哺乳動(dòng)物植入前胚胎中細(xì)胞譜系分化的調(diào)控機(jī)制

孫克佳，李悅欣，高 旭，田樹軍，2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000）

哺乳動(dòng)物胚胎在植入子宮前先后經(jīng)歷了兩次形態(tài)學(xué)上的變化。第一次形態(tài)學(xué)變化，人、豬和小鼠發(fā)生在8－細(xì)胞期，牛羊發(fā)生在32－細(xì)胞期，胚胎中各個(gè)卵裂球之間開始緊密接觸，細(xì)胞間的界限變得模糊，這一過程稱為胚胎致密化，這時(shí)的胚胎稱為桑葚胚。隨后胚胎細(xì)胞間開始聚積一些液體，逐漸在特定位置形成一個(gè)液體腔，稱為囊胚腔，此時(shí)胚胎發(fā)育為囊胚。卵裂球在這一階段分化為兩種細(xì)胞，一種位于囊胚內(nèi)側(cè)，稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞（inner cellmass，ICM）；另一種位于囊胚外側(cè)，包裹著內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與囊胚腔，稱為滋養(yǎng)層細(xì)胞（trophectoderm，TE）。此時(shí)胚胎細(xì)胞完成了第二次形態(tài)學(xué)變化，也完成了第一次譜系分化。之后ICM逐漸分化為原始內(nèi)胚層和上胚層［1］。

關(guān)于卵裂球是如何分化為ICM和TE的，前人以小鼠為模型提出了兩種經(jīng)典的模型，A.K.Tarkowski等［2］提出了嵌合模型，該模型指出卵裂球位置環(huán)境的不同導(dǎo)致其分化命運(yùn)的不同，外層卵裂球分化為TE，內(nèi)部卵裂球分化為ICM。另一種模型是M.H.Johnson等［3］提出的極性模型，指出8－細(xì)胞卵裂球的極化決定了細(xì)胞譜系分化的命運(yùn)。細(xì)胞極化開始時(shí)胞內(nèi)外物質(zhì)不均勻分布在細(xì)胞頂端膜與基底膜，此時(shí)卵裂球由一個(gè)完全均勻的球體轉(zhuǎn)變?yōu)闃O化的球體。在隨后的分裂過程中，由于分裂軸的不同，致使胚胎卵裂球分裂為兩個(gè)皆含頂端膜與基底膜的極化的卵裂球或一個(gè)含頂端膜與部分基底膜的極化的卵裂球和一個(gè)只含有基底膜的均勻卵裂球［4］，極化的卵裂球分布在胚胎外側(cè)，均勻非極化的卵裂球逐步占據(jù)胚胎內(nèi)側(cè)。隨后，外部的極性卵裂球之間形成了緊密連接、黏附連接、橋粒以及縫隙連接［5］，內(nèi)部卵裂球之間形成了縫隙連接。形成一個(gè)緊密的桑椹胚，之后內(nèi)部卵裂球形成ICM，外部卵裂球分化成為TE［6］。本文將闡述胚胎細(xì)胞譜系分化的調(diào)節(jié)機(jī)制，并重點(diǎn)討論極性蛋白、相關(guān)信號通路和轉(zhuǎn)錄因子對胚胎細(xì)胞譜系分化的影響。

1 轉(zhuǎn)錄因子對胚胎細(xì)胞譜系分化的影響

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）是動(dòng)物細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其中一些被確定為哺乳動(dòng)物胚胎形成TE與ICM的特異性因子［7］，包括尾型同源盒基因轉(zhuǎn)錄因子－2（caudal－related homeobox transcription factor 2，Cdx2）、GATA結(jié)合蛋白－3（GATA binding protein3，Gata3）、八聚體轉(zhuǎn)錄因子4（octamer－binding transcription factor 4，Oct4）、Sry相關(guān)HMG盒2（Sry－relabed HMG box probein 2，Sox2）和Nanog同源框（Nanog homeobox，Nanog）。

