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    哺乳動(dòng)物植入前胚胎中細(xì)胞譜系分化的調(diào)控機(jī)制

    2020-12-17 13:33:15孫克佳李悅欣田樹軍
    黑龍江動(dòng)物繁殖 2020年4期
    關(guān)鍵詞:卵裂囊胚極性

    孫克佳,李悅欣,高 旭,田樹軍,2*

    (1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,河北 保定 071000;2.河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心,河北 保定 071000)

    哺乳動(dòng)物胚胎在植入子宮前先后經(jīng)歷了兩次形態(tài)學(xué)上的變化。第一次形態(tài)學(xué)變化,人、豬和小鼠發(fā)生在8-細(xì)胞期,牛羊發(fā)生在32-細(xì)胞期,胚胎中各個(gè)卵裂球之間開始緊密接觸,細(xì)胞間的界限變得模糊,這一過程稱為胚胎致密化,這時(shí)的胚胎稱為桑葚胚。隨后胚胎細(xì)胞間開始聚積一些液體,逐漸在特定位置形成一個(gè)液體腔,稱為囊胚腔,此時(shí)胚胎發(fā)育為囊胚。卵裂球在這一階段分化為兩種細(xì)胞,一種位于囊胚內(nèi)側(cè),稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(inner cellmass,ICM);另一種位于囊胚外側(cè),包裹著內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與囊胚腔,稱為滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophectoderm,TE)。此時(shí)胚胎細(xì)胞完成了第二次形態(tài)學(xué)變化,也完成了第一次譜系分化。之后ICM逐漸分化為原始內(nèi)胚層和上胚層[1]。

    關(guān)于卵裂球是如何分化為ICM和TE的,前人以小鼠為模型提出了兩種經(jīng)典的模型,A.K.Tarkowski等[2]提出了嵌合模型,該模型指出卵裂球位置環(huán)境的不同導(dǎo)致其分化命運(yùn)的不同,外層卵裂球分化為TE,內(nèi)部卵裂球分化為ICM。另一種模型是M.H.Johnson等[3]提出的極性模型,指出8-細(xì)胞卵裂球的極化決定了細(xì)胞譜系分化的命運(yùn)。細(xì)胞極化開始時(shí)胞內(nèi)外物質(zhì)不均勻分布在細(xì)胞頂端膜與基底膜,此時(shí)卵裂球由一個(gè)完全均勻的球體轉(zhuǎn)變?yōu)闃O化的球體。在隨后的分裂過程中,由于分裂軸的不同,致使胚胎卵裂球分裂為兩個(gè)皆含頂端膜與基底膜的極化的卵裂球或一個(gè)含頂端膜與部分基底膜的極化的卵裂球和一個(gè)只含有基底膜的均勻卵裂球[4],極化的卵裂球分布在胚胎外側(cè),均勻非極化的卵裂球逐步占據(jù)胚胎內(nèi)側(cè)。隨后,外部的極性卵裂球之間形成了緊密連接、黏附連接、橋粒以及縫隙連接[5],內(nèi)部卵裂球之間形成了縫隙連接。形成一個(gè)緊密的桑椹胚,之后內(nèi)部卵裂球形成ICM,外部卵裂球分化成為TE[6]。本文將闡述胚胎細(xì)胞譜系分化的調(diào)節(jié)機(jī)制,并重點(diǎn)討論極性蛋白、相關(guān)信號通路和轉(zhuǎn)錄因子對胚胎細(xì)胞譜系分化的影響。

    1 轉(zhuǎn)錄因子對胚胎細(xì)胞譜系分化的影響

    轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TFs)是動(dòng)物細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,其中一些被確定為哺乳動(dòng)物胚胎形成TE與ICM的特異性因子[7],包括尾型同源盒基因轉(zhuǎn)錄因子-2(caudal-related homeobox transcription factor 2,Cdx2)、GATA結(jié)合蛋白-3(GATA binding protein3,Gata3)、八聚體轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)、Sry相關(guān)HMG盒2(Sry-relabed HMG box probein 2,Sox2)和Nanog同源框(Nanog homeobox,Nanog)。

