熒光PCR檢測技術(shù)對非洲豬瘟的常規(guī)監(jiān)測

馬成立

（遼寧省葫蘆島市建昌縣動物疫病預(yù)防控制中心 125300）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、熱性，高度接觸性的傳染病。發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%。世界衛(wèi)生組織將其列為法定報告的動物傳染病，我國將其列為一類動物疫病。該病雖然不是人畜共患病，無公共健康危害，但由于目前無有效的疫苗和治療方法，任其流行會給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，造成嚴(yán)重的社會影響，沖擊畜產(chǎn)品國際貿(mào)易。我國是世界第一養(yǎng)豬大國，飼養(yǎng)量占世界總量的50%左右，切實做好非洲豬瘟病毒防控工作事關(guān)我國養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

利用實時熒光PCR 定性檢測是否存在非洲豬瘟病毒，對早期監(jiān)測，防控非洲豬瘟具有重要的指導(dǎo)意義。

在實際工作中，我們首先選擇洛陽萊普生信息科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒和核酸檢測試劑盒來進(jìn)行非洲豬瘟病毒檢測實驗，效果非常好。

在實驗過程中，我們需要準(zhǔn)備的儀器設(shè)備有數(shù)顯恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、生物安全柜、移液器等，還需自備無水乙醇。

被檢樣品是動物組織，應(yīng)保存于50%甘油生理鹽水中，然后取樣約1g，用手術(shù)剪剪碎，于研缽中加入生理鹽水繼續(xù)研磨，混勻，后轉(zhuǎn)移至1.5ml 的滅菌離心管中，離心待用。如果是血液或全血樣品，則使用離心機(jī)離心析出血清后置于1.5ml滅菌離心管中待用。環(huán)境樣品則保存于病毒收集管中，離心后取上清液置于1.5ml 滅菌離心管中待用。

無論何種樣品，實驗開始前都要在數(shù)顯恒溫水浴鍋中進(jìn)行60℃的病毒滅活。

實驗開始時首先要提取樣品核酸。采用柱狀提取法，因采用的離心吸附柱可以特異性的結(jié)合核糖核酸或脫氧核糖核酸，加之獨特的緩沖液A，緩沖液B，緩沖液C，提取的核酸純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。在試劑盒配備的緩沖液C 瓶中一定要先加入4 倍體積的無水乙醇，混勻后做好標(biāo)記，備用。

1 核酸提取

（1）取已處理好的待檢樣品，在已開機(jī)的生物安全柜中吸取200μl 上清液加入1.5ml 的相對應(yīng)的滅菌離心管中，做好標(biāo)記，然后分別加入600μl 的緩沖液A，溫和的上下顛倒混勻6～8 次，室溫靜置5min；2～8℃下用高速冷凍離心機(jī)5000r 離心1～2min，用移液器取400μl 的上清液轉(zhuǎn)入新的滅菌離心管中。

（2）加入200μl 的無水乙醇，立即上下顛倒混勻，全部轉(zhuǎn)入已做好對應(yīng)標(biāo)記的吸附柱中，靜止2min，2～8℃下12000r 離心30～60s，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

（3）向吸附柱中加入500μl 的緩沖液B，室溫下靜止2min，2～8℃下12000r 離心30～60s，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

（4）向吸附柱中加入700μl 的緩沖液C，2～8℃下12000r 離心30～60s，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

（5）2～8℃下12000r 離心2min，去除吸附柱中殘留的液體。

（6）將吸附柱置于對應(yīng)的干凈的滅菌離心管中，開蓋晾干3～5min，向吸附膜的中間部位懸空滴加60μl 的洗脫液，室溫放置2min。

（7）室溫下12000r 離心1min，離心管中的液體即為提取的核酸。-20℃保存或直接進(jìn)行下一步實驗。

注意事項：實驗前應(yīng)準(zhǔn)備好盛有消毒液的容器，以便放置實驗過程中的垃圾，實驗人員必須經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)才可上崗，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不得交叉使用，各區(qū)間人員流動及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求。

2 核酸檢測

該檢測試劑盒檢測原理是針對非洲豬瘟病毒高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含有非洲豬瘟病毒基因組模板的情況下，PCR 反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR 過程中相應(yīng)通道的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。該試劑盒主要組成成分有：擴(kuò)增反應(yīng)液1 管，陰性對照1 管，陽性對照1 管，說明書1 份。

