黃芪多糖在腸道黏膜誘導(dǎo)的內(nèi)毒素耐受樣免疫反應(yīng)研究進展

李玉龍，楊健濤，楊志強，姚軍虎，楊小軍*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712000；3.山東省飼料檢驗所，山東濟南 250000）

黃芪作為一種非營養(yǎng)性飼料添加劑應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)具有無殘留、毒副作用小、無抗藥性等多方面優(yōu)勢，其浸提物含多糖、皂苷、黃酮、氨基酸和微量元素等較多有機化學(xué)成分，其中的主要活性物質(zhì)是存在于黃芪根莖中的多糖類物質(zhì)，稱為黃芪多糖。黃芪多糖是由干燥的黃芪根經(jīng)破碎、提取、濃縮、純化而獲得的棕色水溶性多糖，可通過其構(gòu)效調(diào)節(jié)作用影響免疫系統(tǒng)活性和功能狀態(tài)，換言之，免疫相關(guān)識別受體與黃芪多糖的互作是基于其空間結(jié)構(gòu)特性的[1-2]，進而發(fā)揮免疫激活、抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒等生物活性作用[1,3]。

黃芪多糖是一種可在腸道中發(fā)揮作用的植物源免疫調(diào)節(jié)劑[2]，黃芪多糖被動物攝入后在腸道中可發(fā)生酸水解，降解為短鏈雜多糖，進而被腸道黏膜免疫系統(tǒng)攝取識別，調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫系統(tǒng)功能。腸道是動物最重要的消化吸收器官，也具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，腸道健康是保證機體營養(yǎng)和健康的前提，而黃芪多糖的免疫反應(yīng)發(fā)生于腸道黏膜，且可有效改善腸道健康。本文綜述了黃芪多糖對腸道黏膜免疫系統(tǒng)的調(diào)控效應(yīng)及其相關(guān)作用機制，為黃芪多糖的合理運用提供一定的理論參考。

1 黃芪多糖的構(gòu)效調(diào)節(jié)特性

1.1 黃芪多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu) 黃芪多糖是一種具有高效免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的功能性多糖，作為一種多支鏈雜多糖，其結(jié)構(gòu)分析的難度較大，當(dāng)前黃芪多糖結(jié)構(gòu)分析主要關(guān)注其單糖組成和糖苷鍵連接狀況，黃芪多糖糖鏈上的主要單糖為葡萄糖，主鏈為α-D-葡萄糖以1，4-糖苷鍵線性連接而成，支鏈結(jié)合點主要為α-1，2，6-葡萄糖，每9 個葡萄糖苷殘基有1 個連接在C-6 位置的α-D-葡萄糖[4]，形成黃芪多糖的支鏈結(jié)構(gòu)，構(gòu)成支鏈的單糖種類較多，包括葡萄糖、鼠李糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖等[5-6]。脂多糖（LPS）的分子結(jié)構(gòu)與黃芪多糖存在顯著差異性，LPS 是由核心多糖、O-多糖側(cè)鏈和類脂A 組成，且LPS 的免疫毒性成分主要為類脂A，這也是黃芪多糖與LPS 產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用差異性的主要原因。

1.2 黃芪多糖的免疫識別受體 Toll 樣受體（Toll-Like Receptors，TLRs）家族是動物最重要的免疫識別受體家族，可識別多種外源和內(nèi)源抗原分子，參與固有和適應(yīng)性免疫過程，調(diào)控免疫活性和功能狀態(tài)[7]，也是腸道黏膜免疫系統(tǒng)最重要的免疫識別和調(diào)控因子[8]。其中，TLR4 是一種可特異性識別多糖類抗原的細胞表面受體，可識別LPS 并活化下游炎癥反應(yīng)，激活TNF-α、ΙL-8等促炎細胞因子的高表達[9]。而有研究證實黃芪多糖可通過競爭性抑制作用拮抗LPS 活化的炎癥反應(yīng)，抑制LPS 誘致的小鼠腸道黏膜炎癥反應(yīng)及組織損傷[10]。細胞水平的試驗也說明黃芪多糖可影響TLR4 通路活性。Wei 等[11]在RAW264.7 細胞上的研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可劑量依賴性的激活TLR4 通路，并活化多種相關(guān)細胞因子的表達。以小鼠膀胱上皮細胞為模型的研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可誘導(dǎo)TLR4 高表達，并可提高膀胱黏膜固有免疫反應(yīng)活性，增強黏膜細菌感染抵抗能力[12]，這說明黃芪多糖免疫識別受體是TLR4，黃芪多糖可通過調(diào)控TLR4 通路活性影響機體免疫功能狀態(tài)。

