卵原干細胞的研究進展

李樹斌，劉 剛，戴雁峰

（內(nèi)蒙古大學 生命科學學院，呼和浩特 010020）

哺乳動物大多數(shù)組織中存在干細胞，干細胞因具有自我更新及分化潛能通常參與器官組織的修復和重建。哺乳動物的睪丸存在精原干細胞（spermatogenic stem cells，SSCs），精原干細胞源源不斷地分化形成精子，維持雄性哺乳動物一生的精子發(fā)生。幾十年來，傳統(tǒng)生殖生物學觀點認為哺乳動物一出生，其卵巢含有數(shù)量一定的原始卵泡，隨著卵巢的發(fā)育，卵母細胞經(jīng)歷排卵、凋亡，數(shù)量不斷減少直至消耗殆盡。然而，在2004年J.Johnson等［1］首次發(fā)現(xiàn)卵巢中存在有絲分裂活性的生殖干細胞，這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了長達半個世紀的雌性哺乳動物配子發(fā)生學說。2009年Zou K.等［2］利用抗原抗體特異反應篩選表達Ddx4蛋白細胞，從小鼠卵巢內(nèi)分離獲得了卵原干細胞（OSCs），這些細胞可以在體外持續(xù)增殖，表達生殖干細胞標志蛋白Ddx4、Oct4、Stella、Prdm1等，將體外培養(yǎng)的OSCs移植到免疫缺陷的雌性小鼠卵巢中，OSCs可在體內(nèi)卵巢分化形成卵母細胞，這一發(fā)現(xiàn)將OSCs的研究推向一個新階段。

1 卵子的產(chǎn)生

1.1 卵原細胞的產(chǎn)生

關于哺乳動物生殖細胞發(fā)生機制的研究主要集中于小鼠。小鼠的原始生殖細胞（primordial germ cells，PGCs）來源于上胚層（epiplast）細胞［3－4］。胚胎發(fā)育至6.5 dpc時，在上胚層細胞分泌的BMP4等生長因子的作用下，PGCs前體細胞由上胚層后部遷移至尿囊基底部［3－4］，在尿囊基底部分化形成PGCs，PGCs通過重編程，開始表達PGCs特異化的轉(zhuǎn)錄因子Prdm1和Prdm14［5－6］。當胚胎發(fā)育至10.5～11.5 dpc，PGCs通過后腸遷移至生殖嵴［7］。在這個遷移過程中，PGCs開始表達多能干細胞轉(zhuǎn)錄因子，基因組DNA去甲基化［5］，X染色體再次被激活，同時組蛋白的修飾也發(fā)生顯著變化。PGCs遷移到達生殖嵴后，PGCs開始下調(diào)多能干細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，PGCs逐漸分化形成胚胎生殖干細胞（embryonic germ cells，EGCs）［8］。

1.2 原始卵泡的形成

EGCs在生殖嵴內(nèi)通過有絲分裂進行有限的細胞增殖，通常增殖發(fā)生在胚胎發(fā)育的13.5～15.5 dpc，這些細胞在細胞分裂時發(fā)生不完全細胞分裂，細胞間通過橋狀結(jié)構相連接（intercellular bridge），由細胞間橋相連的細胞團聚合成簇，形成生殖細胞巢（germ cell nest）［9］。生殖細胞巢外面由卵巢索細胞包圍，生殖細胞巢內(nèi)的細胞稱之為卵原細胞［10］。生殖細胞巢內(nèi)細胞間可通過連接的橋狀結(jié)構進行大分子輸送［11］，使某些卵原細胞獲得發(fā)育的特權［12］，卵原細胞也可能通過間橋連接進行減數(shù)分裂細胞周期的同期化［13］。

