基于轉錄組的三月李及其紅肉突變體Expansin基因家族鑒定及分析

方智振，林炎娟，姜翠翠，周丹蓉，潘少霖，葉新福

（福建省農業(yè)科學院果樹研究所/福建省落葉果樹工程技術研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】李（Prunus salicinaLindl.）是我國重要的傳統(tǒng)果樹。李果實美麗誘人，風味獨特，且具有很高的營養(yǎng)價值，深受消費者喜愛。成熟的李果實易軟化，難以貯藏運輸，不利于優(yōu)質鮮食李產業(yè)的發(fā)展。細胞壁結構變化是導致成熟果實軟化的重要原因[1]。Expansin 作為調節(jié)細胞壁的松弛和伸展的一類重要蛋白質，在柿（Diospyros kakiL.‘Fuping Jianshi’）[2]、芒果（Mangifera indicacv. Dashehari）[3]、番荔枝（Annona cherimolaMill）[4]、番茄（Solanum lycopersicum）[5?7]、山番木瓜（Vasconcellea pubescens）[8]和草莓（Fragaria×ananassa）[9]果實成熟和軟化中發(fā)揮著重要的作用。因此，系統(tǒng)地鑒定和分析李Expansin家族基因對進一步研究Expansin家族基因在李果實成熟過程中的作用具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】Expansin 是一類廣泛存在于植物中的細胞壁酶，它通過破壞細胞壁多糖之間的非共價鍵參與細胞壁松弛和伸展調節(jié)[10-11]。Expansin 由一個多基因家族編碼，該家族由EXPA（α-expansin）、EXPB（β-expansin）、EXPLA（expansin-like A）和EXPLB（expansin-like B）等4 個亞家族組成[12]。典型的Expansin 蛋白質在N 端有一個長度為20～30 個氨基酸殘基的信號肽和具有多個保守的半胱氨酸殘基和HFD 基序的domain1，C 端含有一個與第二組花粉過敏原蛋白同源的多糖結合結構域[13?15]。大量研究表明Expansin 與植物細胞生長[16]、葉片生長發(fā)育[17?18]、根系發(fā)育[19?20]、果實發(fā)育和質地變化[21?26]等諸多生物學過程密切相關。此外，Expansin 還與脫落酸、赤霉素、生長素、油菜素內酯和乙烯等植物激素引起的細胞膨大和細胞壁結構改變有關[27?30]。目前，科研人員已對多種植物的Expansin基因家族進行鑒定與分析，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）[31]、煙草（Nicotiana tabacum）[32]、水 稻（Oryza sativa）[33]、小 麥（Triticum aestivum）[14,34]、 番 茄（Solanum lycopersicum）[35]、楊樹（Populus trichocarpa）[36]、葡萄（Vitis vinifera）[37]、蘋果（Malus×domestica）[38]、桃（Prunus persica）[39]和棗（Ziziphus jujubaMill.）[13]?！颈狙芯壳腥朦c】Expansin 在果實發(fā)育和成熟中的重要作用已有相關研究，但李Expansin基因家族的鑒定和分析尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以三月李，以及課題組在前期研究中通過對三月李進行輻射誘變獲得的一個果實性狀發(fā)生顯著變化的遲熟突變體[40]為材料，采用生物信息學方法從三月李及其紅肉突變體果實成熟過程的轉錄組數(shù)據(jù)中鑒定李Expansin家族基因，并對其蛋白質特征、系統(tǒng)進化關系及其在三月李和遲熟突變體果實成熟過程中的表達模式進行比較分析，為研究李Expansin家族基因在果實成熟過程中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及Expansin家族基因的鑒定