1.3 黃芪多糖的構(gòu)效調(diào)節(jié)作用 黃芪多糖的構(gòu)效調(diào)節(jié)作用是指黃芪多糖的生物調(diào)節(jié)活性，是源于黃芪多糖單糖組成、構(gòu)象特征、分子量、官能團和分支結(jié)構(gòu)特征等結(jié)構(gòu)特性[13-14]，主要表現(xiàn)在2 個方面：其一，黃芪多糖的結(jié)構(gòu)特性使之易于被腸道黏膜免疫系統(tǒng)攝取識別，黃芪多糖與腸黏膜表面的黏蛋白糖鏈具有結(jié)構(gòu)類似性，這種結(jié)構(gòu)相似性可促進黃芪多糖粘附于腸道黏液層，使之易于被腸道上皮和淋巴細胞表面的特異性免疫受體所識別；其二，黃芪多糖分子結(jié)構(gòu)是其免疫識別的基礎(chǔ)，TLR4/MD-2 是一種多糖免疫識別受體，主要通過其雜多糖和多支鏈結(jié)構(gòu)特性識別黃芪多糖[13]，通過改變黃芪多糖的結(jié)構(gòu)特性（如通過伽馬射線處理、磺酸化修飾等）可影響其生物活性，顯著提高黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)活性[15-16]。

2 黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)活性和反應(yīng)類型

黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)活性與內(nèi)毒素耐受具有較高的一致性，是一種內(nèi)毒素耐受樣免疫反應(yīng)，一方面可有效抑制炎癥反應(yīng)，同時具有一定免疫活化作用。

2.1 黃芪多糖的抗炎調(diào)控效應(yīng) 黃芪多糖是一種具有高效抗炎調(diào)節(jié)作用的功能性多糖。小膠質(zhì)細胞上的研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可通過抑制LPS 誘導(dǎo)的NO 和PGE2 合成，降低促炎細胞因子ΙL-1β和TNF-α的表達水平，從而有效抑制炎癥反應(yīng)[17]。Zhu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可顯著抑制TNF-α刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)的NF-κВ、ΙCAM-1 和VCAM-1 高表達，緩解因炎癥導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞凋亡、活性氧合成及黏附功能損傷。

在體試驗的結(jié)果與此一致，黃芪多糖可顯著抑制三硝基苯磺酸誘導(dǎo)小鼠腸道炎癥模型結(jié)腸中的TNF-α、ΙL-1β和NFATc4 高表達，從而抑制腸炎發(fā)生[19]，黃芪多糖對LPS 誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥同樣具有顯著抑制作用[10]。除了對腸道的影響，黃芪多糖還可緩解其他臟器的炎癥反應(yīng)，如黃芪多糖可通過下調(diào)小鼠心肌TLR4-NF-κВ p65 信號通路活性和相關(guān)促炎細胞因子的表達（ΙL-1β、ΙL-6、TNF-α等）來抑制柯薩奇病毒В3誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)，保證心肌健康以利于維持其正常的泵血能力[20]。總之，黃芪多糖具有高效炎癥抑制作用，鑒于黃芪多糖的調(diào)控效應(yīng)發(fā)生于腸道，說明黃芪多糖可有效防止腸道炎癥的發(fā)生，改善腸道黏膜免疫狀況。