在脊椎動物，形成生殖細胞巢是生殖細胞發(fā)生的普遍現(xiàn)象［13］。但是除了對果蠅生殖細胞巢的形成和破裂有較多的研究外，目前人們對哺乳動物生殖細胞巢的形成和功能了解甚少。最近的研究發(fā)現(xiàn)，生殖細胞通過Dazl調(diào)控Tex14 mRNA的翻譯，控制生殖細胞巢內(nèi)細胞間橋的斷裂［14］。Tex14是構成生殖巢細胞間橋的蛋白之一，在睪丸中Tex14 mRNA與Dazl蛋白共沉淀，Dazl通過與Tex14 mRNA的3′UTR結(jié)合，調(diào)控Tex14的翻譯。生殖細胞表達Dazl是獲得應答視黃酸（retinoic acid，RA）從而進入減數(shù)分裂的關鍵蛋白，抑制Dazl的表達可阻止生殖細胞進入減數(shù)分裂。因此，Dazl－Tex14將生殖細胞巢內(nèi)細胞間橋斷裂與減數(shù)分裂兩個不同細胞活動連接起來。生殖細胞巢內(nèi)細胞間橋斷裂是形成原始卵泡的先決條件。原始卵泡形成時發(fā)生三個不同的細胞生物學現(xiàn)象：（1）生殖巢內(nèi)細胞間橋斷裂。大約有2／3的卵原細胞通過凋亡／自嗜（apoptosis／autophage）死亡［15－16］，只有1／3的卵原細胞能夠與前體顆粒細胞形成原始卵泡［17］。（2）卵原細胞進入減數(shù)分裂，并停滯在減數(shù)分裂的前期，形成初級卵母細胞［18］。（3）生殖細胞巢外周的前體顆粒細胞侵入生殖細胞巢［10］，包圍一些優(yōu)勢卵原細胞，形成原始卵泡，阻止了卵母細胞退化，使初級卵母細胞的減數(shù)分裂停滯在減數(shù)分裂前期。

顆粒細胞前體細胞是分化形成卵泡顆粒細胞的前體細胞，在形成生殖細胞巢時顆粒細胞前體細胞位于生殖細胞巢外周［9］，當生殖細胞巢被激活、細胞間橋斷裂時，顆粒細胞前體細胞發(fā)生遷移，侵入生殖細胞巢。顆粒細胞前體細胞呈扁平狀，通常每個原始卵泡由10個左右扁平的前體細胞包圍。在小鼠出生前位于卵巢髓質(zhì)和皮質(zhì)的原始卵泡是由表達不同標記蛋白的顆粒細胞前體細胞構成［19］。髓質(zhì)的原始卵泡前體顆粒細胞來源于髓質(zhì)表達Foxl2基因［20］，而皮質(zhì)的原始卵泡是由表達Lgr5基因的顆粒細胞前體細胞構成，在形成原始卵泡時它們由近表皮內(nèi)遷至深皮質(zhì)部［21］。兩類不同部位和細胞組成的原始卵泡在卵泡發(fā)生時間和速度上不同［19，22－23］，絕大多數(shù)位于髓質(zhì)部的原始卵泡從出生就開始生長，而皮質(zhì)部卵泡發(fā)生開始于初情期前后，供應動物生殖周期所需要的全部卵泡［19，22］。

1.3 卵母細胞的減數(shù)分裂

視黃酸（RA）是誘導生殖細胞進入減數(shù)分裂的關鍵化學物質(zhì)［24］。RA通過誘導生殖細胞表達Stra8誘導生殖細胞進入減數(shù)分裂［25－27］。敲除Stra8基因，卵巢上的生殖細胞既不進行減數(shù)分裂，也不表達與減數(shù)分裂相關的基因［26，28］。在性別分化后PGC分化形成EGCs，開始表達Dazl［29］，Dazl蛋白是在生殖細胞特異表達的RNA結(jié)合蛋白［30］，敲除Dazl基因的小鼠EGCs細胞喪失產(chǎn)生配子的潛能。生殖細胞表達Dazl是RA誘導Stra8表達進行減數(shù)分裂的先決條件［29，31－33］。由此可見，Dazl是生殖細胞獲得減數(shù)分裂潛能的關鍵分子。DMRT1（doublesex and mab－3 related transcription factor）是參與減數(shù)分裂調(diào)節(jié)的一個基因［34］。在雄性和雌性生殖細胞中DMRT1表現(xiàn)不同的生物功能［35－36］，在DMRT1敲除的雌性小鼠生殖細胞中，Stra8的表達水平下降，卵巢上的卵泡數(shù)減少［36］。RA通過與細胞核內(nèi)的RA受體（RAR）結(jié)合發(fā)揮其生物學功能。在Stra8基因的啟動子有兩個潛在的RAREs結(jié)合域，RA可能與RAR／RXR異二聚體形成復合體，并與RAREs結(jié)合，直接調(diào)節(jié)Stra8的表達［37－38］。

