鈣離子對(duì)海假交替單胞菌生物被膜形成及厚殼貽貝附著的影響

常睿珩，許康豪，蔡雨珊，楊金龍、2，梁簫、2*

(1.上海海洋大學(xué) 國家海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州),廣東 廣州 511458)

生物被膜是附著在物體外側(cè)或相互接觸面的具備結(jié)構(gòu)的微生物群體[1]，由微生物及其分泌的胞外基質(zhì)組成，為順應(yīng)生活環(huán)境而形成在活性或惰性材質(zhì)外層[2]。在水體環(huán)境中，絕大部分固體附著基質(zhì)的表層都存在著生物被膜。細(xì)菌附著到基質(zhì)表層并產(chǎn)生胞外產(chǎn)物形成了生物被膜，這是生物被膜形成的重要部分[3]。影響生物被膜形成的因素有很多，如溫度和鹽度[4]、培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽[5]、不同種細(xì)菌[6]等。生物被膜能影響貽貝、藤壺等幼蟲的附著變態(tài)[7-9]，該現(xiàn)象是海洋經(jīng)濟(jì)貝類養(yǎng)殖和海洋防污損的研究熱點(diǎn)。

鈣離子是高度通用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，可以調(diào)節(jié)多種不同細(xì)胞的功能[10]。在海洋環(huán)境中，鈣是一種經(jīng)常在物體表面富集的元素，既可以是沉積的鈣沉積物，也可以與其他海洋生物結(jié)合在一起[11]。鈣能影響生物被膜的形成，特別是鈣參與了細(xì)胞與基質(zhì)之間的特異性和非特異性相互作用[12-13]。已有試驗(yàn)證實(shí)，鈣離子能夠促進(jìn)大腸桿菌生物被膜和銅綠假單胞菌生物被膜形成[14-15]，抑制霍亂弧菌生物被膜形成[16]。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用海假交替單胞菌Pseudoalteromonasmarina(ECSMB14103) 為上海海洋大學(xué)貝類分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(以下簡稱本實(shí)驗(yàn)室)的保種菌株(保藏號(hào)為MCCC 1K03544)。該菌株來自浙江省嵊泗縣枸杞島(122°46′E、30°43′N)的自然生物被膜表面，使用Zobell 2216E平板劃線進(jìn)行培育，再分離菌株得到單一菌株，利用甘油-生理鹽水保種液保種，在-80 ℃超低溫冰箱中保存。

自然海水(nature seawater,NSW)取自浙江省嵊泗縣枸杞島附近，經(jīng)測定鈣離子濃度為11.78 mmol/L?？紤]到要調(diào)節(jié)海水中的鈣離子含量，用自然海水無法減少其中鈣離子的含量，故本試驗(yàn)中配制與自然海水成分最為相似的人工海水(artificial seawater，ASW)，以此來達(dá)到人為調(diào)控海水鈣離子濃度的目的。試驗(yàn)設(shè)置鈣離子濃度為10 mmol/L的對(duì)照組，以及鈣離子濃度為0、1、5、20、50 mmol/L的5個(gè)試驗(yàn)組。人工海水的配方如下：蒸餾水、NaCl、MgSO4·7H2O、MgCl2·6H2O、KCl、CaCl2、NaNO3、K3PO4、β-五水甘油磷酸二鈉鹽、Na2SiO3·9H2O、維生素、pⅡMetals、S2Metals、Tris、氨基三乙酸。

試驗(yàn)用厚殼貽貝稚貝取自浙江省舟山市嵊泗縣(122°46′E、30°69′N)，在本實(shí)驗(yàn)室用自然海水暫養(yǎng)一周后使用。挑選殼長為(0.56±0.03)mm、殼高為(0.38 ± 0.02)mm的稚貝用于附著試驗(yàn)。