2.2 黃芪多糖的免疫激活調(diào)控效應(yīng) 黃芪多糖免疫反應(yīng)與內(nèi)毒素耐受一致的另一功能特性為適度免疫激活作用，黃芪多糖可刺激免疫細胞（如T/В 淋巴細胞及外周血單核細胞）的增殖[21]，并顯著提高相應(yīng)細胞因子（ΙL-1、TNF-α等）的合成和分泌，從而激活動物的免疫系統(tǒng)活性[22]，而且黃芪多糖能夠通過促進T 淋巴細胞增 殖，提 高 血 清ΙFN-γ、ΙL-2、ΙgG、ΙgM 水 平，有效緩解環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制[23]，黃芪多糖還可通過提高免疫細胞數(shù)量和ΙNF-γ、ΙL-2 細胞因子水平進而提高免疫抑制犬的細胞免疫活性[24]。小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可顯著促進樹突狀細胞的成熟，提高ΙL-4、ΙL-2、ΙFN-γ等細胞因子的表達，并減少調(diào)節(jié)性T 細胞數(shù)量，從而提高了機體免疫系統(tǒng)活性[25]。在鯉魚[26]、海參[27]和羅非魚[28]上的研究同樣顯示黃芪多糖具有免疫激活調(diào)控效應(yīng)，可顯著提高脾臟等免疫器官中TNF-α等細胞因子的表達水平，并激活免疫細胞固有免疫反應(yīng)活性，從而激活其免疫系統(tǒng)功能。

同樣基于黃芪多糖的免疫促進作用，黃芪多糖可作為一種高效佐劑提高疫苗免疫效果[6,25,29]，并可通過其免疫激活效應(yīng)顯著提高已感染法氏囊病肉雞的免疫功能[30]。通過其免疫激活調(diào)控效應(yīng)，黃芪多糖還可改善腸道組織形態(tài)和營養(yǎng)利用效率[31]，腸道上皮細胞的更新依賴于適度的免疫刺激，這就說明黃芪多糖所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)在抑制炎癥的同時，還具有免疫激活調(diào)控效應(yīng)，與內(nèi)毒素耐受反應(yīng)具有高度一致性。

2.3 黃芪多糖活化的內(nèi)毒素耐受樣免疫反應(yīng) 內(nèi)毒素耐受是免疫細胞經(jīng)低劑量內(nèi)毒素刺激后產(chǎn)生的對高劑量內(nèi)毒素的耐受，是由細胞因子信號通路下游負反饋激活的，具有防止炎癥持續(xù)性傷害作用的免疫穩(wěn)態(tài)維持機制[32]，經(jīng)典的內(nèi)毒素耐受是由LPS 反復(fù)刺激巨噬細胞TLR4 信號通路激活的，TLR4 下游MyD88 和TRΙF 信號通路活化的偏向性決定了免疫反應(yīng)類型，其中MyD88 及其下游TRAF6可活化NF-κВ表達，從而偏向激活炎癥反應(yīng)[33]，而TRΙF 則可偏向性激活內(nèi)毒素耐受免疫反應(yīng)，在內(nèi)毒素耐受狀態(tài)下TLR4 下游的TRΙF 通路處于活化狀態(tài)，而MyD88 通路處于靜息狀態(tài)[32]。而黃芪多糖對應(yīng)的免疫識別受體也是TLR4，且黃芪多糖的免疫調(diào)控效應(yīng)與內(nèi)毒素耐受具有高度一致性。

黃芪多糖可有效抑制LPS 活化的MyD88-NF-κВ通路，并顯著抑制下游的炎性細胞因子表達[34]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)肉雞飼糧添加0.3% 黃芪多糖可有效抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，腹水注射黃芪多糖和硫酸化黃芪多糖同樣可抑制LPS 誘導(dǎo)的促炎細胞因子TNF-α和ΙL-1β高表達，并可顯著提高腸道黏膜緊密連接蛋白ZO-2 和OCLN 的表達，進而改善肉雞腸道組織形態(tài)[2,16]。本課題組進一步探索了黃芪多糖對商品代肉雞免疫性能的父系傳代調(diào)控效應(yīng)，研究結(jié)果顯示種公雞飼糧添加1%黃芪多糖可傳代調(diào)控商品代肉雞腸道黏膜TLR4 通路活性狀態(tài)，在此過程中，TRΙF 通路處于活化狀態(tài)，其下游Ι 類干擾素激活的SOCS1 可抑制MyD88下游TRAF6 活化，導(dǎo)致MyD88 通路抑制，產(chǎn)生與內(nèi)毒素耐受一致的免疫反應(yīng)狀態(tài)[35]。