2 OSCs

2.1 OSCs的發(fā)現(xiàn)

無脊椎動物（如果蠅）及低等脊椎動物（如魚、鳥）的卵巢中有OSCs，這些OSCs可以通過有絲分裂進行自我復制，同時周期性或不間斷地分化產(chǎn)生新的卵母細胞，維持體內(nèi)原始卵泡的數(shù)量。哺乳動物出生后，卵巢中原始卵泡的數(shù)量一定，隨著生殖周期的進行，卵巢中卵泡數(shù)量不斷減少，直至消耗完為止，而卵巢不再產(chǎn)生新的卵母細胞［39］。但是過去幾年，哺乳動物卵原干細胞研究挑戰(zhàn)了這個傳統(tǒng)生殖生物學觀點。

2004年J.Johnson等［1］對小鼠卵巢中是否存在OSCs進行研究并得出以下三點結(jié)論：（1）雌性小鼠在產(chǎn)后16～40 d內(nèi)原始卵泡共減少了294個。M.J.Faddy等［40］的研究表明，在產(chǎn)后14～42 d原始卵泡庫由于卵泡閉鎖及生長激活，到初級卵泡階段每天平均應減少89個原始卵泡。據(jù)此推算在J.Johnson等［1］的研究中，產(chǎn)后16～40 d期間原始卵泡共應減少2 136個。但這與J.Johnson等［1］的試驗結(jié)果差異較大。因此，推測在小鼠卵巢中存在某種干細胞，它會分化形成卵母細胞用以補充原始卵泡庫。（2）在青年及成年雌性小鼠卵巢中具有同時表達Brdu及Ddx4的細胞，證明卵巢中存在具有有絲分裂活性的生殖細胞。（3）將帶有GFP標記的小鼠卵巢組織切半后移植到切掉一半卵巢組織的GFP陰性SCID小鼠卵巢包膜內(nèi)，4周后發(fā)現(xiàn)，部分GFP陽性卵巢組織及部分GFP陰性卵巢組織中均可發(fā)現(xiàn)由GFP標記的卵母細胞、不帶GFP標記的顆粒細胞包裹形成的重組卵泡，以及由不帶GFP標記的卵母細胞與帶有GFP標記的顆粒細胞組合形成的重組卵泡。該結(jié)果進一步說明小鼠卵巢中具有可遷移的生殖細胞且可支持卵泡發(fā)生。根據(jù)以上三點，推測小鼠卵巢中存在既可以進行有絲分裂又可以分化形成卵子的細胞，該研究引發(fā)了生殖生物學領域?qū)τ诖菩圆溉閯游锫殉仓惺欠窬哂蠴SCs的研究熱潮。

2005年，J.Johnson等［41］研究發(fā)現(xiàn)了在小鼠骨髓外周血細胞表達生殖細胞的標志蛋白，將帶有GFP標記的骨髓外周血細胞通過尾靜脈注射到SCID小鼠體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)在受體小鼠的卵巢中存在帶有GFP標記的卵母細胞生成。推測在骨髓外周血中存在具有分化形成卵母細胞能力的干細胞。但這個結(jié)論在2006年遭到一些學者的質(zhì)疑，通過外科手術將GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的脈管系統(tǒng)相連，制備并聯(lián)體小鼠，小鼠并聯(lián)一段時間后觀察卵子發(fā)生，結(jié)果表明，帶有GFP標記的骨髓細胞或其他血液循環(huán)細胞可以進入野生型小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)；但是野生型小鼠的卵巢中卻沒有GFP標記的卵母細胞。這說明骨髓外周血中的細胞并不能夠分化形成卵母細胞［42］。但骨髓造血干細胞確實有助于卵巢功能的恢復。研究表明，患有范科尼貧血癥的婦女在進行了骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）后成功懷孕［43－44］。但研究者并未檢測到由供體骨髓細胞形成的生殖細胞。因此推測，BMT可以促進由不完全卵泡耗竭引起的卵巢功能衰竭后卵巢功能的恢復，但骨髓外周血中的細胞并不能轉(zhuǎn)化為卵母細胞。

