)管（Open Pulled Straw,OPS）玻璃化冷凍法，首次獲得了豬胚胎超低溫（-196℃）冷凍后代。

2 豬胚胎玻璃化冷凍

玻璃化冷凍（Vitrification）方法于1985年由Rall等提出。玻璃化是指高濃度的冷凍劑在高速降溫時(shí)可以由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷w的固態(tài)，這種狀態(tài)保存了分子和離子的正常分布，不會形成冰晶結(jié)構(gòu)從而保護(hù)細(xì)胞形態(tài)的完整。玻璃化冷凍是將胚胎置于高濃度的冷凍劑中，細(xì)胞外高滲透壓和勢能使胚胎脫水，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)源性的大分子物質(zhì)濃縮和冷凍劑中保護(hù)物質(zhì)的滲入，使其降溫時(shí)進(jìn)行玻璃化而不形成冰晶。

1994年Dobrinsky[16]首次應(yīng)用玻璃化冷凍法，使用甘油作為冷凍劑成功保存了豬的擴(kuò)張期囊胚和孵化囊胚。從此，豬胚胎玻璃化冷凍技術(shù)開始迅速發(fā)展，并逐步進(jìn)行改良。1997年Vajta[17]開發(fā)了OPS玻璃化冷凍法。具體方法是將0.25 mL的冷凍細(xì)管加熱拉長，使其直徑降低至0.88 mm，并使管壁厚度降低至0.07 mm。因?yàn)楣鼙谳^薄，溫度傳導(dǎo)性好，使胚胎迅速通過冰晶形成的危險(xiǎn)溫區(qū)以減少冷凍造成的細(xì)胞損傷。由于細(xì)管內(nèi)部體積小，可有效地減少冷凍劑使用，降低冷凍劑的細(xì)胞毒性造成的細(xì)胞損傷?；诖嗽?，科研人員開發(fā)了超細(xì)開放式拉長細(xì)管冷凍技術(shù)（Superfine Open Pulled Straw,SOPS）和玻璃化快速冷凍儀冷凍技術(shù)（Vit-Master-SOPS）[18]。利用以上2項(xiàng)技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)，保存的擴(kuò)張期囊胚存活率和孵化率不受影響，但保存的桑葚胚和初期囊胚的孵化率還是有所下降[19]。進(jìn)一步的研究表明，在沒有去除脂質(zhì)的情況下，利用OPS技術(shù)甚至能夠保存2～4細(xì)胞期的胚胎[20]。因?yàn)闊o需進(jìn)行脫脂處理，因此胚胎保留了完整的透明帶。玻璃化的桑葚胚和囊胚進(jìn)行胚胎移植后，成功獲得了后代仔豬[18,21-23]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，OPS玻璃化冷凍會顯著降低初期胚胎的存活率[20]。綜合之前的研究結(jié)果，研究人員將脂質(zhì)離心技術(shù)和OPS玻璃化冷凍技術(shù)相結(jié)合，顯著提升了早期和孵化囊胚期冷凍胚胎的存活率[24,25]，而且使體外生產(chǎn)的胚胎（In Vitro Production of Embryos,IVP）也能夠得到保存。

