不同提取及測定方法對中藥紫草組方抗氧化性比較*

王循浩，尹楠翔，李 倩，顧蘊鈺，張春平

(1 徐州醫(yī)科大學臨床醫(yī)學系，江蘇 徐州 221004；2 徐州醫(yī)科大學藥學院，江蘇 徐州 221004)

中藥紫草的藥理價值已得到廣泛的應用，如消炎[1]、抗菌[2]、止血[3]、抗病毒[4]、抗腫瘤[5]、免疫調節(jié)[6]等，但中藥的應用講究互相調和和合理配伍[7]，《神農本草經》中提出“上藥一百二十種為君，主養(yǎng)命；中藥一百二十種為臣，主養(yǎng)性；下藥一百二十五種為佐使，主治病；用藥須合君臣佐使”。為了使紫草能有更好的臨床療效，本實驗在傳統(tǒng)紫草單一應用的基礎上結合其他傳統(tǒng)中藥探討紫草為主的中藥組方的抗氧化作用，進一步分析紫草的臨床價值。但目前對紫草抗氧化性的測定多是采用的單一紫草提取物作為藥液，而對于紫草組方的分析少有報道。本實驗通過DPPH法和PTIO法比較了兩者的抗氧化性，同時討論了兩種組方、不同藥液濃度及去離子水和無水乙醇兩種提取媒介對其自由基清除效果的影響。實驗表明紫草中藥組方相對于單一紫草而言不僅有更好的抗氧化作用，其應用價值也更加廣泛，且通過去離子水的提取物抗氧化效果更佳。因此，本實驗有望能為紫草的拓展應用找到一條更全面更有效的途徑。

1 材料與儀器

1.1 中藥材料

組方1：軟紫草20 g、血竭12 g、乳香4 g、沒藥4 g、黃芪6 g、當歸8 g、防風4 g、生地4 g、黃連4 g、苦參4 g、大黃4 g、金銀花4 g、地榆4 g、紅花4 g，共計86 g；

組方2：軟紫草20 g、血竭12 g、乳香4 g、沒藥4 g、黃芪6 g、當歸8 g、防風4 g、生地4 g、黃芩4 g、黃柏4 g、大黃4 g、白芷4 g、牡丹皮4 g、丁香4 g，共計86 g。

1.2 試 劑

無水乙醇，上海凌峰化學；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，Sigma；3-氧代-2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧，Sigma；磷酸二氫鉀，上海凌峰化學。

1.3 儀 器

N1300D-WB旋轉蒸發(fā)儀，東京理化；UV-2550紫外分光光度計，島津。

2 實驗方法

2.1 提 取

按上述配方稱取組方中的中藥組方1和組方2各兩份，分別放入4個500 mL的圓底燒瓶中。每個組方的燒瓶中分別加入適量無水乙醇和去離子水直至所有藥材都被浸泡在內。將放有藥品的500 mL圓底燒瓶放入電熱套內，用電熱套進行加熱，控制溫度使其保持微沸并持續(xù)2 h。加熱結束后取出提取液之燒杯中，再次向圓底燒瓶中分別加入適量無水乙醇和去離子水，再次加熱2 h，加熱完成后，去除藥渣，保留液體提取物倒入燒杯中并混合兩次提取物。至此，應獲得4組提取液，分別為組方1醇提物、組方1水提物、組方2醇提物、組方2水提物。

2.2 濃 縮

將提取物放入1000 L的圓底燒瓶中，利用旋轉蒸發(fā)儀分別將無水乙醇和去離子水蒸出，使藥液逐漸濃縮，直至燒瓶內的藥液變稠。將濃縮后的藥液倒入小燒杯中，分別用無水乙醇和去離子水定容至50 mL，最后獲得四組提取物濃縮液。

2.3 抗氧化測定DPPH法

DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，DPPH自由基有單電子，在520 nm處有一強吸收峰，其醇溶液呈紫色?？寡趸瘎┠苁箚坞娮优鋵?，從而使A520 nm值降低，溶液褪色。由于這種顏色變化與其接受電子數量成定量關系，因而可在517 nm處測定其吸光度據此判斷自由基的清除情況，從而評價實驗藥液的抗氧化能力，此能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越強[8]。

配制DPPH溶液：分析天平稱取DPPH 0.0250 g，加無水乙醇用容量瓶定容至50 mL，得0.5 g/L DPPH溶液50 mL，用移液管移取上述溶液10 mL，無水乙醇稀釋至100 mL，得0.05 g/L DPPH溶液。

配制樣品液：分別將0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、1.2、1.5 mL的藥液用無水乙醇稀釋至50 mL獲得樣品液。

表1 DPPH法抗氧化性測定實驗分組

按上述表格在試管中分組加入相應試劑后避光反應，分別在30 min和60 min后用分光光度儀在517 nm處測量吸光度。平行實驗3次。按下述公式計算清除率：

2.4 抗氧化測定PTIO法

PTIO自由基有單電子，在557 nm處有一強吸收，其水溶液呈紫色?？寡趸瘎┠苁箚坞娮优鋵Γ瑥亩?A557 nm值降低，溶液褪色。由于這種變化其接受電子數量成定量關系，因而可用分光光度計進行測量。PTIO的自由基穩(wěn)定性比DPPH更強，為了較好的實驗效果可以加熱或延長反應時間[9]。