2009年，Zou K.等［2］利用羧基端Ddx4蛋白抗體進行磁珠分選（magnetic cell sorting，MACS），首次從出生5 d后的小鼠卵巢中分離獲得OSCs，在體外長期培養(yǎng)后OSCs始終表達生殖干細胞標志基因Oct4、Ddx4、Ifitm3（Fragillis）、Dppa3、Rex1、Dazl和Blimp－1等；將長期培養(yǎng)后的OSCs注射到小鼠卵巢，可以得到由該細胞系產(chǎn)生的健康子代小鼠。

研究表明，使用熒光激活分選（Fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）方法從處于育齡階段的女性卵巢中分離得到了Ddx4陽性的細胞，該細胞經(jīng)過長期培養(yǎng)可在體外建系，將該細胞與人卵巢上皮共同注射移植到SCID小鼠卵巢中，可在受體小鼠卵巢中檢測到由該細胞分化形成的卵母細胞［45］。

2.2 OSCs的研究爭議

關于OSCs的研究仍在許多爭議，這些爭議主要集中在以下幾個方面。

2.2.1 使用Ddx4蛋白抗體分選OSCs的有效性

目前在大多數(shù)研究中使用的用于分離、純化OSCs的特異蛋白Ddx4是已知的在細胞質(zhì)內(nèi)表達的蛋白。Ddx4是生殖細胞特異性表達的RNA解旋酶，含有一個DEADc ATP水解結(jié)構域和一個HELICc RNA結(jié)合結(jié)構域，這是所有DEAD盒蛋白家族成員的共同特征［46］。而RNA結(jié)合蛋白是胞質(zhì)蛋白，不是膜結(jié)合蛋白。2012年，Zhang H.等［47］研究了卵巢Ddx4陽性細胞在體內(nèi)外的增殖分化情況，活體成像監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在72 h內(nèi)小鼠睪丸中Ddx4陽性細胞平均分裂3次，而在卵巢中并沒有監(jiān)測到Ddx4陽性細胞的分裂。同時利用Zou K.等［2］報道的體外培養(yǎng)條件培養(yǎng)Ddx4陽性細胞，培養(yǎng)數(shù)天后陽性細胞死亡；在培養(yǎng)Ddx4陰性的卵巢細胞時，可形成類似于人OSCs體外培養(yǎng)形成的扁平狀細胞克隆，該克隆可傳代到10代以上，但是這些細胞并不表達Sox2、Oct4、Dppa3及Ddx4等基因；將其移植回受體小鼠的卵巢內(nèi)，也不能分化成卵母細胞。因此Ddx4作為分選OSCs抗體的有效性有待進一步探索。

雖然Zou K.等［48］進一步篩選了三個用于分離OSCs的特異蛋白，包括黏附分子STPB－C（shorttype pituitary gland and brain－cadherin，STPBC）、用于純化SSCs的膜蛋白CD90以及干擾素誘導跨膜蛋白3（interferon inducible transmembrane proteins 3，Ifitm3，也稱為Fragilis），發(fā)現(xiàn)使用Ifitm3抗體來分選純化OSCs的效率比使用Ddx4抗體更高。但是Ifitm3在小鼠中多個組織、器官中均有表達，在肝臟中表達量最高，在睪丸中表達量較低，并不是生殖細胞特異性標志蛋白，而且Ifitm3在卵巢體細胞中也有表達，因此并不能特異性篩選OSCs。