    1.1 胚胎發(fā)育過程不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

    在小鼠胚胎中,Cdx2、Gata3是TE的特異轉(zhuǎn)錄因子;Oct4、Sox2和Nanog為ICM 的特異轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)Cdx2與Gata3在8-細(xì)胞的部分卵裂球中表達(dá),并逐漸向外部細(xì)胞聚集,最終只在囊胚的TE中表達(dá)。Oct4和Sox2在早期卵裂的各個(gè)階段均有表達(dá),但在囊胚形成后僅限于在ICM中表達(dá)。Nanog基因在桑椹胚中首次檢測到表達(dá),后維持在ICM中表達(dá),TE中表達(dá)量下降[7-8]。此外,研究發(fā)現(xiàn)Oct4和Cdx2的表達(dá)存在頡頏作用,Cdx2可結(jié)合到Oct4基因的啟動(dòng)子區(qū)并抑制其轉(zhuǎn)錄[9]。同樣Oct4可以結(jié)合到Cdx2的啟動(dòng)子區(qū),導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄阻滯[10]。

    在豬胚胎,Sox2在ICM 中特異性表達(dá),Cdx2在TE中特異性表達(dá);而Oct4在TE、ICM中廣泛表達(dá),沒有特異性。說明在豬胚胎中,TE中的Cdx2不能有效抑制Oct4的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Sox2與Cdx2在ICM和TE中表現(xiàn)互斥的表達(dá)模式,表明Sox2和Cdx2是豬早期胚胎的特異標(biāo)記因子,在ICM與TE的分化中起到了關(guān)鍵的作用[11]。

    在牛胚胎,Cdx2和Oct4在囊胚的ICM和TE中均有表達(dá)。其中Cdx2的mRNA在2-細(xì)胞、8-細(xì)胞期表達(dá)量較低,在桑葚胚和囊胚階段逐漸上調(diào),而Oct4在各階段的表達(dá)量沒有明顯變化。進(jìn)一步的研究表明,Cdx2不能與Oct4基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并抑制Oct4的表達(dá),從而使Oct4在TE中表達(dá)[12]。

    1.2 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在TE和ICM形成中的作用

    在小鼠胚胎中,敲除胚胎中Cdx2基因后,致密化、細(xì)胞極化、囊胚腔以及ICM可以正常形成,但胚胎不能形成成熟的TE,導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯[13],表明Cdx2對于維持TE是必需的。通過RNAi干擾Gata3表達(dá)會(huì)導(dǎo)致囊胚的形成受阻滯[14]。在胚胎干細(xì)胞中,敲除Oct4的基因?qū)е翴CM分化為TE細(xì)胞[15]。Nanog作為Otc4的一個(gè)靶基因,被敲除后的小鼠可以形成正常的囊胚,但之后的胚外組織發(fā)育異常[16]。在牛中,降低Cdx2的表達(dá)水平不會(huì)影響囊胚發(fā)育率,但是會(huì)顯著提高TEA轉(zhuǎn)錄因子4(TEA domain transcription factor 4,Tead4)的表達(dá)。Tead4在小鼠中通過Hippo型號通路調(diào)節(jié)Cdx2基因轉(zhuǎn)錄,不過Tead4與Cdx2在牛胚胎中的關(guān)系還需進(jìn)一步研究[12]。

    2 極性蛋白對細(xì)胞分化的影響

    細(xì)胞極性影響胚胎細(xì)胞的命運(yùn)。在胚胎發(fā)育過程中,極性不同的卵裂球有著不同的分化命運(yùn),內(nèi)部非極性的卵裂球分化形成ICM,外部極性的卵裂球形成TE。而細(xì)胞的極性與極性蛋白的表達(dá)定位有關(guān),因此研究極性蛋白的定位表達(dá)和相互作用是解釋TE、ICM譜系分化的關(guān)鍵。

