基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究益智仁治療阿爾茲海默癥的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制

夏 珊 李倩茹 李生茂*

1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所，四川 南充 637000

阿爾茨海默癥(Alzheimer Disease，AD)是一種嚴(yán)重不可逆的神經(jīng)退化性疾病，主要表現(xiàn)為記憶力減退和認(rèn)知功能障礙[1]。在我國，60歲及以上老年群體中的AD的發(fā)病率達(dá)6.3%，80歲及以上則高達(dá)30%[2]，隨著我國人口老齡化的日益嚴(yán)重，AD的患病人數(shù)還將不斷上升[3]。目前，臨床治療AD的常用藥物主要有美金剛等N-甲基-D-天冬氨酸受體抑制劑以及他克林、多奈哌齊等乙酰膽堿抑制劑[4]，可在一定程度上改善或緩解患者的癥狀，但無法阻止AD的進(jìn)程[1]，并會(huì)引起惡心、嘔吐、失眠、幻覺及焦慮等不良反應(yīng)[5]。因此，尋找不良反應(yīng)更小、療效更佳的藥物已成為AD治療藥物的研究熱點(diǎn)之一。

益智仁為姜科植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.干燥成熟的種仁，具有溫脾止瀉攝唾，暖腎固精縮尿的功效，傳統(tǒng)中醫(yī)將其用于治療腎虛遺尿，小便頻數(shù)，遺精白濁和脾寒泄瀉等[8]?，F(xiàn)代中醫(yī)臨床還常將益智仁用于治療AD，如益智醒腦方[9]、健脾補(bǔ)腎益智方[10]、清心益智湯[11]等含有益智仁的復(fù)方，可有效改善AD患者認(rèn)知功能，提高生活質(zhì)量。藥理研究[12-14]發(fā)現(xiàn)，益智仁多種溶劑提取物，以及從益智仁中的原兒茶酸、白楊素和益智酮B等化學(xué)成分 具有較好的神經(jīng)保護(hù)、提高記憶力和改善認(rèn)知功能障礙的作用，表現(xiàn)出了巨大的治療AD的潛力。但其治療AD的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制尚不十分清楚，有待更深入的研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是目前藥理學(xué)研究領(lǐng)域的新方法，是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析的新學(xué)科[15]，其研究理念與中藥多組分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同調(diào)節(jié)的作用模式極為契合[16]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對益智仁治療AD的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行了研究，以期為中藥益智仁臨床治療AD提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)；TCMID數(shù)據(jù)庫(http://www.megabionet.org/tcmid/)；GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)；OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)；Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)；Pubmed數(shù)據(jù)庫(http://pubmed.cn)；SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://old.swisstargetprediction.ch/)；KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp)；Drug Bank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)；String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)；Rstudio4.0.0；UltraEdit27.00.0.22；Cytoscape3.6.1。軟件運(yùn)行環(huán)境：Microsoft Windows10& HomeBasic操作系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 益智仁潛在活性成分的收集及前處理 首先通過TCMSP 和TCMID數(shù)據(jù)庫中檢索益智仁(Alpinia oxyphylla)獲取兩個(gè)數(shù)據(jù)庫收錄的化學(xué)成分，然后根據(jù)口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)和類藥性(Druglike，DL)進(jìn)行篩選，得到OB≥30%，DL≥0.18的潛在活性成分，同時(shí)查閱文獻(xiàn)，得到兩個(gè)數(shù)據(jù)庫未收載的潛在活性成分。在Pubchem數(shù)據(jù)庫上獲取所有潛在活性成分的中英文名稱，再通過TCMSP和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫下載益智仁潛在活性成分靶點(diǎn)，最后在uniprot 數(shù)據(jù)庫中將益智仁潛在活性成分的靶點(diǎn)信息與人類基因名稱相對應(yīng)。

1.2.2 AD靶點(diǎn)及“益智仁-AD”共同作用靶點(diǎn)的獲取 首先在GeneCards 數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫輸入關(guān)鍵詞“Alzheimer’s Disease”獲得AD相關(guān)的基因，將基因名稱去重、統(tǒng)一后得到AD靶點(diǎn)，然后將AD靶點(diǎn)與“1.2.1”項(xiàng)下對應(yīng)的人類基因名稱進(jìn)行映射得到“益智仁-AD”共同作用靶點(diǎn)。

