做好窗口期應(yīng)激管理來降低復(fù)產(chǎn)ASF感染風(fēng)險

楊有福，李 想，譚 輝，畢小娟，劉自逵1,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2湖南加農(nóng)正和生物技術(shù)有限公司，湖南 長沙 410329；3.PSY應(yīng)用研究院，湖南 長沙 410329）

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是一種由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）感染引起的，以家豬和野豬為主要宿主的高接觸性傳染、病毒出血性疾病。從2018年8月份傳入國內(nèi)以來，官方渠道報道近200起，造成國內(nèi)生豬存欄和豬肉供應(yīng)“斷崖式”下降。為彌補生豬存欄和豬肉供應(yīng)的巨大缺口，做好ASF防控前提下的安全復(fù)產(chǎn)成為政府和行業(yè)的共識并積極落地。

筆者結(jié)合非洲豬瘟發(fā)病機理研究進展和多起ASF案例的防控經(jīng)驗和教訓(xùn)，總結(jié)出在豬場安全復(fù)產(chǎn)過程中確實存在ASF感染風(fēng)險激增的節(jié)點，包括免疫、發(fā)情、配種、分娩、斷奶和轉(zhuǎn)群等六大風(fēng)險窗口期，是豬發(fā)生應(yīng)激最多、應(yīng)激反應(yīng)最強烈的階段。例如，疫苗免疫特別是肌注疫苗操作對機體的應(yīng)激最大，會引發(fā)窘迫應(yīng)激、驅(qū)趕應(yīng)激、掙扎應(yīng)激、痛疼應(yīng)激和感染應(yīng)激等；發(fā)情、配種是機體激素變化最大的階段，發(fā)情時會表現(xiàn)體溫升高、采食量下降、呆立反應(yīng)、異物反應(yīng)、排斥反應(yīng)等應(yīng)激；分娩是一個極度疲勞、劇烈痛疼和代謝紊亂的過程，是母仔的生死關(guān)，其應(yīng)激反應(yīng)可想而知；斷奶與轉(zhuǎn)群對于仔豬的應(yīng)激特別大，生理應(yīng)激（從吃奶向吃料轉(zhuǎn)化，從液體奶水向固體飼料轉(zhuǎn)變）、環(huán)境窘迫（陌生環(huán)境、冷熱應(yīng)激、空間應(yīng)激）與心理應(yīng)激（陌生個體、遠(yuǎn)離母親、打斗與驚恐）等。深挖其中的機理，我們認(rèn)為六大風(fēng)險窗口期造成的豬群應(yīng)激會引發(fā)一系列的生理生化反應(yīng)，對豬的健康極為不利，往往成為ASF感染風(fēng)險升高的主要窗口期。文章旨在通過闡述各種應(yīng)激對豬健康傷害與ASFV感染之間的緊密關(guān)系，為復(fù)產(chǎn)過程中風(fēng)險窗口期的應(yīng)激管控提供理論支持，為豬場安全復(fù)產(chǎn)提供行動思路。

1 應(yīng)激反應(yīng)的中心是“胃腸道”，直接損壞其黏膜免疫屏障，提高了ASFV的感染風(fēng)險

豬呼吸道和消化道是ASFV感染豬的主要門戶，ASFV通過扁桃體或背側(cè)咽黏膜進入頜下淋巴結(jié)或咽后內(nèi)側(cè)淋巴結(jié)，以受體介導(dǎo)的“細(xì)胞內(nèi)吞”為主要方式進入靶細(xì)胞，在淋巴結(jié)復(fù)制后通過淋巴液、血液快速擴散至全身[1-4]。

黏膜免疫是豬抵抗ASFV感染的第一道屏障。黏膜免疫系統(tǒng)是機體免疫系統(tǒng)重要的組成部分，包括呼吸道、消化道、泌尿生殖道的黏膜組織，由覆蓋于黏膜系統(tǒng)內(nèi)表面的黏膜上皮組織、黏膜相關(guān)淋巴組織、免疫細(xì)胞及其產(chǎn)生的分泌物，以及黏膜正常棲息的微生物構(gòu)成，是機體與外界抗原直接接觸的門戶，不同部位黏膜免疫反應(yīng)相關(guān)聯(lián)形成共同黏膜免疫屏障（CMIS），對機體的免疫應(yīng)答具有重要的調(diào)節(jié)作用[5]。SIgA作用于黏膜局部，是黏膜中關(guān)鍵因子，對維護黏膜上皮細(xì)胞之間的緊密連接，對由于食物攝入或由空氣吸入的某些抗原物質(zhì)具有封閉作用；SIgA與病毒結(jié)合，可阻擋病毒黏附于宿主細(xì)胞、中和病毒和病毒產(chǎn)生的毒素，增加黏液蛋白酶對抗原降解等免疫清除作用，避免抗原進入機體，從而避免有某些超敏反應(yīng)發(fā)生。SIgA超高產(chǎn)量、超高免疫清除率，超出了其他所有Ig，能有效防御疾病、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和防止某些超敏反應(yīng)與自身免疫病發(fā)生。