鑒于黃芪多糖所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)發(fā)生于腸道黏膜免疫系統(tǒng)，本課題組選取Caco2 細胞模型，就黃芪多糖對腸道上皮細胞的內(nèi)毒素耐受樣調(diào)控效應(yīng)進行了一系列研究。Caco2 是一種結(jié)腸癌細胞，可作為腸上皮細胞模型研究腸道黏膜免疫反應(yīng)的調(diào)控作用和相關(guān)機制，通過綜合Caco2 細胞促炎細胞因子（TNF-α、ΙL-1、ΙL-8 等）和PGE-2 表達，結(jié)合Caco2 細胞單層通透性作為綜合指標來說明Caco2 細胞炎癥反應(yīng)狀態(tài)[36]，試驗結(jié)果顯示黃芪多糖可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的TNF-α、ΙL-1β、ΙL-8 及TLR4 高表達[37]，并可提高Caco2 細胞ZO-2 和OCLN 的表達，電生理指標顯示黃芪多糖可顯著提高LPS 刺激Caco2 細胞單層的完整性，總之，黃芪多糖具有抗炎和改善上皮細胞完整性的生物作用[38]。綜合動物試驗和細胞試驗結(jié)果，初步斷定黃芪多糖的免疫調(diào)控效應(yīng)與內(nèi)毒素耐受基本一致，可通過調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫活性狀態(tài)，改善腸道黏膜免疫功能，并可有效拮抗腸道炎癥，優(yōu)化動物的腸道黏膜組織形態(tài)和健康狀況，改善其飼料利用率和生長狀況。

3 黃芪多糖與腸道黏膜免疫穩(wěn)態(tài)

3.1 腸道黏膜免疫穩(wěn)態(tài) 黏膜免疫系統(tǒng)是動物防御外源病原侵染的第一道防線，廣泛分布于腸道、肺部、尿道及外分泌腺等的黏膜部位，是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分[39]。而定植于宿主黏膜，尤其是腸道黏膜上的共生菌與機體免疫系統(tǒng)持續(xù)“接觸”，產(chǎn)生長期穩(wěn)定互作，不同于對病原菌的高度 “警戒”，腸道黏膜免疫系統(tǒng)對共生菌更多的是被動“耐受”，以利于維持動物的免疫穩(wěn)態(tài)[40]?？傊?，腸道黏膜免疫系統(tǒng)是維持腸道菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)[41]。與此同時，腸道菌群也可影響腸道免疫活性，腸道微生物區(qū)系在調(diào)節(jié)腸道屏障功能、維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)、抑制腸道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而腸道菌群失衡往往意味著病原侵染和腸道炎癥問題[42-43]。

免疫系統(tǒng)依賴于免疫相關(guān)模式識別受體來識別侵染病原和內(nèi)源性抗原分子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)狀態(tài)[44]。腸道黏膜免疫系統(tǒng)包括腸道淋巴組織、免疫細胞及腸上皮細胞等，均可參與識別腸道中的病原相關(guān)分子（Pathogenassociated Molecular Pattern，PAMP），并影響腸道屏障功能、免疫穩(wěn)態(tài)和宿主健康狀況[45-46]。而影響腸道健康狀態(tài)的因素很多，其中腸道營養(yǎng)組成是腸道微生物菌群和黏膜免疫調(diào)控的關(guān)鍵性因子[47-48]，向食物中添加益生菌和益生元可通過調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)或直接影響?zhàn)つっ庖叻磻?yīng)活性，從而影響腸道黏膜免疫功能[41]。黃芪多糖作為一種非營養(yǎng)性免疫調(diào)控因子，亦可通過其構(gòu)效調(diào)控效應(yīng)直接改善腸道黏膜免疫狀態(tài)[35]，有利于腸道黏膜免疫穩(wěn)態(tài)的維持。