實驗前20min 將試劑盒從-20℃的冰柜中取出，以平衡至室溫25℃，并使試劑完全溶解。

（1）按照需要檢測的樣本數(shù)加上陰性對照數(shù)和陽性對照數(shù)，取出PCR 反應(yīng)管，按每管17.5μl 的用量分裝到PCR 反應(yīng)管中。

（2）加入待檢樣本提取的核酸，每管加入2.5μl，陰性對照和陽性對照管也加入2.5μl，記錄加樣順序。

（3）蓋好PCR 反應(yīng)管蓋，將PCR 反應(yīng)液與樣本核酸震蕩混勻后2000r 離心10s。以上實驗步驟均在核酸提取室進(jìn)行。

（4）將PCR 反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到核酸擴(kuò)增區(qū)，準(zhǔn)備上機(jī)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。

（5）開機(jī)預(yù)熱并檢驗儀器性能。

（6）取準(zhǔn)備好的PCR 反應(yīng)管，放置在儀器樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（7）按照樣品槽上樣品位置，在儀器上進(jìn)行樣品布局。

（8）設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：反應(yīng)體系設(shè)為20μl，95℃30s，一個循環(huán)；95℃5s，60℃40s，40 個循環(huán)。在FAM 通道采集熒光信號，ABI 系列熒光定量PCR 儀不選ROX 校正，淬滅基團(tuán)選None，然后進(jìn)行核酸擴(kuò)增。

3 結(jié)果分析

（1）結(jié)果分析條件設(shè)定：閾值設(shè)定原則是合理調(diào)整閾值線，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。

（2）試劑盒中的陽性對照Ct 值小于或等于30，有明顯指數(shù)增長，呈典型的“S” 形曲線。陰性對照Ct 值大于38 或無Ct 值，線形為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期和平臺期，則該試劑盒具有有效性。

（3）實驗結(jié)果：如果樣品檢測結(jié)果Ct 值小于或等于35，有明顯指數(shù)增長，表明該樣品中檢測出該病毒。如果樣品檢測結(jié)果Ct 值在35～38 范圍，為可疑，此時應(yīng)對樣品進(jìn)行重復(fù)檢測，如果重檢結(jié)果Ct 值仍在35～38 之間，有明顯指數(shù)增長，則判定該樣品是陽性，否則為陰性。如果被檢樣品檢測結(jié)果Ct 值大于38 或無Ct 值，表明該樣品中沒有檢測出該病毒，為陰性，結(jié)果分析后要保存當(dāng)前的分析結(jié)果，記錄好閾值。

4 注意事項

實驗室管理應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)臨床基因擴(kuò)增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。實驗前仔細(xì)閱讀試劑盒說明書，嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行，避免導(dǎo)致錯誤結(jié)果。實驗過程要分區(qū)進(jìn)行，分別在試劑準(zhǔn)備室，核酸提取室，擴(kuò)增反應(yīng)室進(jìn)行。實驗操作的每個階段使用的儀器和設(shè)備必須專用，不得交叉使用。所有試劑均應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存，冷凍保存的各試劑使用前應(yīng)完全融化，8000r 離心15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器槍頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放回冰柜，冷凍保存。使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套，實驗過程中經(jīng)常替換手套，預(yù)防交叉污染。操作過程中吸取液體，設(shè)定時間等全部過程必須精確。為防止熒光干擾，不要在PCR 反應(yīng)管上做任何標(biāo)記，并避免用手直接接觸。實驗過程中產(chǎn)生的廢棄物及試劑盒內(nèi)試劑組分在實驗中均按照具有潛在傳染性物質(zhì)處理方法進(jìn)行處理。操作臺面，離心機(jī)，生物安全柜，移液器等儀器用品在實驗結(jié)束后必須用消毒液進(jìn)行擦拭消毒或浸泡消毒，實驗房間在實驗結(jié)束后用紫外線燈進(jìn)行消毒處理。被檢樣品在采集、儲存、運輸及核酸提取過程中操作方法不當(dāng)，容易造成核酸降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果，當(dāng)被檢樣品核酸濃度過低時也可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果。被檢樣品在采集和制備過程中如果發(fā)生交叉污染，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。