持續(xù)而強烈地應(yīng)激導(dǎo)致ASFV通過鼻、口侵入呼吸道和消化道黏膜，引發(fā)黏膜炎癥，使SIgA由SC介導(dǎo)轉(zhuǎn)運到消化道、呼吸道和泌尿生殖道能力下降，造成CMIS受損。應(yīng)激在胃腸道黏膜上表現(xiàn)最為典型，有以下表現(xiàn)。1）交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的強烈興奮，引發(fā)內(nèi)臟血管的持續(xù)性收縮，導(dǎo)致黏膜缺血、缺氧性損傷、潰瘍與糜爛；2）通過分泌糖皮質(zhì)激素（GC），抑制黏膜上皮細(xì)胞再生；3）通過調(diào)節(jié)代謝水平，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸性產(chǎn)物增多，細(xì)胞酸中毒造成損傷；4）導(dǎo)致氧自由基增多，破壞細(xì)胞生物膜通透性。

通過這幾個機理，持續(xù)的強烈應(yīng)激能破壞機體重要黏膜免疫屏障，為病毒感染打開了大門。因此，完整的黏膜免疫屏障對提高感染閾值具有十分重要的意義，維護消化道和呼吸道完整有利于防控ASF。

2 應(yīng)激提高巨噬細(xì)胞CD163表達(dá)，促進ASFV感染靶細(xì)胞

2.1 CD163是巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白，可能是ASFV感染的必要不充分條件

ASFV有嚴(yán)格的靶細(xì)胞趨向性，首要靶細(xì)胞是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，也有報道能感染樹突狀細(xì)胞[6]。這種細(xì)胞趨向性表明ASFV的感染可能需要特定的細(xì)胞表面蛋白協(xié)助。研究發(fā)現(xiàn)，成熟細(xì)胞更易受到ASFV的感染，而骨髓細(xì)胞和新生的血液單核細(xì)胞不易受到感染。通過FACS方法對單核細(xì)胞進行分析，發(fā)現(xiàn)感染的細(xì)胞有更多的成熟表型、有高水平表達(dá)幾種巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記以及SLA II抗原[7]。高度成熟的、細(xì)胞高水平表達(dá)特定標(biāo)記的巨噬細(xì)胞最容易感染ASFV，尤其表達(dá)了受體CD163、表面抗原4E9（豬CD107a或溶酶體相關(guān)的膜蛋白I）的巨噬細(xì)胞更是如此[8]。

ASFV主要通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞方式進入細(xì)胞，然而目前可確信地參與病毒入侵的細(xì)胞受體尚不明確[3，9]。CD163是一種巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)的蛋白，其表達(dá)的上調(diào)是巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚员硇偷闹匾淖冎弧D163是一種血紅蛋白清道夫受體，在溶血過程中能攝取釋放在血漿中的血紅蛋白，并與觸珠蛋白絡(luò)合[10]。研究發(fā)現(xiàn)，CD163表達(dá)的提高、單核細(xì)胞成熟度也相應(yīng)提高，而ASFA感染的百分比也上升。體內(nèi)的試驗也同樣表現(xiàn)出CD163的表達(dá)與病毒感染之間的緊密相關(guān)性[7]。CD163在紅髓巨噬細(xì)胞、骨髓巨噬細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞、肺巨噬細(xì)胞等高度表達(dá)[10]，也是ASFV首選的靶細(xì)胞。因此，CD163可能是ASFV的感染受體。也有研究表明，利用基因敲除技術(shù)敲除巨噬細(xì)胞上的CD163獲得的試驗豬能感染格魯吉亞2007/1毒株（Georgia 2007/1）并表現(xiàn)臨床病癥，與野生型對照組相比并沒有顯著差異；體外感染巨噬細(xì)胞試驗也得到了同樣的結(jié)果。因此，CD163并不是格魯吉亞2007/1毒株感染的必需受體，其與其他毒株的感染能力差異仍需要進一步研究[11]。然而，通過CD163抗體處理后確實能抑制ASFV對巨噬細(xì)胞的綁定。綜合這些研究結(jié)果，證明了CD163是ASFV感染的必要不充分條件，ASFV的感染可能還涉及到其他巨噬細(xì)胞表面蛋白[12]。