2.2.2 卵巢中并沒有干細胞可以補充原始卵泡庫

2014年，Zhang H.等［49］利用Gdf9－Cre×iDTR、Sohlh1－CreERT2×R26R轉(zhuǎn)基因小鼠模型追蹤卵子再生的過程，結(jié)果表明卵巢中并沒有OSCs可補充卵泡庫。Gdf9是卵母細胞特異性標志蛋白，在卵母細胞發(fā)育的所有階段均有表達。研究表明Gdf9在小鼠OSCs中并不表達，因此其表達與否可以區(qū)分OSCs與卵母細胞。當用白喉毒素（diphtheria toxin，DT）處理后，Gdf9－Cre介導卵母細胞中DT受體（diphtheria toxin receptor，DTR）的表達，導致卵母細胞死亡。在DT處理2周后，可以觀察到Gdf9－Cre×iDTR小鼠卵巢中的卵母細胞完全消失。DT處理2個月后，與對照組iDTR小鼠的卵巢相比，Gdf9－Cre×iDTR小鼠卵巢明顯變小，并且沒有任何卵母細胞或卵泡再生現(xiàn)象。將觀察時間延長至DT處理后6個月和12個月后，均沒有發(fā)現(xiàn)Gdf9－Cre×iDTR小鼠卵巢中有卵母細胞或卵泡再生。因此得出結(jié)論：給予DT處理之前小鼠卵巢中存在的初始卵泡庫是小鼠卵巢中生殖細胞的唯一來源。

Sohlh1僅在減數(shù)分裂阻滯的未成熟卵母細胞中激活表達。將Sohlh1－CreERT2小鼠與Rosa26報告基因小鼠（R26R）雜交，產(chǎn)生子代小鼠Sohlh1－CreERT2×R26R，通過向Sohlh1－Cre-ERT2×R26R小鼠注射他莫昔芬（Tamoxifen）可選擇性地標記表達Sohlh1的未成熟卵母細胞。在小鼠產(chǎn)后28天注射Tamoxifen，在第35天觀察到小鼠卵巢中表達Sohlh1的未成熟卵母細胞可被β－半乳糖苷酶染成藍色。作為對照，在妊娠8.5～12.5 dpc這一PGCs形成階段給孕鼠注射Tamoxifen，在產(chǎn)后2個月子代小鼠卵巢中并沒有β－半乳糖苷酶染成藍色的卵母細胞。這證明Sohlh1－CreERT2×R26R小鼠模型僅特異性地標記已進入減數(shù)分裂的未成熟卵母細胞，卻并不能標記更早期的PGCs或與之處于相似分化程度的OSCs。因此，如果卵巢中存在OSCs可以補充原始卵泡庫，那卵巢中標記的卵母細胞與未被標記的卵母細胞比例應降低。但在該試驗中給產(chǎn)后28天小鼠注射Tamoxifen，在2個月及8個月分別取出小鼠左側(cè)卵巢及右側(cè)卵巢，結(jié)果表明：在2個月時一些標記的卵母細胞被激活并發(fā)育為次級卵母細胞，標記的卵母細胞占總數(shù)的百分比為（37.41±5.37）%；在8個月時收集右側(cè)卵巢，標記的卵母細胞占總數(shù)的百分比為（37.74±6.55）%，并沒有顯著減少。這說明小鼠2～8月齡期間并無任何新生的卵母細胞補充卵泡庫，小鼠卵巢在出生后即有一個穩(wěn)定的卵泡庫，支持一生的卵母細胞發(fā)育。