配制樣品液：分別將0.0625、0.125、0.25、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4 mL的藥液用無水乙醇稀釋至50 mL獲得樣品液。

配制pH 7.4的PBS溶液：取磷酸二氫鉀1.36 g，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液79 mL，用水稀釋至200 mL，配制好之后低溫儲藏[10]。

配制PTIO的PBS溶液：分析天平稱取PTIO 0.0250 g，加PBS溶液定容至50 mL。移液管移取儲備液10 mL，加PBS至100 mL，得0.05 g/L PTIO的PBS溶液。

表 2 PTIO法抗氧化性測定實驗分組

按上表將溶液配置好加入試管后，封口放入37 ℃恒溫箱中反應2 h。之后用分光光度儀在557 nm處測定吸光度，平行試驗3次，按下面的公式計算供試藥液PTIO自由基清除率：

3 結果與討論

3.1 DPPH法結果

實驗表明：以藥液量0.5 mL為例實驗數據如下，組方1(水提、反應30 min)清除率為91.91%，組方2(水提，反應30 min)清除率為91.69%，組方1(醇提，反應30 min)清除率為68.9%，組方2(醇提，反應30 min)清除率為92.68%，組方1(水提，反應60 min)清除率為91.69%，組方2(水提，反應60 min)清除率為91.82%，組方1(醇提，反應60 min)清除率為74.84%，組方2(醇提，反應60 min)清除率為94.65%。分析如下：以去離子水為溶劑提取的藥液與DDPH反應，60 min組的自由基清除率與反應30 min組無明顯差別，組方1與組方2無明顯差別；以無水乙醇為溶劑提取的藥液與DPPH反應，60 min組的自由基清除率高于反應30 min組，組方2的清除率大于組方1；從兩種提取溶劑方面比較可以發(fā)現，同等量的藥液，組方1用去離子水提取獲得的藥液抗氧化性明顯優(yōu)于用無水乙醇提取所獲得藥液。組方2用無水乙醇提取所獲得藥液略優(yōu)于用去離子水提取獲得的藥液。

圖1 DPPH法組方抗氧化性測定結果

3.2 PTIO法結果

數據表明：以0.5 mL藥液為例數據如下：組方1(水提，37 ℃，2 h)清除率61.92%，組方2(水提，37 ℃，2 h)清除率66.23%，組方1(醇提，37 ℃，2 h)清除率27.42%，組方2(醇提，37 ℃，2 h)清除率44.03%。分析如下：通過PTIO法測定的自由基清除表明，用去離子水為溶劑提取的組方2藥液抗氧化能力略優(yōu)于組方1，用無水乙醇為溶劑提取的組方2藥液抗氧化能力略優(yōu)于組方1，從兩種提取溶劑角度比較同等藥液量前提下，以去離子水為溶劑提取的藥液抗氧化能力較強。

圖2 PTIO法組方抗氧化性測定

3.3 用DPPH法和PTIO法測軟紫草的自由基清除率

按上述方法稱量86 g軟紫草，以上述方法提取、濃縮、定容后獲得藥液，再用DPPH和PTIO法測量其自由基清除率。結果表明：根據DPPH法測定的軟紫草提取物自由基清除率數據表明，以去離子水或是無水乙醇為溶劑進行提取對軟紫草提取物的抗氧化性并無明顯的影響。

圖3 DPPH法紫草抗氧化性測定

根據PTIO法的測量結果表明醇提物的自由基清除率高于水提物。但在實驗過程中發(fā)現，當樣品濃度逐漸增高時，PTIO法測得的自由基，清除率數據愈發(fā)不穩(wěn)定，測量結果的準確性下降。

圖4 PTIO法紫草抗氧化性測定

4 結 論

本實驗通過DPPH、PTIO兩種方法測定了以軟紫草為主的中藥組方的抗氧化能力，并考察了以去離子水和無水乙醇為溶劑的兩種提取方式對其自由基清除能力的影響，實驗數據表明，在以這個中藥組方作為原料進行提取時，以去離子水為溶劑進行提取所獲得藥液其抗氧化能力更強，且本實驗給出的兩種組方中，組方2的抗氧化性能高于組方1。在單純軟紫草提取時，本實驗提取所用的溶劑并不影響它的抗氧化性。因此在實際應用中藥組方時，應當選擇合適的提取方法以發(fā)揮最大的藥用價值[11]傳統(tǒng)紫草用于臨床時，通常發(fā)揮其抗炎、止血等功效，但用于外傷時，單純的紫草提取物對傷口的愈合作用有限，跟據傳統(tǒng)中醫(yī)的用藥觀念，君一臣二，制之小也。君二臣三佐五，制之中也。君一臣三佐九，制之大也。根據“君臣佐使”配合用藥在臨床上常有更好的療效[12]，本實驗的分析數據也表明，將紫草作為君藥配成中藥組方并不會影響其抗氧化能力，并且因為組方用藥賦予了其更加廣泛的應用前景，如皮膚燒傷、壓瘡等外傷的治療方面，在發(fā)揮抗炎抗菌作用的同時，也起到了去腐生肌、鎮(zhèn)痛等作用[13]，還有可加快創(chuàng)面的愈合，減輕患者的痛苦和經濟負擔，無不良反應等優(yōu)勢[14]。因此在臨床應用中，中藥組方相較與單一中草藥有更廣泛的應用價值。