2.2 應(yīng)激提高CD163分泌，可能是促進ASFV感染的機制之一

機體應(yīng)激系統(tǒng)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的下丘腦和腦干部位，以及外周的下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸、傳出交感/腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和副交感系統(tǒng)。應(yīng)激系統(tǒng)激活的中樞系統(tǒng)反應(yīng)是應(yīng)激性刺激激活下丘腦釋放促腎上腺素釋放因子（CRF），CRF可刺激B細(xì)胞增生、激活NK細(xì)胞以及增加IL-1、IL-2和IL-6等作用，同時能刺激應(yīng)激系統(tǒng)外周活性物質(zhì)GC的分泌。GC為體內(nèi)重要的抗炎物質(zhì)，能抑制多種促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，應(yīng)激發(fā)生時會引發(fā)多種炎癥，其分泌上升[13,14]。體外試驗結(jié)果表明，GC、IL-6和血紅蛋白（Hb）等能刺激CD163的表達(dá)，而IFN-γ、IL-4等能抑制CD163的表達(dá)。體內(nèi)試驗也證明，GC能提高CD163的表達(dá)[10]，這可能是應(yīng)激促進ASFV的感染的機制之一。

3 應(yīng)激誘導(dǎo)血管內(nèi)粒細(xì)胞凝聚，加速了微血栓的形成與內(nèi)皮細(xì)胞損傷，有利于病毒擴散

在細(xì)胞培養(yǎng)中，紅細(xì)胞會形成一個皇冠狀結(jié)構(gòu)圍繞在感染細(xì)胞周圍。在感染豬體內(nèi)也可以觀察到梨形的紅細(xì)胞吸附在感染的巨噬細(xì)胞周圍，說明血細(xì)胞吸附是ASFV感染的一個特點。吸附是病毒發(fā)生感染的前提條件，ASFV在感染血細(xì)胞中粒細(xì)胞后，會誘導(dǎo)粒細(xì)胞凝聚，這可能是因為ASFV誘導(dǎo)粒細(xì)胞分泌IL-1和TNF-α，兩者作為中性粒細(xì)胞的趨化因子，導(dǎo)致了中性粒細(xì)胞的凝聚，這在急性ASFV傳播方面發(fā)揮一定作用，同時導(dǎo)致微血栓的形成和內(nèi)皮細(xì)胞受損[16]。血細(xì)胞吸附、病毒出芽和病毒顆粒吸附紅細(xì)胞存在緊密聯(lián)系[15]。

應(yīng)激可引發(fā)機體炎癥響應(yīng)。應(yīng)激性刺激可激活下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，促炎癥因子IL-1和TNF-α受誘導(dǎo)分泌增多[13，14]。研究表明，產(chǎn)前分娩應(yīng)激提高IL-1β和TNF-α的表達(dá)[17]，這可能與多胎妊娠動物子宮過度延展引起的機械應(yīng)激隨后誘導(dǎo)的炎癥有關(guān)[18]。仔豬斷奶應(yīng)激除了影響采食和營養(yǎng)吸收能力外，體內(nèi)還會蓄積大量的氧自由基。過量的氧自由基能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，引起胃腸的炎癥響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，與哺乳期仔豬相比，斷奶仔豬的空腸促炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)顯著上升，通過飼喂抗氧化物質(zhì)，斷奶仔豬的促炎癥因子顯著降低，與哺乳期仔豬無顯著差異[19]。

因此，妊娠后期飼養(yǎng)、分娩與斷奶管理等是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的關(guān)鍵節(jié)點，此時的應(yīng)激極有可能導(dǎo)致后續(xù)的炎癥反應(yīng)和炎癥因子的分泌，促進ASFV的早期感染與擴散。

4 應(yīng)激抑制干擾素分泌，幫助ASFV實現(xiàn)免疫逃逸

4.1 ASFV抑制IFN分泌實現(xiàn)免疫逃逸

IFN是抗病毒免疫最重要的早期免疫分子，其中Ⅰ型干擾素（IFN-α、IFN-β）由感染局部的上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和pDC細(xì)胞等分泌，而Ⅱ型干擾素（IFN-γ）早期由活化的巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌，后期由活化的輔助細(xì)胞產(chǎn)生。病毒感染時機體產(chǎn)生IFN-α和IFN-β，兩者通過作用于病毒感染細(xì)胞和其臨近的未感染細(xì)胞，誘導(dǎo)抗病毒蛋白的產(chǎn)生而發(fā)揮抗病毒作用。

Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素都能激活NK細(xì)胞，促進其殺傷病毒感染細(xì)胞。NK細(xì)胞是重要的早期抗病毒效應(yīng)細(xì)胞，同時NK細(xì)胞還是抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）中的效應(yīng)細(xì)胞，通過與感染細(xì)胞結(jié)合，釋放穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒物質(zhì)殺傷病毒感染的靶細(xì)胞。

