瑞舒伐他汀鈣片含量測定方法研究*

朱生良，許鳳清，蔣 磊

(1 合肥凱石醫(yī)藥科技有限公司，安徽 合肥 230061；2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

瑞舒伐他汀鈣(rosuvastatin calcium)，商品名為Crestor(美國)，可定(中國)和冠脂妥(中國香港)，是新一代的羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，能顯著降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)[1]，具有強效降脂作用，臨床于治療高膽固醇血癥及混合型血脂異常相關(guān)性疾病[2-4]。瑞舒伐他汀鈣的相關(guān)物質(zhì)及降解雜質(zhì)復(fù)雜[5-6]，本文以4種常見雜質(zhì)為參照，研究瑞舒伐他汀鈣片HPLC測定方法，確保臨床用藥的有效性及安全性。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Waters alliance e2695高效液相色譜儀，2998二極管陣列檢測器，waters empower 3網(wǎng)絡(luò)版色譜工作站，美國Waters公司；MS-105DU電子天平，瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 試 藥

瑞舒伐他汀鈣對照品(歐洲藥品質(zhì)量管理局，批號：Y0001719)；瑞舒伐他汀鈣雜質(zhì)A對照品(TRC，批號：21-JHY-121-2)；瑞舒伐他汀鈣雜質(zhì)B對照品(MC，批號：170224，非對映異構(gòu)體)；瑞舒伐他汀鈣雜質(zhì)C對照品(TLC，批號：2097-053A2)；瑞舒伐他汀鈣雜質(zhì)D對照品((TRC，批號：2-CRD-105-1，5S-內(nèi)酯)；瑞舒伐他汀鈣片自制片(批號：180711、180720，規(guī)格：10 mg)；瑞舒伐他汀鈣片進口片(阿斯利康制藥有限公司，批號：131408，規(guī)格：10 mg，商品名：可定)。甲醇、乙腈為色譜純，實驗用水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters CORTECS C18色譜柱(50 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流動相A為0.01 mol/L乙酸銨水溶液(用三氟乙酸調(diào)pH值至3.5)，B為乙腈，梯度洗脫(0～13 min，24%～36% B；13～17 min，36%～38% B；17～20 min，38%～62% B；20～25 min，24% B)；體積流量：0.6 mL·min-1；檢測波長：242 nm；柱溫40 ℃，進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取瑞舒伐他汀鈣對照品26 mg，精密稱定。置100 mL棕色量瓶中，加乙腈25 mL，振搖，待溶解后加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液；取儲備液適量加乙腈-水(25:75)制成每1 mL約含0.05 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品10片，置1000 mL棕色量瓶中，加250 mL乙腈和等量的水振搖超聲使溶解，再加水稀釋至刻度，超聲15 min，搖勻，放冷至室溫，過濾，棄去初濾液3 mL，取續(xù)濾液適量用乙腈-水(25:75)稀釋制成每1 mL約含0.05 mg的溶液，0.22 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

稱取瑞舒伐他汀鈣對照品25 mg和雜質(zhì)A、B、C、D各2.5 mg，精密稱定，置100 mL棕色量瓶中，加乙腈-水(25:75)適量超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，取5 mL置25 mL棕色量瓶中，加乙腈-水(25:75)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液。同法配制單個雜質(zhì)對照品定位溶液。取上述溶液，照高效液相色譜法(中國藥典2015年版四部通則0512)按上述“2.1”項下色譜條件在242 nm波長處測定，分別各取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。瑞舒伐他汀峰與瑞舒伐他汀非對映異構(gòu)體峰(雜質(zhì)B)的分離度應(yīng)大于1.5，瑞舒伐他汀峰的拖尾因子應(yīng)小于1.2，理論塔板數(shù)不得低于10000。色譜圖見圖1。

圖1 瑞舒伐他汀鈣及雜質(zhì)A、B、C、D對照品單個溶液及混合溶液HPLC圖

2.5 檢測波長的選擇

取本品標(biāo)準(zhǔn)曲線項下中間濃度的對照品溶液在二極管檢測器上檢測的210～400 nm波長范圍內(nèi)掃描圖可知，本品在流動相中在241.5 nm處有最大吸收峰，同時參照本品已有國內(nèi)外瑞舒伐他汀鈣原料和片劑標(biāo)準(zhǔn)含量測定波長多為242 nm，故本品HPLC法也采用242 nm作為含量測定的檢測波長。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品儲備液適量置25 mL棕色量瓶中，分別加乙腈-水(25:75)配成含瑞舒伐他汀30、40、50、60、70 μg·mL-1的對照品溶液，搖勻。照高效液相色譜法(中國藥典2015年版四部通則0512)在242 nm波長處測定，流動相和梯度條件同上“2.1”項下，進樣10 μL，記錄色譜圖。以對照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線，回歸計算方程為Y=40795.19X+22306.72(r=0.9997，n=5)。結(jié)果表明，瑞舒伐他汀對照品溶液在30.01～70.03 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，截距與標(biāo)示濃度響應(yīng)值百分比(B/Y%)為1.08%，小于2.0%，符合要求。