2.2.3 OSCs的來源仍未確定 關于OSCs來源于何種細胞，目前主要有以下三種觀點：（1）OSCs來源于骨髓外周血循環(huán)中的某些干細胞。如前所述，大量關于BMT移植回受體小鼠卵巢的試驗證明，骨髓外周血的細胞并不能分化形成卵母細胞，因此這一觀點已被否定［42］。（2）OSCs來源于卵巢表面上皮（ovary suerface epithelium，OSE）中的極小胚胎樣干細胞（very small embryonic－like，VSEL）。覆蓋在卵巢表面的OSE細胞由單層立方或扁平上皮細胞組成。研究發(fā)現(xiàn)，在OSE中存在OSCs及VSEL兩類干細胞，這兩類細胞主要差異在于細胞直徑及Oct4的表達，VSEL相對靜止，大小為3～5μm，Oct4核表達；而OSCs的大小超過8μm，Oct4質(zhì)表達，具有有絲分裂活性。核表達Oct4對于干細胞處于多能狀態(tài)至關重要。因此推測VSEL是卵巢中最原始的干細胞，在卵巢受到某種刺激后VSEL可分化形成OSCs［50－51］。（3）OSCs來源于少量具有干細胞特征的PGCs衍生未分化細胞，這些細胞可以保留在出生后的卵巢中，在某些情況下可能恢復減數(shù)分裂和分化產(chǎn)生卵子［52］。哺乳動物的精子發(fā)生及卵子發(fā)生都起源于PGCs，并且部分PGCs經(jīng)特殊的培養(yǎng)條件培養(yǎng)后具有類似多能干細胞的特性。產(chǎn)前小鼠卵巢中存在未進入減數(shù)分裂的PGCs，細胞數(shù)目較多，占生殖細胞總數(shù)的10%；在產(chǎn)后PGCs可進行有絲分裂，激活卵巢，因此推測OSCs來源于少量未分化的PGCs［52］。并且在整個胚胎發(fā)育階段，PGCs分化形成卵母細胞的過程經(jīng)歷了復雜的全基因組重編程，該過程需要與卵巢的體細胞相互作用。因此，如果OSCs來源于卵巢中其他的體細胞，則需要在成年卵巢環(huán)境中經(jīng)歷在胚胎發(fā)育過程中建立的生殖系細胞所需的基因及表觀遺傳的改變，并產(chǎn)生具有正確染色質(zhì)表觀遺傳狀態(tài)的卵母細胞，特別是與全能性和印記基因相關的表觀遺傳狀態(tài)，然而這一過程是非常難實現(xiàn)的，因此推測OSCs不可能來源于生殖系以外的其他細胞。

2.3 OSCs的特征

OSCs存在于卵巢表面上皮中，其細胞形態(tài)及生長模式與SSCs較為相似，細胞直徑為8～10μm，核質(zhì)比較高。OSCs在體外培養(yǎng)形成串狀克隆，類似于PGCs在體外培養(yǎng)時形成的克隆，串狀的OSCs分裂后其細胞膜相連，在連接處表達E－cadherin蛋白（也稱為Cdh1），該蛋白參與形成串狀OSCs克隆的黏著連接［53］。關于果蠅OSCs的研究表明，雌性生殖細胞所必需的E－cadherin蛋白是維持細胞間相互作用和形成細胞微環(huán)境所必需的蛋白。在小鼠PGCs體外培養(yǎng)過程中，抑制E－cadherin蛋白的表達會影響PGCs之間聚集，在培養(yǎng)iPSCs時抑制E－cadherin蛋白的表達會使形成的細胞克隆解離。OSCs倍增時間約為22 h，增殖較慢；OSCs表達Ddx4、Oct4、Dazl、Blimp－1、Dppa3等生殖細胞及干細胞標志蛋白，但不表達Sox2、Nanog這兩個多能性相關蛋白及卵母細胞減數(shù)分裂相關蛋白（如Gdf9、Sycp3、Zp3等）［54］。OSCs具有很高的端粒酶活性及堿性磷酸酶陽性，其堿性磷酸酶表達水平與SSCs相似，但比ESCs表達水平低。OSCs注射到SCID小鼠皮下后并不能形成畸胎瘤，也沒有三胚層的分化。將OSCs注射到卵巢，可分化形成功能性卵子并產(chǎn)生健康子代，代表OSCs是一種單能干細胞，僅可分化形成卵子［45，54］。在小鼠及人的OSCs體外培養(yǎng)過程中，可自發(fā)分化形成卵母細胞樣細胞。體外培養(yǎng)過程中根據(jù)DNA倍性分析可以檢測到有單倍體細胞的產(chǎn)生［45］，這種自發(fā)分化產(chǎn)生的在形態(tài)上類似于卵母細胞的樣細胞表達減數(shù)分裂相關基因（包括Sycp3、Dmc1、Nobox、Ybx2等）及卵母細胞透明帶標志蛋白Zp3。