干擾素還能激活單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強其吞噬和殺傷功能，在病毒感染早期發(fā)揮重要的抗病毒效應(yīng)。巨噬細(xì)胞在IFN-γ刺激下活化，同時促進巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROIs和RNIs，幫助殺滅被吞噬的病毒。此外，巨噬細(xì)胞也可通過ADCC機制清除病毒。

ASFV通過多種途徑實現(xiàn)免疫逃避，包括細(xì)胞趨向性、抑制干擾素分泌、抑制干擾素響應(yīng)以及抑制感染細(xì)胞的凋亡。而抑制干擾素分泌是其中最重要的免疫逃避機制。

為了能夠順利地完成病毒復(fù)制和傳播，ASFV通過多種機制抑制感染細(xì)胞凋亡。但同時，ASFV也能誘導(dǎo)鄰近的未感染的淋巴組織以及血液B細(xì)胞和T細(xì)胞大量死亡，從而達(dá)到抑制干擾素分泌、抑制免疫響應(yīng)的目的。其中的機制不明，推測可能是感染的細(xì)胞分泌或傳遞表面因子，導(dǎo)致鄰近未感染淋巴細(xì)胞凋亡[6]。體外培養(yǎng)的感染細(xì)胞中，TNF mRNA表達(dá)上升，培養(yǎng)液上清液有高水平的TNF蛋白，這些上清液能引起未感染的淋巴細(xì)胞的凋亡；在ASFV感染的豬體內(nèi)，血清中TNF和IL-1β水平上升，巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-a、IL-1和IL-6，靠近的淋巴細(xì)胞同樣有凋亡現(xiàn)象[20]。

此外，ASFV能編碼多種基因抑制干擾素分泌和干擾素誘導(dǎo)。敲除MGF360和MGF530/505多基因家族中的一個或多個成員能顯著提高對Ⅰ型干擾素的誘導(dǎo)和Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)的下游基因的表達(dá)[6,8,21]，表明這兩個基因家族是在抑制干擾素分泌和干擾素誘導(dǎo)中扮演至關(guān)重要的角色。例如MGF505-7R通過抑制干擾素調(diào)控因子IRF3R和NF-kB信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素表達(dá)；MGF360-15R（A276R）通過TLR3和胞質(zhì)傳感通路抑制Ⅰ型干擾素；ASFV pI329L蛋白與細(xì)胞內(nèi)的TLR3相似，它是一種糖基化蛋白分泌在細(xì)胞膜上，通過競爭抑制TLR3調(diào)控的IFN-β的誘導(dǎo)[6]。

因此，在早期感染階段ASFV通過誘導(dǎo)未感染免疫細(xì)胞凋亡、抑制干擾素分泌和抑制干擾素響應(yīng)等方式，造成對免疫系統(tǒng)的抑制，實現(xiàn)免疫逃逸，保障病毒的順利復(fù)制和擴散。

4.2 應(yīng)激導(dǎo)致免疫抑制有利于ASFV實現(xiàn)免疫逃逸

短暫的急性應(yīng)激能導(dǎo)致免疫反應(yīng)增強，如外周血巨噬細(xì)胞數(shù)目增多，但高度成熟、分泌高水平CD163的巨噬細(xì)胞反而成了感染靶細(xì)胞。同時，持續(xù)的應(yīng)激可抑制免疫功能。一方面應(yīng)激時的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)會抑制免疫系統(tǒng)，如GC對免疫功能有抑制作用；另一方面，應(yīng)激造成的氧自由基、促炎癥因子增多，會直接損傷免疫細(xì)胞，導(dǎo)致免疫細(xì)胞數(shù)量下降、干擾素分泌不足，導(dǎo)致免疫抑制。應(yīng)激造成的免疫抑制為ASFV的早期感染提供了安全的環(huán)境[22]。

總之，在發(fā)情、配種、分娩、斷奶、轉(zhuǎn)群和免疫這六大窗口期非常容易出現(xiàn)程度不同的應(yīng)激以及應(yīng)激性反應(yīng)，引發(fā)消化道與呼吸道的共同黏膜免疫屏障的損傷、潰瘍或糜爛，促進巨噬細(xì)胞表達(dá)特異性細(xì)胞表面蛋白CD163與炎癥趨化因子（IL-1、TNF-α、IL-6）表達(dá)，誘導(dǎo)血管內(nèi)粒細(xì)胞凝聚及微血栓形成與內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制干擾素分泌、抑制免疫反應(yīng)等方式，成為ASF防控的風(fēng)險“激增期”，為ASFV的入侵、成功感染和早期復(fù)制提供有利的環(huán)境，這極大增加了豬場ASF的防控風(fēng)險。因此，做好豬群應(yīng)激管理、做好六大窗口期風(fēng)險管控是減少豬場感染風(fēng)險、成功復(fù)產(chǎn)的關(guān)鍵措施。