    2.1 aPKC-PAR極性蛋白復(fù)合體

    頂端極性蛋白/區(qū)域缺陷組件復(fù)合物(apical polarity protein/partitioning defective component,aPKC-PAR)是參與極性化作用的蛋白復(fù)合體之一,由區(qū)域性缺陷同系物3(partitioning defective 3 homologue,Pard3)、區(qū)域性缺陷同系物6(partitioning defective 6 homologue,Pard6)、非典型蛋白激酶C(atypical protein kinase C,aPKC)及ELKL基序激酶1(ELKLmotif kinase 1,Emk1)組成[17]。研究發(fā)現(xiàn),這些極性蛋白在胚胎中的分布隨胚胎細(xì)胞的分化而呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。在小鼠胚胎中,Pard6b和Emk1在2-細(xì)胞~8-細(xì)胞階段主要分布于細(xì)胞核,4細(xì)胞中的aPKC則主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞發(fā)生極化后,Pard6b和aPKC蛋白開始向細(xì)胞膜的頂端膜聚集,而Emk1則定位在基底膜區(qū)域。正是這種頂端-基底部的不對稱分布,促進(jìn)了細(xì)胞極化的形成[8]。研究發(fā)現(xiàn),敲除小鼠胚胎中Pard6基因,會(huì)導(dǎo)致aPKC在細(xì)胞頂端的錯(cuò)誤定位,造成細(xì)胞極化異常、囊胚腔不能正常形成,并且致使滋養(yǎng)層標(biāo)志轉(zhuǎn)錄因子Cdx2的表達(dá)量較正常胚胎下降[18]。另一項(xiàng)研究表明,敲除Pard6后也會(huì)導(dǎo)致外部細(xì)胞中的血管泌素(Amot)定位紊亂,從而在外部細(xì)胞中激活Hippo信號,造成滋養(yǎng)層發(fā)育受損[19]。

    2.2 CRB極性蛋白復(fù)合體

    CRB極性蛋白復(fù)合體由crumbs蛋白質(zhì)同源物3(crumbs protein homolog,crb3)、Lin Seven相關(guān)的蛋白質(zhì)1(Proteins associated with lin seven 1,Pals1)和Pals1相關(guān)的緊密連接蛋白(pals1-associated tight junction protein,Patj)組成。在小鼠胚胎中,這些極性蛋白在胚胎發(fā)育過程中呈動(dòng)態(tài)分布,在8-細(xì)胞之前均勻分布在卵裂球中。當(dāng)致密化開始時(shí)CRB極性蛋白便出現(xiàn)不對稱分布,其中Crb3和Pals1向頂端膜聚集,而Patj主要定位于基底膜的黏附連接處[20],這與PAR極性蛋白復(fù)合體在致密化前后的分布相似。表明這些蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞極性的形成。此外,該項(xiàng)研究也對CRB極性復(fù)合體蛋白的功能進(jìn)行了探討,在敲除Patj基因后發(fā)現(xiàn),CRB極性蛋白復(fù)合體和帶狀封閉蛋白-1(zonuia occluden-1,ZO-1)定位紊亂,胚胎的頂端-基底部極性、細(xì)胞骨架以及黏附連接的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性被破壞,最終導(dǎo)致囊胚發(fā)育異常[20]。在降低Patj的表達(dá)后發(fā)現(xiàn),Hippo信號通路中的Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,Yap)定位發(fā)生錯(cuò)亂,使外部細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄共激活因子Yap發(fā)生磷酸化,無法進(jìn)入細(xì)胞核與Tead4結(jié)合,Cdx2的表達(dá)受到抑制,最終導(dǎo)致TE無法形成。