試驗(yàn)用激光共聚焦顯微鏡由Leica公司生產(chǎn)(×630倍鏡)。

1.2 方法

1.2.1 海假交替單胞菌的分離 參考Yang等[17]的方法，將附著在載玻片上的自然生物被膜(浙江省嵊泗縣枸杞島)從載玻片表面刮到過濾過的海水中，將混有細(xì)菌的海水均勻涂在Zobell 2216E平板上，平板倒置在溫度25 ℃且黑暗的條件下培育48 h，從中挑取目的菌落。再將選取出來的菌株反復(fù)分離純化，最后將確定的純種海假交替單胞菌(經(jīng)Adapt Noise Immunity分析，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)用0.9%生理鹽水配制成30%的甘油保種液保種，再放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2 生物被膜的制備 參考Yang等[17]的方法，用Zobell 2216E液體培養(yǎng)基培育純種海假交替單胞菌，在25 ℃、黑暗條件下擴(kuò)大培育16 h。用無菌海水洗滌培養(yǎng)的菌液3次，最后定容至50 mL懸濁菌液。使用Olympus BX-51熒光顯微鏡確定菌液細(xì)胞密度并在培養(yǎng)皿(直徑64 mm×19 mm)中加入相應(yīng)的菌液，再加入無菌海水使得培養(yǎng)皿終體積為20 mL。在18 ℃、黑暗條件下培育48 h形成試驗(yàn)用生物被膜。

菌液的初始細(xì)胞密度分別設(shè)定為1×106、1×107、1×108、5×108cells/mL，自然海水(NSW)與人工海水(ASW)形成生物被膜的比較試驗(yàn)中使用這4組密度，其余試驗(yàn)均選用最佳密度1×108cells/mL。

1.2.3 生物被膜細(xì)菌密度的計(jì)算 參考Yang等[17]的方法，將5%福爾馬林溶液固定過的生物被膜用0.1%的吖啶橙溶液染色5 min后，晾干制片，在1 000倍熒光顯微鏡(Olympus BX-51)下選擇30個(gè)區(qū)域計(jì)算細(xì)菌個(gè)數(shù)。計(jì)算公式為

時(shí)代向中國畫家提出一個(gè)艱巨的歷史課題：要在人物畫創(chuàng)作上突破傳統(tǒng)的觀念、創(chuàng)作模式和表現(xiàn)技法，直接面向現(xiàn)代，表現(xiàn)現(xiàn)實(shí)生活。

生物被膜細(xì)胞密度(cells/cm2)=區(qū)域內(nèi)細(xì)菌數(shù)(cells)/(區(qū)域個(gè)數(shù)×區(qū)域面積10-4cm2)。

1.2.4 厚殼貽貝稚貝附著試驗(yàn) 在培養(yǎng)皿中加入載有生物被膜的玻片，加入20 mL滅菌海水，放入10枚稚貝，每組設(shè)9個(gè)重復(fù)。在18 ℃、黑暗環(huán)境下培育，依據(jù)放入稚貝的時(shí)間分別觀察12、24、48 h的附著情況，并計(jì)算附著率(%)，即

附著率=載玻片上附著個(gè)數(shù)/總稚貝數(shù)×100%。

因12、24、48 h附著率結(jié)果基本相似，故本試驗(yàn)中僅出示24 h時(shí)的附著率結(jié)果。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡標(biāo)本染色 參考González-Machado等[18]的方法，用表1的染料進(jìn)行共聚焦避光染色，染色20 min，染色前后分別用0.9%生理鹽水清洗生物被膜，并計(jì)算生物量體積(μm3)，即

生物量體積=生物量總面積(Image J軟件處理)×層厚0.2 μm。

表1 激光共聚焦顯微鏡標(biāo)本染料成分及染色對(duì)象Tab.1 Dye composition and targets for confocal laser scanning microscopy

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均使用JMP 10.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及相關(guān)性檢驗(yàn)。在統(tǒng)計(jì)分析前，對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢測，滿足正態(tài)分布，則使用單因素方差分析。通過多元分析方法驗(yàn)證稚貝附著率和鈣離子濃度與細(xì)菌密度、膜厚、胞外產(chǎn)物生物量之間是否具有相關(guān)性，顯著性水平設(shè)為0.05。用Image J軟件處理共聚焦圖像，計(jì)算胞外產(chǎn)物共聚焦的面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然海水和人工海水形成的生物被膜細(xì)菌密度及稚貝附著率

從圖1A可見：在初始菌液濃度為1×106cells/mL條件下，自然海水形成的生物被膜細(xì)菌密度為1.24×106cells/cm2，人工海水形成的生物被膜細(xì)菌密度為1.19×106cells/cm2，二者間無顯著性差異(P>0.05)；隨著初始菌液密度的增加，自然海水和人工海水培養(yǎng)的生物被膜的細(xì)菌最終密度均呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(P<0.05)，且二者間終密度并無顯著性差異(P>0.05)。