1.2.3 “益智仁-潛在活性成分-相關(guān)靶點(diǎn)-AD”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 刪除益智仁中無對應(yīng)靶點(diǎn)的化學(xué)成分，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape3.6.1，構(gòu)建益智仁和潛在活性成分所對應(yīng)的相關(guān)靶點(diǎn)及AD的網(wǎng)絡(luò)圖，其中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)表示益智仁、益智仁活性成分、相關(guān)靶點(diǎn)或AD，邊代表兩節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)(益智仁-AD靶點(diǎn)蛋白相互作用)的構(gòu)建 在String 數(shù)據(jù)庫中輸入“1.2.2”項(xiàng)下得到的“益智仁-AD”共同作用靶點(diǎn)的名稱，選擇物種(Organism)為人(Homo sapiens)，篩選結(jié)合分?jǐn)?shù)>0.4的連接關(guān)系并去除孤立節(jié)點(diǎn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 GO功能注釋和KEGG通路富集分析 在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中將“益智仁-AD”靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)化成Uniprot ID，并在Bioconductor數(shù)據(jù)庫工具平臺下載biocLite.R、clusterProfiler.R和pathview.R包，利用Rstudio(4.0.0)軟件，設(shè)置Pvalue和Qvalue值為0.05，進(jìn)行“益智仁-AD”靶點(diǎn)的GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 益智仁潛在活性成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)的獲得 通過TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)庫搜索益智得到41個(gè)化合物，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 作為篩選條件，共收集到西托糖苷、谷甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇棕櫚酸酯4個(gè)潛在活性成分。同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)[12,17-20]調(diào)研，發(fā)現(xiàn)益智仁提取物中白楊素、原兒茶酸、圓柚酮、益智酮B、9-羥基-表圓柚醇和5-羥基糠醛也具有防治AD的藥理活性。因此共得到10個(gè)潛在活性成分，在Pubchem數(shù)據(jù)庫上獲取所有潛在活性成分的中英文名稱，結(jié)果見表1。再通過TCMSP和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫下載益智仁潛在活性成分靶點(diǎn)并將該靶點(diǎn)在uniprot數(shù)據(jù)庫中與人類基因名稱相對應(yīng)，得到156個(gè)對應(yīng)靶點(diǎn)。

表1 篩選后益智仁的潛在活性化學(xué)成分

2.2 AD相關(guān)基因與益智仁-AD共同作用靶點(diǎn)的獲取 在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“Alzheimer’s Disease”后分別收集到8718、384個(gè)AD相關(guān)基因。將上述基因去重、規(guī)范后得到8435個(gè)AD相關(guān)基因。將這8435個(gè)AD相關(guān)基因與“2.1”項(xiàng)下得到的156個(gè)益智仁潛在活性成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到113個(gè)“益智仁-AD”的共同靶點(diǎn)，并通過R語言繪制venn圖，結(jié)果見圖1。

圖1 益智仁治療AD的靶點(diǎn)基因匹配情況

2.3 “益智仁-潛在活性成分-相關(guān)靶點(diǎn)-AD”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建與分析 去除無對應(yīng)靶點(diǎn)的β-谷甾醇棕櫚酸酯以及重復(fù)靶點(diǎn)，將剩下的9個(gè)益智仁潛在活性成分與113個(gè)“益智仁-AD”共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，繪制“益智仁-潛在活性成分-相關(guān)靶點(diǎn)-AD”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。由拓?fù)浞治龅?，益智仁中潛在活性成分與各個(gè)靶點(diǎn)的邊的數(shù)量較多的是白楊素、原兒茶酸、圓柚酮和豆甾醇，分別有85、17、11和10條邊，這四種成分可能是益智仁治療AD的重要活性成分，結(jié)果見圖2。

圖2 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 由網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾敖y(tǒng)計(jì)分析每個(gè)節(jié)點(diǎn)得知113個(gè)靶點(diǎn)間共有667條連接關(guān)系，找出前30個(gè)核心基因，其中連接關(guān)系較多的ALB、SRC、EGFR、PTGS2、ESR1、AR、MMP9、BCL2L1和APP可能是益智仁治療AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 益智仁治療AD靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 益智仁治療AD前30個(gè)PPI核心基因

2.5 益智仁抗AD靶點(diǎn)GO功能注釋與KEGG通路富集分析 GO獲得122條生物過程，獲取富集度較高的前20條，主要涉及蛋白絲氨酸激酶、裂解酶、碳氧裂解酶、蛋白絡(luò)氨酸激酶等。KEGG富集分析獲得58條相關(guān)的信號通路，選取前20條，主要涉及PI3K-Akt、Ras、5-羥色胺能突觸、花生四烯酸代謝、NF-kappa B、氮代謝、黏著連接、前列腺癌和HIF-1等信號通路。其中，PI3K-Akt和Ras信號通路富集度較高，可能為益智仁治療AD的關(guān)鍵信號通路，結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 益智仁治療AD靶點(diǎn)GO功能富集分析柱狀圖