    綜上對于PAR極性蛋白復(fù)合體和CRB極性蛋白復(fù)合體的研究表明,兩者在植入前胚胎發(fā)育分化中分布較為相似,且通過調(diào)控Hippo信號通路影響胚胎滋養(yǎng)層的發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn),在上皮細(xì)胞中PAR極性蛋白與CRB極性蛋白間存在著直接聯(lián)系[21],這些蛋白質(zhì)復(fù)合物的定位是一個(gè)相互依賴的過程,Crb蛋白可以將Par6及其相關(guān)蛋白招募并穩(wěn)定到細(xì)胞頂端區(qū)域。然而,在植入前胚胎中PAR極性蛋白與CRB極性蛋白間的聯(lián)系尚不清楚。進(jìn)一步揭示PAR極性蛋白復(fù)合體與CRB極性蛋白復(fù)合體在空間定位以及調(diào)控Hippo信號通路之間的聯(lián)系是較有價(jià)值的。

    3 影響胚胎早期分化的信號通路

    3.1 Hippo通路

    Hippo信號通路是由一系列激酶組成的級聯(lián)信號通路,通過抑制下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子Yap,調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡及分化潛能等多種生物學(xué)行為[22]。

    R.Yagi等[23]發(fā)現(xiàn),在Hippo相關(guān)基因Tead4突變的小鼠胚胎中,Cdx2的表達(dá)明顯下調(diào),且胚胎中的細(xì)胞大多分化為ICM,這說明Cdx2的正常表達(dá)需要Tead4。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中,Hippo處于激活狀態(tài),Yap被磷酸化并與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白結(jié)合而滯留于細(xì)胞質(zhì)中,使Yap無法進(jìn)入細(xì)胞核與Tead4結(jié)合[24]。在外側(cè)的TE中,Hippo處于未激活狀態(tài),未磷酸化的Yap進(jìn)入細(xì)胞核與Tead4結(jié)合,共調(diào)節(jié)cdx2等相關(guān)基因[25]。

    在小鼠胚胎中,Hippo通路的激活與胚胎的極性化和細(xì)胞間的黏附連接密切相關(guān)[19]。在胚胎細(xì)胞極化的過程中,外層細(xì)胞出現(xiàn)頂部和基底部,頂部富含纖維狀肌動(dòng)蛋白(filamentous actin,F(xiàn)-actin)。而F-actin可以捕獲Hippo中的關(guān)鍵因子,導(dǎo)致其不能對Hippo信號通路中的果蠅Warts、Wts同源物(large tumor suppressor1/2,Lats1/2)分子進(jìn)行磷酸化,進(jìn)而不足以使下游效應(yīng)因子Yap磷酸化[26]。非磷酸化的Yap可以自由進(jìn)入細(xì)胞核與Tead4結(jié)合,驅(qū)動(dòng)滋養(yǎng)層中Cdx2和Gata3等基因表達(dá)等的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活。而內(nèi)部細(xì)胞是非極性的,沒有頂部與基底部之分。內(nèi)部細(xì)胞中大多數(shù)的Amot會(huì)與細(xì)胞黏附連接處的鈣調(diào)素蛋白(epithrllisl cadherin,E-cadherin)Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤?。╪eurofibromatosis type 2,NF2)等形成復(fù)合體。一旦復(fù)合體形成,Amot的第176位絲氨酸(S176)被磷酸化,進(jìn)而通過磷酸化果蠅Lats1/2激活Hippo信號通路[19]。在Hippo處于激活狀態(tài)時(shí),Yap被磷酸化并滯留于細(xì)胞質(zhì)中,無法進(jìn)入細(xì)胞核與Tead4結(jié)合并啟動(dòng)Cdx2基因的表達(dá)[25]。由于Oct4與Cdx2間的表達(dá)存在相互抑制作用[9],在Cdx2的表達(dá)量較低時(shí)Oct4的表達(dá)不再受到抑制,由此強(qiáng)化了內(nèi)部細(xì)胞向ICM分化。因此,正是因?yàn)榕咛ゼ?xì)胞極化導(dǎo)致Hippo信號通路的選擇性開啟,影響了胚胎細(xì)胞的譜系分化。

