微生物菌劑施用對(duì)煙田根際土壤菌群數(shù)量的影響

唐興貴 陸新莉 雷庭 郭光東 江彤 丁婷

摘要 ? ?在前期篩選出高效防治煙草青枯病的生防菌株的基礎(chǔ)上，于貴州省黔南州獨(dú)山縣開(kāi)展田間小區(qū)試驗(yàn)，分析生防菌劑施用對(duì)根際土壤微生物菌群數(shù)量變化的影響。結(jié)果表明，煙草內(nèi)生菌LSN02和煙草根際菌LLGJ04等2種生防菌劑在煙草種植中的施用均可明顯提高根際土壤微生物的菌群總數(shù)量，且LSN02的效果優(yōu)于LLGJ04;其中，用煙草內(nèi)生菌LSN02高濃度（2×108 CFU/mL）處理煙株時(shí)，可顯著增加根際土壤細(xì)菌菌群數(shù)量，而用煙草根際菌LLGJ04中濃度（1×108 CFU/mL）和低濃度（0.5×108 CFU/mL）處理煙株時(shí)，可分別增加根際土壤放線菌及真菌的菌群數(shù)量。

關(guān)鍵詞 ? ?微生物菌劑;根際土壤;真菌;細(xì)菌;放線菌;煙田

中圖分類號(hào) ? ?S572.01 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2020）22-0086-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

煙草是貴州省重要的經(jīng)濟(jì)作物。近年來(lái)，由于煙草多年連作、農(nóng)業(yè)生態(tài)平衡遭到破壞等原因，導(dǎo)致貴州主要煙區(qū)青枯病危害日趨嚴(yán)重，成為影響煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙[1-3]?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用在煙草病害防治上發(fā)揮了重大作用，很多病害得到了暫時(shí)控制，但化學(xué)藥劑的大量持續(xù)性使用易造成病原菌抗藥、環(huán)境污染、生態(tài)失衡、藥害植株和煙葉農(nóng)藥殘留等難以克服的問(wèn)題，不利于生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[4]。隨著農(nóng)作物病害防治技術(shù)的進(jìn)步，煙草青枯病的生物防治日益引起社會(huì)的重視。目前，圍繞煙草植物內(nèi)生菌及其根際微生物控制煙草青枯病已成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)[5-8]。

微生物菌劑是指一類含有特定微生物活體的制品，可通過(guò)其所含微生物的生命活動(dòng)，改善土壤質(zhì)量，協(xié)調(diào)植株對(duì)養(yǎng)分的吸收，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境[9-10]。本課題組前期研究中，自貴州省黔南州煙區(qū)的健康煙株及根際土壤中分離獲得2株對(duì)煙草青枯病菌具有較好拮抗活性的菌株LSN02和LLGJ04，其盆栽試驗(yàn)均表明煙草內(nèi)生菌LSN02和煙草根際菌LLGJ04均可有效增強(qiáng)煙株對(duì)青枯病的抗病能力[11]。因此，該試驗(yàn)擬在前期篩選出高效防治煙草青枯病害生防菌株的基礎(chǔ)上，通過(guò)田間試驗(yàn)比較生防菌劑施用對(duì)土壤微生物數(shù)量以及微生物功能多樣性的影響，以期為提高植煙土壤有機(jī)養(yǎng)分含量和微生物活性提供依據(jù)。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在貴州省黔南州獨(dú)山縣開(kāi)展，選擇2017年土傳病害重病地自然誘發(fā)。試驗(yàn)地面積≥1 333.34 m2，田塊形狀相對(duì)較規(guī)則，基本呈長(zhǎng)方形。常規(guī)條件栽培，土壤肥力中等，生產(chǎn)措施按常規(guī)管理實(shí)行。

1.2 ? ?試驗(yàn)材料

1.2.1 ? ?供試煙草品種。選擇當(dāng)?shù)刂髟詿煵萜贩N云煙87，共計(jì)2 000株。

1.2.2 ? ?供試菌株。選用本實(shí)驗(yàn)室前期分離的2株對(duì)煙草青枯病菌具有較好拮抗活性的煙草內(nèi)生菌LSN02和煙草根際菌LLGJ04，均為芽孢桿菌屬微生物。

1.2.3 ? ?供試微生物菌劑和化學(xué)藥劑。100億CFU/g多粘類芽孢桿菌（500 g/袋），由廈門多多科技有限公司生產(chǎn);農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑（15 g/袋），由華北制藥河北華諾有限公司生產(chǎn)。

1.2.4 ? ?供試培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基（分離真菌用）：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，水1 L。NA培養(yǎng)基（分離細(xì)菌用）：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH值7.2～7.5。改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基（分離放線菌用）：購(gòu)自試劑公司。

1.3 ? ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)9個(gè)處理，即煙草內(nèi)生菌LSN02 0.5×108 CFU/mL灌根處理（A）、煙草內(nèi)生菌LSN02 1.0×108 CFU/mL灌根處理（B）、煙草內(nèi)生菌LSN02 2.0×108 CFU/mL灌根處理（C）、煙草拮抗菌LLGJ04 0.5×108 CFU/mL灌根處理（D）、煙草拮抗菌LLGJ04 1.0×108 CFU/mL灌根處理（E）、煙草拮抗菌LLGJ04 2.0×108 CFU/mL灌根處理（F）、100億CFU/g多粘類芽孢桿菌細(xì)粒劑2 700 g/hm2灌根處理（G）、72%農(nóng)用鏈霉素可濕性粉劑750 g/hm2灌根處理（H），以清水灌根處理作對(duì)照（CK）。3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，每次重復(fù)植煙50株，共處理1 350株。