1.1 胚胎發(fā)育過程不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

在小鼠胚胎中，Cdx2、Gata3是TE的特異轉(zhuǎn)錄因子；Oct4、Sox2和Nanog為ICM 的特異轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)Cdx2與Gata3在8－細(xì)胞的部分卵裂球中表達(dá)，并逐漸向外部細(xì)胞聚集，最終只在囊胚的TE中表達(dá)。Oct4和Sox2在早期卵裂的各個(gè)階段均有表達(dá)，但在囊胚形成后僅限于在ICM中表達(dá)。Nanog基因在桑椹胚中首次檢測到表達(dá)，后維持在ICM中表達(dá)，TE中表達(dá)量下降［7－8］。此外，研究發(fā)現(xiàn)Oct4和Cdx2的表達(dá)存在頡頏作用，Cdx2可結(jié)合到Oct4基因的啟動(dòng)子區(qū)并抑制其轉(zhuǎn)錄［9］。同樣Oct4可以結(jié)合到Cdx2的啟動(dòng)子區(qū)，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄阻滯［10］。

在豬胚胎，Sox2在ICM 中特異性表達(dá)，Cdx2在TE中特異性表達(dá)；而Oct4在TE、ICM中廣泛表達(dá)，沒有特異性。說明在豬胚胎中，TE中的Cdx2不能有效抑制Oct4的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Sox2與Cdx2在ICM和TE中表現(xiàn)互斥的表達(dá)模式，表明Sox2和Cdx2是豬早期胚胎的特異標(biāo)記因子，在ICM與TE的分化中起到了關(guān)鍵的作用［11］。

在牛胚胎，Cdx2和Oct4在囊胚的ICM和TE中均有表達(dá)。其中Cdx2的mRNA在2－細(xì)胞、8－細(xì)胞期表達(dá)量較低，在桑葚胚和囊胚階段逐漸上調(diào)，而Oct4在各階段的表達(dá)量沒有明顯變化。進(jìn)一步的研究表明，Cdx2不能與Oct4基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并抑制Oct4的表達(dá)，從而使Oct4在TE中表達(dá)［12］。

1.2 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在TE和ICM形成中的作用

在小鼠胚胎中，敲除胚胎中Cdx2基因后，致密化、細(xì)胞極化、囊胚腔以及ICM可以正常形成，但胚胎不能形成成熟的TE，導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯［13］，表明Cdx2對于維持TE是必需的。通過RNAi干擾Gata3表達(dá)會(huì)導(dǎo)致囊胚的形成受阻滯［14］。在胚胎干細(xì)胞中，敲除Oct4的基因?qū)е翴CM分化為TE細(xì)胞［15］。Nanog作為Otc4的一個(gè)靶基因，被敲除后的小鼠可以形成正常的囊胚，但之后的胚外組織發(fā)育異常［16］。在牛中，降低Cdx2的表達(dá)水平不會(huì)影響囊胚發(fā)育率，但是會(huì)顯著提高TEA轉(zhuǎn)錄因子4（TEA domain transcription factor 4，Tead4）的表達(dá)。Tead4在小鼠中通過Hippo型號通路調(diào)節(jié)Cdx2基因轉(zhuǎn)錄，不過Tead4與Cdx2在牛胚胎中的關(guān)系還需進(jìn)一步研究［12］。

2 極性蛋白對細(xì)胞分化的影響

細(xì)胞極性影響胚胎細(xì)胞的命運(yùn)。在胚胎發(fā)育過程中，極性不同的卵裂球有著不同的分化命運(yùn)，內(nèi)部非極性的卵裂球分化形成ICM，外部極性的卵裂球形成TE。而細(xì)胞的極性與極性蛋白的表達(dá)定位有關(guān)，因此研究極性蛋白的定位表達(dá)和相互作用是解釋TE、ICM譜系分化的關(guān)鍵。