    3.2 MAPK通路

    絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可以被一系列細(xì)胞外信號或刺激激活。在哺乳動(dòng)物中,MAPK的亞族主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)以及 p38 促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,p38-MAPK)。MAPK信號傳導(dǎo)是以MAPKKK、MAPKK、MAPK三級激酶級聯(lián)的形式進(jìn)行,通過對一系列轉(zhuǎn)錄因子磷酸化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)節(jié),進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、分裂及分化調(diào)節(jié)[27]。

    抑制小鼠胚胎中p38-MAPK通路,發(fā)現(xiàn)8-細(xì)胞~16-細(xì)胞胚胎形態(tài)異常,囊胚的擴(kuò)張和孵化減緩,細(xì)胞凋亡顯著增加[28]。此外p38-MAPK缺失會(huì)導(dǎo)致F-actin形成受阻[29],而F-action是胚胎致密化以及細(xì)胞分裂過程中的重要蛋白[4]。因此,在抑制p38-MAPK的小鼠胚胎中,其異常發(fā)育可能是缺少肌動(dòng)蛋白導(dǎo)致的。除p38通路外,有研究發(fā)現(xiàn)抑制JNK通路也可以抑制小鼠胚胎發(fā)育[30]。不過在牛胚胎中,單獨(dú)抑制一條通路并不會(huì)影響胚胎發(fā)育[31],要同時(shí)抑制p38-MAPK和MAPK/ERK信號才會(huì)出現(xiàn)與小鼠胚胎相似的發(fā)育阻滯。近期有研究提出不同的觀點(diǎn),其在小鼠植入前胚胎中單獨(dú)抑制p38-MAPK、JNK以及MAPK/ERK通路皆不會(huì)阻斷囊胚發(fā)育,只有同時(shí)阻斷3條通路,囊胚才會(huì)出現(xiàn)發(fā)育異?,F(xiàn)象;同時(shí)檢測到TE相關(guān)的特異性調(diào)控因子Cdx2與Gata3的表達(dá)明顯下調(diào),并且發(fā)育異常胚胎細(xì)胞骨架大部分呈彌散狀態(tài),肌動(dòng)蛋白異常。推測是由于三條信號通路之間存在代償機(jī)制,單一信號通路的抑制對胚胎發(fā)育影響較小,未表現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異[32]。出現(xiàn)這種狀況,還可能與小鼠的批次、使用的藥品不同有關(guān)。此外,MAPK通路可以對細(xì)胞分裂造成不利影響。在抑制小鼠卵母細(xì)胞的MAPK通路后,卵母細(xì)胞出現(xiàn)紡錘體和微管組織異常,導(dǎo)致減數(shù)分裂失?。?3]。與卵母細(xì)胞相比,抑制胚胎中的MAPK信號通路后是否會(huì)出現(xiàn)類似卵母細(xì)胞分裂異常的狀況有待進(jìn)一步研究。

    雖然現(xiàn)已證明MAPK信號通路對胚胎細(xì)胞譜系分化至關(guān)重要,但MAPK通路對植入前胚胎發(fā)育的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚;MAPK通路的激活是否也與極性蛋白和黏附連接相關(guān),以及在通路的下游如何調(diào)控Cdx2與Gata3的表達(dá),均值得進(jìn)一步探討;此外,MAPK通路在卵母細(xì)胞中通過調(diào)控紡錘體和微管組織的形成介導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂,而在哺乳動(dòng)物植入前胚胎發(fā)育過程中,MAPK通路異常是否會(huì)造成紡錘體形成異常、染色體錯(cuò)位等異常反應(yīng)并引起卵裂球分裂異常,有待進(jìn)一步研究。

    4 展望

    綜上所述,筆者在本文中探討了一些轉(zhuǎn)錄因子、信號通路和極性蛋白對植入前胚胎譜系分化的影響,通過揭示植入前胚胎細(xì)胞譜系分化的分子機(jī)制,將有助于了解體外胚胎發(fā)育異常的原因、多能干細(xì)胞的分化發(fā)育機(jī)制等相關(guān)技術(shù)。然而,目前仍有許多其他相關(guān)的通路、基因等具體機(jī)制研究的不是很透徹,有待進(jìn)一步探索。

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