從圖1B可見：初始菌液密度為1×106、1×107cells/mL條件下，加入稚貝24 h后自然海水和人工海水培養(yǎng)的生物被膜誘導(dǎo)的厚殼貽貝稚貝附著率與空白組的稚貝附著率(13.33%)相比，均無顯著性差異(P>0.05)；在初始菌液濃度為1×108cells/mL條件下，自然海水生物被膜的稚貝附著率為35.56%，人工海水生物被膜的稚貝附著率為36.67%，均顯著高于前兩個(gè)初始密度組(P<0.05)，但自然海水與人工海水兩組間稚貝附著率并無顯著性差異(P>0.05)；在初始菌液密度為5×108cells/mL條件下，自然海水和人工海水兩組間稚貝附著率并無明顯差異(P>0.05)，且與1×108cells/mL密度組也無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 不同鈣離子濃度下生物被膜的細(xì)菌密度

從圖2可見：人工海水形成的生物被膜在菌液初始密度全部為1×108cells/mL時(shí)，海假交替單胞菌生物被膜的細(xì)菌終密度在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)最高，為2.53×107cells/cm2；當(dāng)鈣離子濃度升高或降低時(shí)，生物被膜的終密度分別呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)，鈣離子濃度為50 mmol/L時(shí)生物被膜的細(xì)菌終密度最低，僅為1.63×107cells/cm2。

2.3 不同鈣離子濃度下生物被膜的稚貝附著率

從圖3可見：人工海水形成的生物被膜在菌液初始密度為1×108cells/mL條件下，加入稚貝24 h后，在鈣離子濃度為0、1 mmol/L時(shí)，稚貝附著率均為22.22%，與空白對(duì)照相比并無明顯差異(P>0.05)；隨著鈣離子濃度增加，稚貝附著率也呈現(xiàn)上升趨勢，在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)稚貝附著率達(dá)到最大值(35.56%)，隨后稚貝附著率開始下降，在鈣離子濃度為50 mmol/L時(shí)稚貝附著率僅為23.33%。

2.4 不同鈣離子濃度下生物被膜的形態(tài)與厚度

通過用共聚焦顯微鏡對(duì)不同鈣離子濃度下培養(yǎng)48 h的海假交替單胞菌生物被膜上細(xì)菌的分布形態(tài)進(jìn)行觀察(圖4A)，在鈣離子濃度為0 mmol/L時(shí)，細(xì)菌的分布最為稀疏，膜厚也較薄，僅有4.00 μm；當(dāng)鈣離子濃度增加到10 mmol/L時(shí)，細(xì)菌開始聚集，細(xì)菌密度逐漸增加，此時(shí)膜厚達(dá)到最大值，為5.62 μm；當(dāng)鈣離子濃度增加到50 mmol/L時(shí)，細(xì)菌數(shù)量逐漸減少至稀疏的狀態(tài)，生物被膜的厚度呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(P<0.05)(圖4B)。

2.5 不同鈣離子濃度對(duì)生物被膜胞外多糖的影響

通過共聚焦顯微鏡觀察不同鈣離子濃度下培養(yǎng)48 h的生物被膜的胞外多糖(圖5A、圖6A)，海假交替單胞菌生物被膜的胞外α多糖和β多糖的生物量在鈣離子濃度為0 mmol/L時(shí)最少，分別為32.28、34.55 μm3；在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)，胞外多糖的生物量增加至最多，其中胞外α多糖的生物量為258.35 μm3，胞外β多糖的生物量為174.74 μm3；隨著鈣離子濃度繼續(xù)升高，生物被膜的胞外多糖生物量呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)(圖5B、圖6B)。

2.6 不同鈣離子濃度對(duì)生物被膜胞外蛋白的影響

通過共聚焦顯微鏡觀察不同鈣離子濃度下培養(yǎng)48 h的生物被膜的胞外蛋白(圖7A)，海假交替單胞菌生物被膜胞外蛋白的生物量在鈣離子濃度為0 mmol/L時(shí)最少，為117.47 μm3；在鈣離子濃度為 10 mmol/L時(shí)，胞外蛋白的生物量升高至最多，為334.15 μm3；隨著鈣離子濃度繼續(xù)升高，生物被膜的胞外蛋白生物量呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)，并且除鈣離子濃度為10 mmol/L外，其余濃度下生物量均無顯著性差異(P>0.05)(圖7B)。