為了滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需求和達(dá)到生物醫(yī)學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)，胚胎的冷凍保存需要盡量保持透明帶的完整，以保證生產(chǎn)的穩(wěn)定性和較高的生物安全性。但是在機(jī)械離心脫脂法中，使用玻璃針在透明帶穿刺以去除脂質(zhì)的操作，顯著增加了胚胎污染的風(fēng)險(xiǎn)。同樣，在玻璃化冷凍中部分操作方法需要樣品直接與液氮接觸來提升降溫速率，這同樣也增加了胚胎冷凍和存儲過程中被污染的風(fēng)險(xiǎn)[26-28]?；谶@些需求，胚胎保存技術(shù)開始進(jìn)一步改進(jìn)。Li等[29]提出了一種不需要顯微操作的胚胎脫脂冷凍保存方法，即使用胰蛋白酶處理胚胎或者將胚胎處置于高滲透壓溶液中，以擴(kuò)大卵周間隙，之后通過離心使極化的脂質(zhì)滴與卵裂球的細(xì)胞質(zhì)之間的橋狀結(jié)構(gòu)破裂，導(dǎo)致脂質(zhì)滴無法重新分布到胚胎的卵裂球中，而是保留在完整的透明帶內(nèi)，從而降低胚胎冷凍過程中脂質(zhì)含量上升導(dǎo)致的低溫敏感性。這種方法降低了操作造成的污染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也提升了工作效率，使IVP胚胎的商業(yè)生產(chǎn)成為可能。從另一角度出發(fā)，為了降低直接接觸液氮造成的污染，Misumi等[30]開發(fā)了微風(fēng)量空氣冷凍法（Micro Volume Air Cooling,MVAC）。他們研發(fā)了一種特殊的設(shè)備結(jié)構(gòu)，避免了胚胎冷凍劑和液氮的直接接觸，有效的降低了污染風(fēng)險(xiǎn)。但由于設(shè)備結(jié)構(gòu)的特殊性，離實(shí)際應(yīng)用仍有一定差距。

3 豬胚胎玻璃化冷凍的研究方向

3.1 玻璃化冷凍劑的改良

冷凍劑作為凍存胚胎的直接載體，對其進(jìn)行改良可有效地保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提升胚胎耐低溫能力。冷凍劑根據(jù)其作用方式，可以分為滲透性冷凍劑和非滲透性冷凍劑。滲透性冷凍劑是指具有可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中特性的冷凍劑，一般為小分子物質(zhì)。其中常見的有二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）、甘油（GL）等。非滲透冷凍劑則不能進(jìn)入細(xì)胞，其通過改變細(xì)胞外滲透壓來降低胚胎內(nèi)水分含量，包括蔗糖、葡萄糖、聚乙烯醇（PVC）等。研究表明，這2類冷凍劑對豬囊胚保存的作用效果無顯著性差異[31]。高劑量冷凍劑在使細(xì)胞脫水的同時(shí)也存在細(xì)胞毒性，有研究證明根據(jù)胚胎狀況可以適當(dāng)降低冷凍劑濃度，不會降低冷凍效果[32,33]。但關(guān)于冷凍劑濃度和處理胚胎時(shí)期的研究，仍有待探索和改良。

新型冷凍劑的研發(fā)也是十分重要。1992年Rubinsky等[34]首先發(fā)現(xiàn)了魚抗凍蛋白質(zhì)（AFGPs）并添加在抗凍劑中，顯著提升了冷凍的豬卵母細(xì)胞的活性?？箖龅鞍踪|(zhì)可以與哺乳動物細(xì)胞膜相互作用，阻止冰的結(jié)晶化和晶體的生長，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)?？箖龅鞍椎膽?yīng)用，提供了冷凍劑改良的新思路，一些天然的蛋白質(zhì)或多肽開始被研究并應(yīng)用于冷凍劑中。例如ε-聚賴氨酸（ε-PL），它是一種有抑菌活性的L-賴氨酸大分子聚合物，具有有效濃度低、安全無毒、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)在冷凍液中添加30 g/L的ε-聚賴氨酸（ε-poly-lysine），平衡1 min，冷凍效果最好，囊胚期胚胎的存活率達(dá)91.2%，孵化率達(dá)89.7%。Maki Kamoshita等則通過添加ε-聚-L型-賴氨酸（ε-poly-L-lysine）成功冷凍了豬原核期胚胎。因此，關(guān)于冷凍劑成分的改良仍有很廣泛的研究空間。