本研究所使用的數(shù)據(jù)為本課題組獲得的三月李（盛花后95、105 和115 d）及其紅肉突變體（盛花后95、105、115 和125 d）的轉錄組數(shù)據(jù)[41]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）和毛果楊（Populus trichocarpa）的Expansin 蛋白質序列從EXPANSIN CENTRAL（http://www.personal.psu.edu/fsl/ExpCentral/）下載。以擬南芥、水稻和毛果楊Expansin 蛋白質序列為查詢序列，采用TBtools[42]的BLAST 工具從三月李及其紅肉突變體蛋白質數(shù)據(jù)庫中檢索Expansin 家族成員。同時，從Pfam 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）下載DPBB_1 和Pollen_allerg_1 結構域的HMM 模型PF03330 和PF01357，并采用HMMER3.0 鑒定含有保守結構域DPBB_1 和Pollen_allerg_1 的蛋白質。

1.2 Expansin 家族分析

Expansin 家族蛋白質生物信息學分析、保守基序分析與多重序列比對、系統(tǒng)進化樹的構建、基因的差異表達模式分析參考文獻[40]進行。

2 結果與分析

2.1 三月李及其紅肉突變體Expansin基因家族的鑒定及蛋白質特性分析

為了鑒定三月李及其紅肉突變體的Expansin 家族成員，以擬南芥（35 個）、水稻（58 個）和毛果楊（36 個）Expansin 家族成員的蛋白質序列為查詢序列，通過BLAST 分析從三月李及其紅肉突變體蛋白質數(shù)據(jù)庫中檢索Expansin 蛋白質，初步鑒定出35 個Expansin 蛋白質（E-value＜1e?5）。隨后，采用隱馬爾可夫模型進行Expansin 蛋白質鑒定，去除不含保守結構域DPBB_1 和Pollen_allerg_1 的蛋白質。最終得到33 個Expansin 家族蛋白質（表1）。除了EVM0014217，其余Expansin基因均包含完整的編碼序列。李Expansin 蛋白質序列的長度在176（EVM 0014217）～460 aa（EVM0020356），預測蛋白的相對分子量在19.21～51.33 kD，等電點介于4.62～9.83。蛋白質不穩(wěn)定系數(shù)分析結果表明，除了EVM0026183、EVM0000548、 EVM0026545、 EVM0018557、 EVM 0001651 和EVM0020356，其余李Expansin 蛋白質的不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，表明大部分李Expansin 蛋白質均為穩(wěn)定蛋白；平均親水系數(shù)均為負數(shù)，表明33 個蛋白質均為親水蛋白質。亞細胞定位預測結果表明，除了EVM0020356 可分布于質膜與細胞外，其余李Expansin 蛋白質均位于細胞外。

表 1 三月李及其紅肉突變體Expansin 蛋白質的理化性質和亞細胞定位Table 1 Physicochemical properties and subcellular localization of Expansins in Sanyueli plum and its red-flesh mutant

2.2 三月李及其紅肉突變體Expansin 家族蛋白質進化分析

為了解三月李及其紅肉突變體Expansin 家族蛋白質與桃、擬南芥和水稻的進化關系，采用MEGAX軟件構建了擬南芥、水稻、桃和李Expansin 家族蛋白質的系統(tǒng)進化樹。如圖1 所示，擬南芥、水稻、桃和李Expansin 家族蛋白質可分為4 組，分別為EXPA、EXPB、EXPLA 和EXPLB。從圖1 可以看出，每個桃Expansin 蛋白質都有與其對應的同源李Expansin蛋白質。EXPA 的李Expansin 家族蛋白質數(shù)量最多，共有22 個。其次為EXPB，共含有6 個李Expansin家族蛋白質；僅有1 個李Expansin 蛋白質（EVM 0024996）屬于EXPLA 組。EVM0026062、EVM0028340、EVM0003805 和EVM0013160 屬于EXPLB 組。

圖 1 李、桃、擬南芥和水稻Expansin 家族蛋白質系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Expansin family in plum, peach,Arabidopsis, and rice