此外，通過基因芯片分析OSCs與SSCs的全基因表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OSCs與SSCs在基因表達水平上具有很高的相似性。去除管家基因后，在OSCs高表達的1 273個基因以及在SSCs高表達的1 193個基因中，共有853個基因是兩種生殖干細胞共同高表達的。這些共同高表達基因主要包括生殖干細胞標志基因（如Ddx4、Dazl和Oct4）及PGCs發(fā)育相關基因（如Tdrkh、Akt3、Gm1673、Hba－a1、Mov10l1、Fkbp6等）［55］。對ESCs、PGCs以及OSCs進行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA－Seq）分析，結(jié)果表明，Nanog和Sox2在ESCs中特異性表達，而Ifitm3、Ptx3、GM1673在OSCs中表達［56－57］。

為了了解OSCs如何維持其單能性，對OSCs進行RNA－Seq分析，發(fā)現(xiàn)Prmt5在OSCs中高表達［56］。細胞免疫熒光染色試驗結(jié)果表明，Prmt5主要在OSCs的細胞質(zhì)中表達，將OSCs中的Prmt5基因敲減后，發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂相關基因（包括Sycp3和Sycp1）及卵子發(fā)育相關基因（包括Zp2和Zp3）上調(diào)。為了進一步了解Prmt5對OSCs基因表達的影響，對使用Prmt5敲減后的OSCs進行了RNA－Seq分析，與對照組相比，Prmt5敲減后OSCs中2 916個基因被上調(diào)，GO富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因主要富集在與減數(shù)分裂相關的過程及一些與發(fā)育相關的生物學過程。這些研究表明，Prmt5參與了OSCs未分化狀態(tài)的維持，其作用機制可能是通過抑制減數(shù)分裂和體細胞過程來維持OSCs干性［56］。在OSCs、ESCs兩類干細胞具有相同的抑制分化機制。Prmt5與Mep50結(jié)合促進胞質(zhì)組蛋白H2A（H2AR3me2s）甲基化，從而抑制ESCs的分化［58］，同樣Prmt5與Mep50結(jié)合形成復合物在OSCs中也發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄作用。除Prmt5外，還發(fā)現(xiàn)Max可抑制ESCs中減數(shù)分裂相關基因及其表達水平，同樣當Max在OSCs中被敲減后一些減數(shù)分裂相關基因的表達被顯著上調(diào)［59］。這些結(jié)果表明OSCs和ESCs具有某些相同的抑制分化機制。

2.4 OSCs的增殖調(diào)控

OSCs是存在于OSE中的一類稀有的干細胞，具有挽救因卵泡衰竭引起的女性不育的潛力。最近關于調(diào)控OSCs增殖的研究日益增多。

鈣黏著蛋白在生殖細胞和干細胞中均有表達，并參與細胞黏附和信號轉(zhuǎn)導等功能［60］。作為鈣黏著蛋白超家族的成員之一，Cadherin－22最早發(fā)現(xiàn)于大鼠的垂體和大腦，具有兩種剪接異構體長型和短型。長型Cadherin－22的胞質(zhì)部分包含β－連環(huán)蛋白（β－catenin）結(jié)合結(jié)構域，而短型則缺乏該結(jié)構域［61］。小鼠卵巢中各階段的生殖細胞包括OSCs均表達Cadherin－22［62］。已有的研究證明，短型Cadherin－22可通過JAK－STAT、PI3KAKT和TGF－β信號通路來促進大鼠SSCs存活及增殖［62－63］。Cadherin－22與PI3K相互作用后對AKT3進行磷酸化，可以增強細胞周期蛋白家族成員N－myc在OSCs中的表達水平，促進OSCs自我更新。