2.7 精密度試驗

取上述“2.6”項下中間濃度的對照品溶液，按照上述“2.1”項下色譜條件測定，連續(xù)進樣 6 次，記錄色譜圖，考察主峰峰面積和保留時間的變化情況，考察儀器精密度?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：RSD≤1.0%[7]。結(jié)果，峰面積和保留時間的RSD%分別為0.172%和0.028%，符合要求，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗

按“2.4”項下供試品溶液制備方法，配制6份相同濃度的供試品溶液，按照“2.1”色譜條件測定，記錄色譜圖。同時用對照品溶液進行對照測定，按外標(biāo)法以峰面積計算6份供試品溶液中含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的重復(fù)性。可接受標(biāo)準(zhǔn)：RSD≤1.0%。結(jié)果，含量平均值為99.67%，RSD=0.42%，法重復(fù)性良好。

2.9 中間精密度實驗

對同一批次的瑞舒伐他汀鈣片(批號：180720)，在同一實驗室，分別在不同時間、不同儀器上，由不同實驗員操作，各平行配制6份，測定含量，對數(shù)據(jù)檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計算所得12個含量數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗證其中間精密度?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：RSD≤1.0%。按上述“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述“2.1”項下色譜條件測定。結(jié)果，12個含量數(shù)據(jù)平均值為 99.35%，RSD=0.66%。表明該方法中間精密度良好。

2.10 穩(wěn)定性實驗

按上述“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫放置 0，1，2，4，6，8 h按照上述“2.1”項下色譜條件測定，記錄瑞舒伐他汀鈣峰面積。結(jié)果，峰面積RSD=0.08%。表明，瑞舒伐他汀鈣片含量測定供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 回收率試驗

精密稱取空白輔料適量，精密加入一定量的瑞舒伐他汀鈣原料，按上述“2.4”項下供試品溶液制備方法操作(等比例縮小10倍)，使最終的樣品中含有的瑞舒伐他汀鈣(折干折純)濃度為標(biāo)示濃度的80%，100%，120%，每個濃度平行操作3份?；旌暇鶆颍瓷鲜觥?.1”項下色譜條件測定，考察檢測方法的準(zhǔn)確度。范圍：工作濃度的80%～120%?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：回收率應(yīng)在98%～101%，RSD≤2.0%。實驗結(jié)果表明本法回收率較好，輔料對測定方法基本沒有影響。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果(n=3)

2.12 定量限實驗

取瑞舒伐他汀鈣對照品適量，用乙腈-水(25:75)逐步稀釋配制成一系列濃度的溶液，調(diào)試色譜儀，待基線平穩(wěn)后精密量取不同濃度的對照品溶液各10 μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以信噪比為10:1作為本品定量限，并記錄色譜圖；結(jié)果本品的定量限濃度為0.077 μg·mL-1，約相當(dāng)于含量測定供試品濃度的0.15%。

2.13 耐用性實驗

實驗考察了不同柱溫、不同流速、不同流動相初始比例、流動相 A 的不同 pH值條件、緩沖鹽濃度和3種不同廠家的液相色譜儀，計算瑞舒伐他汀鈣的含量，驗證該方法的耐用性?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：RSD≤2.0%。結(jié)果表明柱溫在±2 ℃范圍變化、流速在±0.05 mL·min-1范圍變化、流動相比例在±1范圍變化、流動相A的pH值在± 0.1范圍變化、緩沖鹽濃度±10%范圍變化，以及變更Waters Arc、賽默飛U3000、Waters 2695和安捷倫1260等3個廠牌4種型號的液相色譜儀，瑞舒伐他汀鈣含量穩(wěn)定，RSD均小于1.0%，符合規(guī)定。表明該含量測定方法的耐用性良好。雖然改變流速、柱溫和流動相初始比例時，對主峰的保留時間影響較大，但不影響本品含量和雜質(zhì)與主峰的分離度以及其他已知雜質(zhì)分離度，說明本色譜條件耐用性較好。

2.14 樣品的含量測定

按上述“2.4”項下的供試品溶液及“2.2”項下的對照品溶液的配制方法，分別配制180720批樣品溶液和對照品溶液，各進樣10 μL，按上述“2.1”項下的色譜條件測定。按外標(biāo)法以峰面積分別計算樣品中的瑞舒伐他汀鈣的含量，平行3 份，結(jié)果分別為100.01%、99.31%和99.90%，平均值為 99.74%，RSD 為0.38%。見圖2。