3.2 玻璃化冷凍流程的優(yōu)化

從最開始的OPS玻璃化冷凍法，到SOPS和Vit-Master-SOPS技術(shù)的改良，玻璃化冷凍承載工具開始迅速發(fā)展?；诮档屠鋬鰟┯昧浚嵘郎囟壬邓俣鹊淖钚◇w積冷凍（Minimum Volume Cooling,MVC）[35]的概念，研究人員開發(fā)了微滴冷凍法（Microdroplet），將胚胎和冷凍劑混合制作成冷凍液滴，直接滴入液氮中進(jìn)行快速冷凍，收集冷凍形成的固態(tài)顆粒進(jìn)行保存[36]。DinnyésA等[37]使用的固體表面玻璃化法 （Solid Surface Vitrification,SSV），將液氮更換為預(yù)冷至-150℃的金屬板，也具有同樣的效果。Lane等[38]研發(fā)的Cryo-loop工具是一個(gè)頂端固定了寬20 μm、直徑0.5～0.7 μm尼龍圓環(huán)的不銹鋼錐。在使用時(shí)先將Cryo-loop浸泡在冷凍劑中，利用液體的表面張力形成一層薄膜，再將胚胎轉(zhuǎn)移到薄膜上并直接投入液氮中保存?；诖嗽恚芯咳藛T開發(fā)了極速冷凍薄膜（Cyrotop）。這種設(shè)計(jì)使胚胎的玻璃化體積達(dá)到了0.1 μL。發(fā)現(xiàn)使用Cryotop工具較微滴冷凍法，能夠顯著提升豬囊胚玻璃化冷凍的成活率[39]。

由于直接接觸液氮冷凍以及較為復(fù)雜的操作過程，如上文所述，這些方法還存在著種種弊端，無法滿足試驗(yàn)和生產(chǎn)的要求。在保證冷凍效果的同時(shí)，也需要簡化生產(chǎn)操作，降低設(shè)備使用成本，以達(dá)到可以推廣使用的目的。因此，玻璃化冷凍流程的優(yōu)化仍需要深入研究。

3.3 玻璃化冷凍與多組學(xué)研究

隨著測序技術(shù)的更新發(fā)展，生物領(lǐng)域的研究跨入了轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)聯(lián)合分析的時(shí)代[40]。多組學(xué)研究能夠從分子層面上解析復(fù)雜的生物學(xué)進(jìn)程，使生物發(fā)育、衰老、死亡的機(jī)制研究更為深入透徹[41]。在胚胎冷凍方面，組學(xué)的研究才剛剛開展，而關(guān)于玻璃化冷凍對豬胚胎的組學(xué)研究則尚未報(bào)道。Miriam[42]和Bartolac等[31]通過qPCR檢測了玻璃化冷凍的胚胎中基因的差異表達(dá)。發(fā)現(xiàn)冷凍劑的添加并不會改變囊胚中胰島素樣生長因子2（Insulin-like Growth Factor 2,IGF2）和其受體（IGF2R）的基因表達(dá)。但玻璃化冷凍后會導(dǎo)致囊胚中的轉(zhuǎn)錄因子（POU Class 5 Homeobox 1,POU5F1）、熱休克蛋白 （Heat Shock Protein 70,HSPA1A）、IGF2和IGF2R等的基因表達(dá)發(fā)生顯著性改變。因此，使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)從分子水平揭示胚胎玻璃化冷凍過程中發(fā)生的變化是可行的，進(jìn)而使多組學(xué)的聯(lián)合分析成為可能。解析玻璃化冷凍影響胚胎生存率的作用機(jī)制，對未來玻璃化冷凍的改良具有重要的參考意義。

4 總結(jié)與展望

經(jīng)過近40年對胚胎長期冷凍保存技術(shù)的研究和探索，至今該技術(shù)已在胚胎工程、動物繁殖和生物醫(yī)學(xué)等行業(yè)發(fā)揮了重要作用。雖然豬胚胎具有特殊的生物學(xué)特征，使其冷凍保存較為困難，研究進(jìn)展也相對緩慢。但是，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，使得針對豬胚胎低溫敏感和冷凍損傷的分子機(jī)制探究成為可能。同時(shí)，隨著更多新型生物材料的研發(fā)和應(yīng)用、胚胎冷凍保存技術(shù)的升級以及理論的不斷進(jìn)步，使豬胚胎冷凍保存的商業(yè)化生產(chǎn)成為可能。