此外，作為TGF－β家族的成員，GDNF被認為是促進SSCs自我更新的關鍵因子。研究表明，GDNF對于OSCs自我更新也具有重要作用，GDNF與OSCs表面受體GFRα1結(jié)合，通過PI3K或酪氨酸家族激酶（SFK）激活AKT3，并且SFK也可上調(diào)其目標基因Bcl6b、Etv5、Lhx1，促進OSCs的自我更新［64］。研究表明，AKT3對于SSCs的增殖也至關重要［65］。AKT是一個多功能因子，參與了多個信號通路的調(diào)節(jié)，參與調(diào)節(jié)細胞不同的生物學功能，例如細胞增殖和細胞存活等，對于SSCs的增殖調(diào)節(jié)也具有關鍵作用。PIK－AKT－mTOR信號通路在維持SSCs自我更新上起到關鍵作用，PI3K由一個調(diào)節(jié)亞基p85和一個催化亞基p110組成，PI3K激活后，質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3與細胞內(nèi)含有PH結(jié)構域的信號蛋白AKT和PDK1結(jié)合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308，使AKT活化［66］。AKT磷酸化TSC1／2，可阻止其對小G蛋白Rheb（ras homology enriched in brain）的負調(diào)控，一方面使Rheb富集，另一方面活化對納巴霉素（rapamycin）敏感的mTOR復合體（mammalian target of rapamycin，mTORC1）［67］。AKT也可以對GSK3β進行磷酸化，磷酸化后GSK3β失去活性，可以促進葡萄糖的代謝以及調(diào)節(jié)細胞周期。

2012年Hu Y.等［68］從新生和成年小鼠卵巢中分離了OSCs，并將其培養(yǎng)在ESCs的培養(yǎng)液中，結(jié)果表明，添加LIF和GSK3抑制劑BIO有利于OSCs形成類似于ESCs的Dome狀克隆，BIO通過激活β－catenin和上調(diào)E－cadherin促進OSCs的增殖，并促進OSCs表達干細胞標志基因（如Oct4、Klf4、C－myc、Nanog、CD49f、Sox2、CD133、SSEA1和SSEA4）。

2.5 OSCs體外分化形成卵母細胞的研究

研究OSCs體外分化形成卵母細胞，對于生殖醫(yī)學治療因女性卵巢卵泡衰竭引起的不孕癥具有巨大的臨床應用價值。國內(nèi)外的研究團隊近年來致力于將小鼠或人的OSCs在體外分化形成功能性卵母細胞，進行了OSCs體外分化形成卵母細胞體系的比較。2018年，Zou K.等［69］比較了五種將OSCs分化形成卵母細胞的體系，將OSCs分化形成卵母細胞的第一步是誘導其進入減數(shù)分裂，在12.5 dpc的胚胎中。RA可誘導PGCs進入減數(shù)分裂。Zou K.等［69］將OSCs培養(yǎng)于添加RA的培養(yǎng)液（去除LIF）中，數(shù)天后觀察到一些圓形細胞直徑增長至25～40μm。隨后將其培養(yǎng)在鋪有一層顆粒細胞的微滴中，添加雌二醇、孕酮繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素的添加有助于OSCs分化，最終形成形態(tài)上類似于GV期卵母細胞的樣細胞，但繼續(xù)培養(yǎng)后這些類卵母細胞樣細胞并不能發(fā)育至MⅡ期。

2.6 OSCs的研究意義

近年來，有大量證據(jù)支持在包括小鼠、人類等各種哺乳動物的產(chǎn)后卵巢中存在具有有絲分裂活性的生殖細胞，這使得利用一種天然的具有生殖細胞命運的成體干細胞在體外分化形成功能性配子成為可能。目前的研究經(jīng)過各種鑒定方式證實了OSCs在卵巢中的功能，包括體內(nèi)移植試驗成功獲得配子以及人類OSCs分化形成卵母細胞樣細胞的最新研究。這些研究使人們對雌性生殖生物學進行重新認識，并進一步探索OSCs對女性生育力保護的潛在應用價值。