圖2 瑞舒伐他汀鈣片HPLC色譜圖

3 討 論

3.1 流動相的選擇

考察了1%三氟乙酸溶液-乙腈、水-甲醇-乙腈、0.01 M乙酸銨溶液-乙腈和0.02%三氟乙酸溶液-乙腈等四種流動相系統(tǒng)，結(jié)果水-乙腈-0.01 M乙酸銨溶液能使瑞舒伐他汀鈣與雜質(zhì)B(非對映異構(gòu)體)和雜質(zhì)A得到基線分離，且能夠有效檢出雜質(zhì)C、D和2個光降解雜質(zhì)，峰型較好，各峰出峰時間早。因此，最終選擇流動相0.01 mol·L-1乙酸銨溶液(用三氟乙酸調(diào)pH值至3.5)-乙腈系統(tǒng)梯度洗脫達到目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)基線分離。

3.2 系統(tǒng)適用性溶液的制備

因瑞舒伐他汀鈣在pH 1.0鹽酸溶液不穩(wěn)定，降解生成瑞舒伐他汀非對映異構(gòu)體(雜質(zhì)B)、瑞舒伐他汀-5S-內(nèi)酯(雜質(zhì)D)和瑞舒伐他汀-5R-內(nèi)酯，后兩者經(jīng)堿中和處理后重新生成主成分及雜質(zhì)B[3]。實驗過程中，取瑞舒伐他汀鈣對照品2.6 mg置50 mL棕色容量瓶中，加入1%的三氟乙酸25%乙腈溶液10 mL，搖勻，置50 ℃水浴加熱1 h，放冷，加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液1.5 mL，搖勻，此溶液含有主成分和雜質(zhì)B，再加入雜質(zhì)A、C、D，用乙腈：水(25:75)配制成系統(tǒng)適用性溶液，此溶液雜質(zhì)峰檢出明顯，更有利于考察色譜條件的分離效果和其他雜質(zhì)的檢出情況，確保樣品中含有的雜質(zhì)成分在含量測定條件下能夠完全分離和洗脫，避免多次進樣后鬼峰和饅頭峰的出現(xiàn)，確保含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 供試品制備方法選擇

瑞舒伐他汀鈣見光不穩(wěn)定，實驗過程中發(fā)現(xiàn)本品在紫外光365 nm、陽光和自然光條件下均有兩個光降解雜質(zhì)峰產(chǎn)生，而在白熾燈和棕色瓶避光條件下均無光照峰產(chǎn)生(圖3)，依據(jù)光降解試驗結(jié)果供試品需避自然光操作或采用棕色瓶配制。另外采用原進口標(biāo)準(zhǔn)的方法對可定片(131408)研細(xì)后配制供試品測定結(jié)果偏低(95.44%)，而整片投料后配制供試品測定結(jié)果(99.23%)符合要求。故本品含量測定供試品配制應(yīng)采用整片投料，棕色瓶避光操作。根據(jù)本品有關(guān)物質(zhì)項下的研究結(jié)果顯示，雜質(zhì)D在甲醇溶液中易降解生成雜質(zhì)D-甲酯峰，故本品供試品配制溶劑不宜選擇甲醇，應(yīng)采用不含醇羥基的乙腈水溶液進行配制，也進一步驗證本品處方工藝研究不宜采用含醇的濕法制粒壓片工藝，而應(yīng)采用粉末直接壓片工藝。

圖3 光降解試驗HPLC圖譜

3.4 色譜柱的選擇

本實驗采用短的細(xì)粒徑色譜柱，與國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)(EP9.0原料標(biāo)準(zhǔn)和進口片劑標(biāo)準(zhǔn)JX20030283)使用長150 mm或250 mm的粗粒徑色譜柱相比(最后一個雜質(zhì)D出峰在40～50 min)，具有出峰時間快(最后一個雜質(zhì)D出峰在14～18 min)、分離效果好、柱效高的特點，大大縮短了分析時間，節(jié)省了溶劑；另實驗中比較了不同廠家不同品牌的細(xì)粒柱，按“2.4”項下系統(tǒng)適用性實驗進行雜質(zhì)峰與瑞舒伐他汀鈣分離度考察。結(jié)果，沃特世色譜柱分離效果強，各降解峰均能檢出，降解物與主成分分離度符合規(guī)定。為保證方法的準(zhǔn)確、可靠，本實驗規(guī)定采用Waters CORTECS(50 mm×4.6 mm，2.7 μm)進行含量分析。

4 結(jié) 論

本文建立的瑞舒伐他汀鈣片的HPLC測定方法，經(jīng)方法學(xué)實驗，其專屬性、重現(xiàn)性及回收率均較好，適用于以瑞舒伐他汀鈣片原料藥和成品的質(zhì)量檢測。