2.3 三月李及其紅肉突變體Expansin 家族蛋白質保守結構域分析

對李Expansin 蛋白質的保守結構域進行分析，發(fā)現(xiàn)33 個李Expansin 蛋白質均含有DPBB_1 和Pollen_allerg_1 結構域（圖2）。為了進一步了解李Expansin 蛋白質的保守結構域，利用在線軟件MEME 對李Expansin家族蛋白質進行分析，結果表明李Expansin 家族蛋白質共含有15 個保守基序（圖3）。Expansin 蛋白質含有的基序數(shù)量從5～10 個不等。其中，EVM0011615、EVM0028371、 EVM0001651、 EVM0006851、 EVM 0022596 和EVM0026545 含有的基序數(shù)量最多（10個），EVM0014217 含有的基序數(shù)量最少（5 個）。所有李Expansin家族蛋白質均含有基序3 和5（圖3）。除了EVM0014217 之外，其他李Expansin 家族蛋白質均含有基序1 和7（圖3）?；? 是EXPA 成員特有的基序，基序10 為EXPB、EXPLA 和EXPLB 成員特有的基序，基序12 為EXPLA 和EXPLB 成員特有的基序（圖3）。含有基序14 的Expansin 蛋白質數(shù)量最少，僅3 個EXPLB 成員（EVM0026062、EVM0028340和EVM0003805）含有該基序，EXPA、EXPB 和EXPLA均不含該基序（圖3）。

圖 2 Expansin 家族蛋白質進化樹及保守結構域分析Fig. 2 Phylogenetic tree and conserved domain of Expansin family

圖 3 李Expansin 家族蛋白質保守基序及結構域序列Logo Fig. 3 Conserved motifs and domain sequence logo of Expansin family

為了分析家族蛋白質保守結構域的特征，采用DNAMAN7 對Expansin 家族蛋白質進行多重序列比對分析。結果表明大多數(shù)Expansin 蛋白質由3 個部分（信號肽、Domain1 和Domain3）組成。大部分EXPA 成 員（EVM0016777 除 外）和 EXPB 成 員（EVM0016078 除外）在Domain1 部分都含有一個保守的HFD 基序，而EXPLA 和EXPLB 在對應位置的特征序列則分別為DFV 和DFI（圖4）。HFD 基序兩側存在兩個插入片段，分別為EXPA 的α-Insertion和EXPB、EXPLA 和EXPLB 特有的插入片段（圖4）。李Expansin 家族蛋白質含有多個保守的半胱氨酸和色氨酸（圖4）。

圖 4 李Expansin 家族蛋白質的多重序列比對Fig. 4 Multiple sequence alignment analysis on Expansin family

2.4 Expansin家族基因在三月李及其紅肉突變體果實成熟過程中的表達模式分析

對33 個Expansin家族基因的表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)三月李及其紅肉突變體果實成熟過程中僅有9 個Expansin基因存在差異表達，包括7 個EXPA（EVM0015785、EVM0010710、EVM0022202、EVM0002390、EVM0016777、EVM0018557 和EVM 0001651）、1 個EXPB（EVM0016078）和1 個EXPLA（EVM0024996）（圖5）。三月李果肉中EVM0015785和EVM0016777 的表達量隨果實成熟逐漸降低，但其表達量在紅肉突變體果實成熟過程中無顯著變化。EVM0010710 和EVM0022202 在成熟三月李果肉中的表達量也顯著降低，而在成熟紅肉突變體果肉中的表達量明顯升高。紅肉突變體果肉中EVM0002390的表達量隨果實成熟而升高，但其表達量僅在花后105 d的三月李果肉中顯著升高，花后115 d的三月李果肉中的表達量又下降至與花后95 d 相當?shù)乃健３墒烊吕罟庵蠩VM0024996 的表達量顯著升高，而在紅肉突變體果實成熟過程中無顯著變化。

圖 5 Expansin家族基因在三月李及其紅肉突變體果實成熟過程中的表達模式Fig. 5 Expression pattern ofExpansinsin Sanyueli plum and its red-flesh mutant during fruit ripening