2.1 aPKC－PAR極性蛋白復(fù)合體

頂端極性蛋白／區(qū)域缺陷組件復(fù)合物（apical polarity protein／partitioning defective component，aPKC－PAR）是參與極性化作用的蛋白復(fù)合體之一，由區(qū)域性缺陷同系物3（partitioning defective 3 homologue，Pard3）、區(qū)域性缺陷同系物6（partitioning defective 6 homologue，Pard6）、非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C，aPKC）及ELKL基序激酶1（ELKLmotif kinase 1，Emk1）組成［17］。研究發(fā)現(xiàn)，這些極性蛋白在胚胎中的分布隨胚胎細(xì)胞的分化而呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。在小鼠胚胎中，Pard6b和Emk1在2－細(xì)胞～8－細(xì)胞階段主要分布于細(xì)胞核，4細(xì)胞中的aPKC則主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞發(fā)生極化后，Pard6b和aPKC蛋白開始向細(xì)胞膜的頂端膜聚集，而Emk1則定位在基底膜區(qū)域。正是這種頂端－基底部的不對稱分布，促進(jìn)了細(xì)胞極化的形成［8］。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠胚胎中Pard6基因，會(huì)導(dǎo)致aPKC在細(xì)胞頂端的錯(cuò)誤定位，造成細(xì)胞極化異常、囊胚腔不能正常形成，并且致使滋養(yǎng)層標(biāo)志轉(zhuǎn)錄因子Cdx2的表達(dá)量較正常胚胎下降［18］。另一項(xiàng)研究表明，敲除Pard6后也會(huì)導(dǎo)致外部細(xì)胞中的血管泌素（Amot）定位紊亂，從而在外部細(xì)胞中激活Hippo信號，造成滋養(yǎng)層發(fā)育受損［19］。

2.2 CRB極性蛋白復(fù)合體

CRB極性蛋白復(fù)合體由crumbs蛋白質(zhì)同源物3（crumbs protein homolog，crb3）、Lin Seven相關(guān)的蛋白質(zhì)1（Proteins associated with lin seven 1，Pals1）和Pals1相關(guān)的緊密連接蛋白（pals1－associated tight junction protein，Patj）組成。在小鼠胚胎中，這些極性蛋白在胚胎發(fā)育過程中呈動(dòng)態(tài)分布，在8－細(xì)胞之前均勻分布在卵裂球中。當(dāng)致密化開始時(shí)CRB極性蛋白便出現(xiàn)不對稱分布，其中Crb3和Pals1向頂端膜聚集，而Patj主要定位于基底膜的黏附連接處［20］，這與PAR極性蛋白復(fù)合體在致密化前后的分布相似。表明這些蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞極性的形成。此外，該項(xiàng)研究也對CRB極性復(fù)合體蛋白的功能進(jìn)行了探討，在敲除Patj基因后發(fā)現(xiàn)，CRB極性蛋白復(fù)合體和帶狀封閉蛋白－1（zonuia occluden－1，ZO－1）定位紊亂，胚胎的頂端－基底部極性、細(xì)胞骨架以及黏附連接的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性被破壞，最終導(dǎo)致囊胚發(fā)育異常［20］。在降低Patj的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，Hippo信號通路中的Yes相關(guān)蛋白（Yes－associated protein，Yap）定位發(fā)生錯(cuò)亂，使外部細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄共激活因子Yap發(fā)生磷酸化，無法進(jìn)入細(xì)胞核與Tead4結(jié)合，Cdx2的表達(dá)受到抑制，最終導(dǎo)致TE無法形成。

綜上對于PAR極性蛋白復(fù)合體和CRB極性蛋白復(fù)合體的研究表明，兩者在植入前胚胎發(fā)育分化中分布較為相似，且通過調(diào)控Hippo信號通路影響胚胎滋養(yǎng)層的發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，在上皮細(xì)胞中PAR極性蛋白與CRB極性蛋白間存在著直接聯(lián)系［21］，這些蛋白質(zhì)復(fù)合物的定位是一個(gè)相互依賴的過程，Crb蛋白可以將Par6及其相關(guān)蛋白招募并穩(wěn)定到細(xì)胞頂端區(qū)域。然而，在植入前胚胎中PAR極性蛋白與CRB極性蛋白間的聯(lián)系尚不清楚。進(jìn)一步揭示PAR極性蛋白復(fù)合體與CRB極性蛋白復(fù)合體在空間定位以及調(diào)控Hippo信號通路之間的聯(lián)系是較有價(jià)值的。