2.7 不同鈣離子濃度對(duì)生物被膜胞外脂類的影響

通過共聚焦顯微鏡觀察不同鈣離子濃度下培養(yǎng)48 h生物被膜的胞外脂類(圖8A)，海假交替單胞菌生物被膜胞外脂類的生物量在鈣離子濃度為0 mmol/L時(shí)最少，僅為11.52 μm3；在鈣離子濃度10 mmol/L時(shí)，胞外脂類的生物量上升至最多，為22.02 μm3；隨著鈣離子濃度的繼續(xù)升高，生物被膜的胞外脂類生物量呈顯著下降趨勢(P<0.05)，并且除鈣離子濃度為10 mmol/L外，其余濃度下的生物量均無顯著性差異(P>0.05)(圖8B)。

2.8 相關(guān)性分析

從表2可見：稚貝附著率與生物被膜細(xì)菌密度、膜厚、胞外多糖和胞外蛋白呈顯著相關(guān)(P<0.05)；鈣離子濃度僅與生物被膜膜厚呈顯著相關(guān)(P<0.05),與其他因子均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表2 生物被膜生物學(xué)特征與稚貝附著率、鈣離子濃度的相關(guān)性分析

3 討論

低鈣離子濃度能顯著誘導(dǎo)莫桑比克羅非魚的黏液細(xì)胞增殖，以抵抗外界脅迫[19]。同時(shí)，鈣離子濃度能顯著影響三角帆蚌的生長[20]。但是，目前尚未有試驗(yàn)驗(yàn)證鈣離子濃度對(duì)海假交替單胞菌生物被膜和厚殼貽貝稚貝附著的影響。

3.1 自然海水和人工海水的比較

由于本試驗(yàn)中要研究鈣離子濃度變化對(duì)海假交替單胞菌生物被膜和稚貝附著的影響，需要調(diào)節(jié)鈣離子的濃度，故使用人工海水來調(diào)節(jié)鈣離子濃度。與自然海水相比較，本試驗(yàn)中使用的人工海水在培養(yǎng)4個(gè)不同初始菌液密度下的海假交替單胞菌生物被膜形成中未產(chǎn)生任何顯著性影響。在4個(gè)不同初始菌液密度下，人工海水培養(yǎng)的細(xì)菌生物被膜的細(xì)菌密度與自然海水培養(yǎng)的生物被膜相比無顯著性的差異，兩種海水分別培養(yǎng)的細(xì)菌生物被膜對(duì)稚貝附著的誘導(dǎo)活性也均無顯著性差異。多次重復(fù)試驗(yàn)所得到的結(jié)果相同，表明該人工海水對(duì)于細(xì)菌生物被膜的形成具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性。說明該人工海水可用于本試驗(yàn)中替代自然海水進(jìn)行試驗(yàn)。另一方面，人類活動(dòng)會(huì)造成海水中氮元素、磷元素和石油類物質(zhì)超標(biāo)等污染問題[21]，海水養(yǎng)殖的品質(zhì)和效益受到海水水體污染影響，海洋環(huán)境污染會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖品種的質(zhì)量降低。因此，未來可以考慮使用人工海水替代天然海水進(jìn)行陸基人工養(yǎng)殖。

3.2 不同鈣離子濃度對(duì)生物被膜形成的影響

通過試驗(yàn)可以觀察到生物被膜細(xì)菌密度和生物被膜厚度在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，而在其他鈣離子濃度下均降低。依據(jù)共聚焦顯微鏡拍攝結(jié)果觀察，生物被膜在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)細(xì)菌呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，在其余鈣離子濃度下細(xì)菌分散且密度減少，生物被膜形成能力變差。對(duì)假交替單胞菌Pseudoalteromonassp.的研究也有相似的結(jié)果，在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)，Pseudoalteromonassp.生物被膜最厚，在其余濃度下生物被膜厚度均降低[11]，該試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