3.2 黃芪多糖對腸道黏膜免疫的改善效應(yīng) 黃芪多糖對腸道黏膜免疫的優(yōu)化作用主要表現(xiàn)在2 個方面：第一是黃芪多糖對腸道黏膜免疫的直接優(yōu)化作用；第二，黃芪多糖可通過促進腸道上皮更新改善腸道黏膜形態(tài)，改善腸道屏障功能。

3.2.1 黃芪多糖對腸道免疫的影響 黃芪多糖誘導(dǎo)的內(nèi)毒素耐受樣免疫反應(yīng)具有抗炎和適度免疫激活的雙重調(diào)控作用，通過其免疫調(diào)控效應(yīng)，黃芪多糖經(jīng)機體攝入后可影響腸道免疫功能狀態(tài)。肉仔雞飼喂試驗結(jié)果顯示飼糧中添加黃芪多糖可顯著提高盲腸免疫球蛋白ΙgA、ΙgG、ΙgM 水平，提高其腸道體液免疫功能[49]。黃芪多糖還可通過其構(gòu)象調(diào)控效應(yīng)影響腸道微生物區(qū)系平衡、腸道相關(guān)淋巴組織的功能及腸道黏膜中巨噬細胞和淋巴細胞的免疫功能狀態(tài)，從而優(yōu)化腸道黏膜免疫功能[50-52]。這種免疫優(yōu)化效應(yīng)主要表現(xiàn)在黃芪多糖可顯著緩解病原菌入侵產(chǎn)生的傷害作用，黃芪多糖可有效抑制嗜水氣單胞菌[52]和沙門氏菌[54]感染導(dǎo)致的腸道炎癥和菌群失衡。

3.2.2 黃芪多糖對腸道黏膜形態(tài)的優(yōu)化作用 腸道上皮更新需依賴于一定免疫刺激[54]。黃芪多糖具有適度免疫激活效應(yīng)，可通過促進腸道黏膜更新優(yōu)化腸道黏膜組織形態(tài)[35]。Zhang 等[55]研究指出黃芪多糖可顯著提高腸上皮細胞分裂和分化相關(guān)的標記分子，如細胞角蛋白18（CK18）、堿性磷酸酶（ALP）、ZO-2、蔗糖酶-異麥芽糖酶及鳥氨酸脫羧酶（ODC）等的表達水平，從而顯著促進體外培養(yǎng)腸上皮細胞的增殖、遷移和分化；另外，黃芪多糖還可通過降低NF-κВ 活性、抑制促炎細胞因子合成[56-57]及誘導(dǎo)派伊爾結(jié)節(jié)Tregs 分化成熟[58]來抑制LPS 誘導(dǎo)的腸道炎性細胞毒性反應(yīng)，防止炎癥對腸道的組織損傷作用，從而改善腸道黏膜組織形態(tài)，這種腸道黏膜形態(tài)的優(yōu)化有利于促進腸道物理屏障的完整性和免疫“隔離”作用。

總之，黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫活性和改善腸道黏膜屏障功能優(yōu)化腸道黏膜免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)。

4 小 結(jié)

綜上，動物攝入黃芪多糖后可通過其構(gòu)效作用激活腸道黏膜免疫系統(tǒng)內(nèi)毒素耐受樣免疫反應(yīng)，改善腸道黏膜免疫功能，促進腸道上皮細胞更新，進而可優(yōu)化腸道黏膜組織形態(tài)和腸道健康狀況?；谄鋵δc道健康的調(diào)節(jié)作用，黃芪多糖在畜牧生產(chǎn)中具有很高利用價值，尤其在當(dāng)下無抗養(yǎng)殖的大背景下，采用黃芪多糖改善畜禽腸道免疫功能，是一種應(yīng)對畜禽免疫力低下的有效策略。