3 影響胚胎早期分化的信號通路

3.1 Hippo通路

Hippo信號通路是由一系列激酶組成的級聯(lián)信號通路，通過抑制下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子Yap，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡及分化潛能等多種生物學(xué)行為［22］。

R.Yagi等［23］發(fā)現(xiàn)，在Hippo相關(guān)基因Tead4突變的小鼠胚胎中，Cdx2的表達(dá)明顯下調(diào)，且胚胎中的細(xì)胞大多分化為ICM，這說明Cdx2的正常表達(dá)需要Tead4。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中，Hippo處于激活狀態(tài)，Yap被磷酸化并與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白結(jié)合而滯留于細(xì)胞質(zhì)中，使Yap無法進(jìn)入細(xì)胞核與Tead4結(jié)合［24］。在外側(cè)的TE中，Hippo處于未激活狀態(tài)，未磷酸化的Yap進(jìn)入細(xì)胞核與Tead4結(jié)合，共調(diào)節(jié)cdx2等相關(guān)基因［25］。

在小鼠胚胎中，Hippo通路的激活與胚胎的極性化和細(xì)胞間的黏附連接密切相關(guān)［19］。在胚胎細(xì)胞極化的過程中，外層細(xì)胞出現(xiàn)頂部和基底部，頂部富含纖維狀肌動(dòng)蛋白（filamentous actin，F(xiàn)－actin）。而F－actin可以捕獲Hippo中的關(guān)鍵因子，導(dǎo)致其不能對Hippo信號通路中的果蠅Warts、Wts同源物（large tumor suppressor1／2，Lats1／2）分子進(jìn)行磷酸化，進(jìn)而不足以使下游效應(yīng)因子Yap磷酸化［26］。非磷酸化的Yap可以自由進(jìn)入細(xì)胞核與Tead4結(jié)合，驅(qū)動(dòng)滋養(yǎng)層中Cdx2和Gata3等基因表達(dá)等的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活。而內(nèi)部細(xì)胞是非極性的，沒有頂部與基底部之分。內(nèi)部細(xì)胞中大多數(shù)的Amot會(huì)與細(xì)胞黏附連接處的鈣調(diào)素蛋白（epithrllisl cadherin，E－cadherin）Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤?。╪eurofibromatosis type 2，NF2）等形成復(fù)合體。一旦復(fù)合體形成，Amot的第176位絲氨酸（S176）被磷酸化，進(jìn)而通過磷酸化果蠅Lats1／2激活Hippo信號通路［19］。在Hippo處于激活狀態(tài)時(shí)，Yap被磷酸化并滯留于細(xì)胞質(zhì)中，無法進(jìn)入細(xì)胞核與Tead4結(jié)合并啟動(dòng)Cdx2基因的表達(dá)［25］。由于Oct4與Cdx2間的表達(dá)存在相互抑制作用［9］，在Cdx2的表達(dá)量較低時(shí)Oct4的表達(dá)不再受到抑制，由此強(qiáng)化了內(nèi)部細(xì)胞向ICM分化。因此，正是因?yàn)榕咛ゼ?xì)胞極化導(dǎo)致Hippo信號通路的選擇性開啟，影響了胚胎細(xì)胞的譜系分化。

3.2 MAPK通路

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）是一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，可以被一系列細(xì)胞外信號或刺激激活。在哺乳動(dòng)物中，MAPK的亞族主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK1／2）、c－Jun氨基末端激酶（c－Jun N－terminal kinase，JNK）以及 p38 促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen－activatedproteinkinase，p38－MAPK）。MAPK信號傳導(dǎo)是以MAPKKK、MAPKK、MAPK三級激酶級聯(lián)的形式進(jìn)行，通過對一系列轉(zhuǎn)錄因子磷酸化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)節(jié)，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、分裂及分化調(diào)節(jié)［27］。