圖6 益智仁治療AD靶點(diǎn)KEGG富集信息氣泡圖

3 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，首先根據(jù)OB和DL以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)篩選獲得白楊素、原兒茶酸、圓柚酮、豆甾醇、益智酮B、9-羥基-表圓柚醇和5-羥基糠醛等10個(gè)益智仁潛在的活性成分。其中，白楊素可通過抗氧化、抗凋亡的作用改善慢性大鼠腦缺氧模型認(rèn)知功能[21]。原兒茶酸可顯著降低岡田軟海綿酸誘導(dǎo)的PC12 AD細(xì)胞模型中磷酸化微管蛋白，減少細(xì)胞形態(tài)的損傷[22]。圓柚酮能提高LPS誘導(dǎo)的AD小鼠模型記憶和學(xué)習(xí)能力是由于降低了神經(jīng)炎癥反應(yīng)[23]。豆甾醇可通過增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)傳遞介導(dǎo)的雌激素或NMDA受體激活改善東莨菪堿所致小鼠的認(rèn)知障礙[24]。益智酮B可延緩H2O2誘導(dǎo)的SK-N-MC細(xì)胞衰老[25]。Hong,Zhao等[26]發(fā)現(xiàn)9-羥基-表圓柚醇可通過抑制谷氨酸誘導(dǎo)的Caspase-3活化以及活性氧和一氧化氮的產(chǎn)生，進(jìn)而保護(hù)皮質(zhì)神經(jīng)元。5-羥基糠醛對aβ1-42誘導(dǎo)的AD小鼠模型的神經(jīng)損傷有保護(hù)作用，抑制β-分泌酶活性，降低aβ1-42和丙二醛含量，并增加抗氧化酶活性，從而顯著改善動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)活動(dòng)[27]。

益智仁作用于AD的靶點(diǎn)主要涉及抗炎、免疫和細(xì)胞增殖分化等三個(gè)方面。其中，涉及到抗炎的靶點(diǎn)有前列腺素G/H合酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)和雌激素受體(Estrogen receptor，ESR1)。PTGS2可能通過抑制前列腺素E2、緩激肽、組胺、5-羥色胺(5-HT)等炎癥介質(zhì)的活性實(shí)現(xiàn)抗炎作用[28]；表達(dá)過多MMP-9可促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生而導(dǎo)致早期動(dòng)脈粥樣硬化、心絞痛等心腦血管疾病[29]。涉及到免疫相關(guān)的靶點(diǎn)有雌激素受體(Estrogen Receptor，ESR1)和雄激素受體(Androgen Receptor，AR)，兩者與T、B淋巴細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)，從而影響免疫/炎癥相關(guān)因子的表達(dá)[30]。此外，ESR1還具有抗炎作用[31]。涉及到細(xì)胞增殖分化的靶點(diǎn)有表皮生長因子受體erbB1(Epidermal Growth Factor Receptor erbB1，EGFR)、非受體型酪氨酸激酶SRC(Tyrosine-protein Kinase SRC，SRC)和淀粉樣蛋白前體(Beta Amyloid A4 Protein，APP)，EGFR是一種可促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的肽類生長因子[32]，SRC是生長因子受體信號通路中的重要組成部分[33]，APP是神經(jīng)細(xì)胞、突觸、腦功能正常運(yùn)作所必須的物質(zhì)，可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞對抗毒性侵害，促進(jìn)其的增殖、分化與突觸的生長，調(diào)節(jié)突觸傳遞和突觸可塑性，改善空間記憶、學(xué)習(xí)與認(rèn)知等功能[34]。

GO 分析結(jié)果顯示，益智仁治療AD主要涉及蛋白絲氨酸激酶、裂解酶、碳氧裂解酶、蛋白絡(luò)氨酸激酶等。蛋白絲氨酸激酶和蛋白絡(luò)氨酸激酶可減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[35]，裂解酶和碳氧裂解酶可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖分化[36]，益智仁可能通過調(diào)控這些酶的活性來治療AD；KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，PI3K-Akt、Ras、5-羥色胺能突觸、花生四烯酸代謝、NF-kappa B、氮代謝、黏著連接、前列腺癌、HIF-1等信號通路可能與益智仁治療AD相關(guān)。其中，PI3K-Akt和Ras信號通路富集度較高，可能為益智仁治療AD的關(guān)鍵通路。PI3K-Akt信號通路是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞存活、分化及凋亡的重要信號通路之一，在癌癥、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的發(fā)生中扮演重要角色[37]。Ras信號通路參與細(xì)胞的生長發(fā)育、增殖分化以及細(xì)胞與細(xì)胞間的功能同步和癌變等多種生理和病理過程[38]。

4 結(jié)論與展望

綜上所述，益智仁主要通過抗炎、抗氧化、抗凋亡、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖分化和提高免疫力等方面治療AD。本研究為益智仁及其有效成分治療AD提供了一定理論依據(jù)。但本研究僅采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對益智仁治療AD的可能物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制進(jìn)行了分析，為更加深入的評估其臨床治療AD的潛在可能性，還需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)外活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。同時(shí)，益智仁在中醫(yī)臨床上大多與其它中藥配伍使用來治療AD，各藥味之間的相互作用關(guān)系也未能得到體現(xiàn)，需要進(jìn)一步的完善。