3 討論與結論

Expansin 不僅是在植物生長發(fā)育諸多方面都發(fā)揮著重要生物學功能的細胞壁蛋白[17,18,20,22?26]，還是研究植物發(fā)育進化的重要候選基因[34,37,43]。因此，Expansin 獲得了廣泛的關注。本研究從三月李及其紅肉突變體果實成熟過程的轉錄組中鑒定出33 個Expansin基因，少于玉米（Zea myas, 93 個）[44]、小麥（Triticum aestivum, 87 個）[34]、水稻（Oryza sativa,58 個）[33]、煙 草（Nicotiana tabacum, 52 個）[32]、番茄（Solanum lycopersicum, 43 個）[38]、蘋果（Malus×domestica, 41 個）[38]、 楊 樹（Populus trichocarpa,36 個）[36]、黃瓜（Cucumis sativus, 35 個）[45]和模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana, 35 個）[31]，但多于棗（Ziziphus jujubaMill., 30 個）[13]、 葡 萄（Vitis vinifera, 29 個）[37]及其近緣物種桃（Prunus persica,27 個）[39]。李的近緣物種桃的27 個Expansin 蛋白質在李轉錄組中均能找到對應的同源蛋白質，可見本研究鑒定的Expansin基因家族完整性較高，但李基因組中Expansin基因的準確數(shù)量還有待通過基因組數(shù)據(jù)分析進一步確定。研究表明不同Expansin 亞家族的成員數(shù)量存在很大的差異[32]，且大多數(shù)情況下EXPA 的數(shù)量多于EXPB 的數(shù)量[46]。李Expansin 家族的成員組成（22 個EXPA、6 個EXPBs、1 個EXLA和4 個EXLB）與擬南芥（26 個EXPA、5 個EXPB、3 個EXLA 和1 個EXLB）相近，但與水稻（34 個EXPA、19 個EXPB、4 個EXLA 和1 個EXLB）之間存在較大的差異。不同植物間Expansin 家族成員數(shù)量和組成的差異可能與植物生長發(fā)育和環(huán)境適應的不同要求而引起的生物進化有關[35]。

33 個李Expansin基因中有9 個在三月李及其紅肉突變體果實成熟過程中存在差異表達，且表達模式各異。Lu 等[35]研究發(fā)現(xiàn)不同番茄Expansin家族基因在果實中的表達模式也存在較大的差異。Expansin家族基因在三月李及其紅肉突變體果肉中存在多樣的表達模式意味著這些基因在果實成熟過程中可能扮演著不同的角色。番茄（Solanum lycopersicum）[47]、草莓（Fragaria×ananassa）[48]、杏（Prunus armeniacaL.）[49]、 桃（Prunus persica）[50]、 香 蕉（Musa acuminate）[51]和山番木瓜（Vasconcellea pubescens）[8]等的研究均表明Expansin的表達與果實軟化有關。Palapol 等[24]研究發(fā)現(xiàn)DzEXP1和DzEXP2的表達與榴蓮果實軟化呈正相關，乙烯可促進果肉軟化和二者的表達，而1-MCP 則抑制果肉軟化和二者的表達。抑制Sl-EXP1的表達可顯著提高番茄果實的硬度，而超表達Sl-EXP1則使番茄果實變軟[5,25]。這些

研究均表明Expansin直接或間接參與果實軟化。成熟的三月李及其紅肉突變體果肉均迅速變軟。但值得注意的是，本研究鑒定的9 個差異表達Expansin的表達均未呈現(xiàn)與三月李及其紅肉突變體果實成熟和軟化一致的趨勢。Zerpa-Catanho 等[52]在番木瓜上也發(fā)現(xiàn)了類似結果，分析了成熟相關基因與采后番木瓜軟化的關系，發(fā)現(xiàn)Expansin與果實軟化不存在相關性。不同植物Expansin在果實成熟軟化過程中的功能差異可能與物種有關。Expansin在李果實成熟過程中的具體功能及其是否直接參與李果實軟化過程還有待進一步研究。

本研究通過生物信息學分析從三月李及其紅肉突變體果實成熟過程的轉錄組數(shù)據(jù)中鑒定出33 個Expansin家族基因，并對Expansin 蛋白質的特征和基因表達模式進行分析，為今后進一步研究Expansin家族基因在李果實成熟過程中的功能奠定基礎。