抑制小鼠胚胎中p38－MAPK通路，發(fā)現(xiàn)8－細(xì)胞～16－細(xì)胞胚胎形態(tài)異常，囊胚的擴(kuò)張和孵化減緩，細(xì)胞凋亡顯著增加［28］。此外p38－MAPK缺失會(huì)導(dǎo)致F－actin形成受阻［29］，而F－action是胚胎致密化以及細(xì)胞分裂過程中的重要蛋白［4］。因此，在抑制p38－MAPK的小鼠胚胎中，其異常發(fā)育可能是缺少肌動(dòng)蛋白導(dǎo)致的。除p38通路外，有研究發(fā)現(xiàn)抑制JNK通路也可以抑制小鼠胚胎發(fā)育［30］。不過在牛胚胎中，單獨(dú)抑制一條通路并不會(huì)影響胚胎發(fā)育［31］，要同時(shí)抑制p38－MAPK和MAPK／ERK信號才會(huì)出現(xiàn)與小鼠胚胎相似的發(fā)育阻滯。近期有研究提出不同的觀點(diǎn)，其在小鼠植入前胚胎中單獨(dú)抑制p38－MAPK、JNK以及MAPK／ERK通路皆不會(huì)阻斷囊胚發(fā)育，只有同時(shí)阻斷3條通路，囊胚才會(huì)出現(xiàn)發(fā)育異?，F(xiàn)象；同時(shí)檢測到TE相關(guān)的特異性調(diào)控因子Cdx2與Gata3的表達(dá)明顯下調(diào)，并且發(fā)育異常胚胎細(xì)胞骨架大部分呈彌散狀態(tài)，肌動(dòng)蛋白異常。推測是由于三條信號通路之間存在代償機(jī)制，單一信號通路的抑制對胚胎發(fā)育影響較小，未表現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異［32］。出現(xiàn)這種狀況，還可能與小鼠的批次、使用的藥品不同有關(guān)。此外，MAPK通路可以對細(xì)胞分裂造成不利影響。在抑制小鼠卵母細(xì)胞的MAPK通路后，卵母細(xì)胞出現(xiàn)紡錘體和微管組織異常，導(dǎo)致減數(shù)分裂失?。?3］。與卵母細(xì)胞相比，抑制胚胎中的MAPK信號通路后是否會(huì)出現(xiàn)類似卵母細(xì)胞分裂異常的狀況有待進(jìn)一步研究。

雖然現(xiàn)已證明MAPK信號通路對胚胎細(xì)胞譜系分化至關(guān)重要，但MAPK通路對植入前胚胎發(fā)育的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚；MAPK通路的激活是否也與極性蛋白和黏附連接相關(guān)，以及在通路的下游如何調(diào)控Cdx2與Gata3的表達(dá)，均值得進(jìn)一步探討；此外，MAPK通路在卵母細(xì)胞中通過調(diào)控紡錘體和微管組織的形成介導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂，而在哺乳動(dòng)物植入前胚胎發(fā)育過程中，MAPK通路異常是否會(huì)造成紡錘體形成異常、染色體錯(cuò)位等異常反應(yīng)并引起卵裂球分裂異常，有待進(jìn)一步研究。

4 展望

綜上所述，筆者在本文中探討了一些轉(zhuǎn)錄因子、信號通路和極性蛋白對植入前胚胎譜系分化的影響，通過揭示植入前胚胎細(xì)胞譜系分化的分子機(jī)制，將有助于了解體外胚胎發(fā)育異常的原因、多能干細(xì)胞的分化發(fā)育機(jī)制等相關(guān)技術(shù)。然而，目前仍有許多其他相關(guān)的通路、基因等具體機(jī)制研究的不是很透徹，有待進(jìn)一步探索。