本研究中，依據(jù)相關(guān)性分析，鈣離子濃度僅與生物被膜膜厚顯著相關(guān)，生物被膜膜厚受到胞外產(chǎn)物生物量的影響。生物被膜的形成是連續(xù)的進(jìn)程，通過浮游細(xì)菌附著到表面上，然后形成生物被膜，其中細(xì)菌被包埋在由核酸、蛋白質(zhì)和多糖組成的基質(zhì)中[22-24]。在生物被膜中生長的細(xì)菌產(chǎn)生一種或多種胞外產(chǎn)物，它們會(huì)充當(dāng)支架，將生物被膜群落的細(xì)菌維持在一起；多糖是生物被膜基質(zhì)的主要組分，其有助于生物被膜的整體結(jié)構(gòu)及抗性[23, 25-26]。鈣離子對(duì)微生物各方面的影響，最終主要體現(xiàn)在生物被膜及其胞外產(chǎn)物的變化上[27]。在本試驗(yàn)中，將培養(yǎng)48 h的胞外產(chǎn)物進(jìn)行共聚焦顯微鏡拍攝，以驗(yàn)證鈣離子是否也影響胞外產(chǎn)物。生物被膜的3種胞外產(chǎn)物包括多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，多糖和蛋白質(zhì)在胞外產(chǎn)物中占主導(dǎo)地位。在鈣離子濃度10 mmol/L時(shí)，海假交替單胞菌生物被膜形成的胞外產(chǎn)物最多，而在其余濃度下，胞外產(chǎn)物減少。這些試驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)，過高或過低的鈣離子濃度均能影響生物被膜的形成。

3.3 不同鈣離子濃度培養(yǎng)的生物被膜對(duì)厚殼貽貝稚貝附著的影響

許多海洋無脊椎動(dòng)物幼蟲的附著變態(tài)可以被生物被膜影響[7]。皺紋和半透明兩個(gè)突變菌形成的假交替單胞菌生物被膜誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)的活性顯著降低，這表明具有較強(qiáng)的防污損能力[28]。本試驗(yàn)中，除10 mmol/L鈣離子濃度以外，其他鈣離子濃度培養(yǎng)的海假交替單胞菌生物被膜均抑制了厚殼貽貝稚貝的附著，即增加或減少鈣離子濃度，形成的生物被膜均可以減少稚貝的附著。

依據(jù)相關(guān)性分析，稚貝附著率與生物被膜密度、膜厚、胞外多糖和胞外蛋白顯著相關(guān)。參考Yang等[17]的方法，希瓦氏菌會(huì)促進(jìn)厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)，可能與其釋放的信號(hào)分子和胞外產(chǎn)物有關(guān)。胞外產(chǎn)物主要是多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，其提供了生物被膜的機(jī)械穩(wěn)定性，介導(dǎo)了與表面的黏附，構(gòu)成了一個(gè)內(nèi)聚的三維聚合物網(wǎng)絡(luò)[29]。生物被膜的胞外產(chǎn)物在除10 mmol/L鈣離子濃度以外的其他濃度下均減少，與稚貝附著率的變化趨勢一致，胞外產(chǎn)物的減少與稚貝附著率的減少有一定相關(guān)性。

對(duì)Pseudoalteromonassp.的研究發(fā)現(xiàn)，10 mmol/L鈣離子濃度導(dǎo)致其鞭毛蛋白表達(dá)量減少，外膜蛋白表達(dá)量增加，生物被膜形成能力增強(qiáng)[11]。大腸桿菌外膜蛋白OmpA已被證明可以結(jié)合非生物表面，OmpA在非生物表面上的生物被膜形成中起作用[30]。大腸桿菌ompA基因缺失突變菌形成的生物被膜厚度大大降低[31]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果推測，鈣離子可能影響了海假交替單胞菌外膜蛋白的表達(dá)量，從而抑制了胞外產(chǎn)物的分泌，進(jìn)而影響了生物被膜的形成和稚貝附著。

4 結(jié)論

1)鈣離子濃度高于或低于與自然海水最接近的濃度10 mmol/L時(shí)，均抑制了海假交替單胞菌生物被膜的形成。

2)過高或過低鈣離子濃度抑制了生物被膜密度、膜厚的形成，以及胞外多糖、胞外蛋白的分泌，進(jìn)而抑制了厚殼貽貝稚貝的附著。