1.4 ? ?試驗(yàn)過(guò)程

1.4.1 ? ?土樣采集。煙苗移栽時(shí)先蘸根，坑內(nèi)灌入100 mL藥劑后再移栽，移栽后15 d左右在封窩前按同等濃度再灌1次。于煙草青枯病病情調(diào)查時(shí)采集土樣，每個(gè)小區(qū)3點(diǎn)取樣，采集煙株根系周圍土樣，每個(gè)樣本采集帶須根土壤50 g，牛皮紙袋裝土樣，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.4.2 ? ?土壤微生物分離。稱取樣品10 g（精確到0.01 g），加入帶玻璃珠的100 mL無(wú)菌水中，靜置20 min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200 r/min充分振蕩30 min，即成土壤母液。用無(wú)菌移液管分別吸取5.0 mL上述土壤母液菌懸液，加入45 mL無(wú)菌水，按10n的比例進(jìn)行系列稀釋，依次得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋倍數(shù)的土壤懸浮液。

每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜的稀釋度，分別吸取不同稀釋度土壤懸浮液0.1 mL，加至預(yù)先制備好的固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒在培養(yǎng)基表面將懸浮液來(lái)回推散涂抹均勻。每一個(gè)稀釋度3次重復(fù)，于適宜的條件下培養(yǎng)。

細(xì)菌培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，真菌培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)，放線菌培養(yǎng)7 d后計(jì)數(shù)。以出現(xiàn)20～300個(gè)菌落數(shù)的稀釋度的平板為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)分離到的活菌數(shù)目。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?不同處理煙田土壤中細(xì)菌的分離數(shù)量

如表1所示，不同處理煙田土壤中分離到的細(xì)菌數(shù)量有一定差異，細(xì)菌數(shù)量由多到少依次為處理C>處理F>處理E>處理B>處理D>處理A>處理G>處理H>CK。處理A、B、C、D、E、F的煙田土樣分離到的細(xì)菌數(shù)量均高于處理G、H、CK，且處理A、B、C效果較為明顯。由上述結(jié)果可知，將2種微生物菌劑添加到土壤中，在一定程度上均可引起煙田土壤細(xì)菌菌群數(shù)量的增加。

2.2 ? ?不同處理煙田土壤中放線菌的分離數(shù)量

如表1所示，不同處理煙田土壤中分離到的放線菌數(shù)量差異較大，數(shù)量最多的是處理E，分離到的放線菌數(shù)量為3.27×106個(gè)/g;其后依次是處理F、B，分離到的放線菌數(shù)量分別為2.37×106個(gè)/g和2.27×106個(gè)/g。與此同時(shí)，處理A、C、G、H等4個(gè)處理組分離到的放線菌數(shù)量均低于CK，處理H的土壤中放線菌數(shù)量?jī)H為0.37×106個(gè)/g。由此可知，處理F、E、B均能增加土壤中放線菌數(shù)量，其中處理E效果最為明顯。

2.3 ? ?不同處理煙田土壤中真菌的分離數(shù)量

如表1所示，不同處理煙田土壤中分離到的真菌數(shù)量以處理G最多，為3.77×106個(gè)/g;其后依次是處理D>處理B>處理E>處理C>處理H>處理A>處理F>CK。由此可知，高濃度微生物菌劑的添加，在一定程度上抑制了土壤中真菌的生長(zhǎng)，隨著菌劑濃度的降低，土壤中的真菌數(shù)量相對(duì)于CK反而增加，表現(xiàn)為處理D、B對(duì)根際土壤的真菌含量有明顯的增加效果。

2.4 ? ?不同處理煙田土壤中分離的微生物總數(shù)量

如表1所示，處理C樣品中分離到的微生物總量最高，數(shù)量為2.78×107個(gè)/g，其后分別為處理F、E;而處理H土壤中分離到的微生物總數(shù)量則低于CK及其他各處理，說(shuō)明微生物菌劑的添加可明顯增加根際土壤的微生物菌群數(shù)量，而化學(xué)藥劑的施用在一定程度上對(duì)土壤中的微生物群落起到破壞作用。

3 ? ?結(jié)論與討論

近年來(lái)，隨著化學(xué)肥料在作物生產(chǎn)中引起的土壤板結(jié)、土壤微生物區(qū)系失衡、土傳病害發(fā)生及環(huán)境污染等問(wèn)題的日益加重[12]，微生物菌劑在農(nóng)業(yè)上的作用已逐漸被人們認(rèn)識(shí)，并有多種微生物菌劑，如蠟質(zhì)芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌以及哈茨木霉等的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。大量研究表明，微生物菌劑可通過(guò)其有效微生物的生命活動(dòng)增加土壤養(yǎng)分、促進(jìn)作物生長(zhǎng)、維持根際間微生物區(qū)系平衡，可以通過(guò)微生物之間或與植物之間的互作增強(qiáng)植物的抗病與抗逆能力。該研究在前期篩選出高效防治煙草青枯病的生防菌株的基礎(chǔ)上，通過(guò)田間試驗(yàn)比較生防菌劑施用對(duì)土壤微生物數(shù)量以及微生物功能多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)煙草內(nèi)生菌LSN02和煙草根際菌LLGJ04 2種生防菌劑在煙草種植中的施用均可明顯提高土壤微生物的菌群總數(shù)量。結(jié)合前期研究，LSN02具有趨化特性，用中濃度（1×108 CFU/mL）、高濃度（2×108 CFU/mL）的LSN02菌株處理煙株，煙草青枯病的病株率顯著低于LLGJ04菌株不同濃度處理組[11]。因此，推測(cè)將煙草內(nèi)生菌LSN02施用到煙草根部，LSN02能快速向根系移動(dòng)，通過(guò)增加植株根際土壤中的細(xì)菌菌群數(shù)量，從而與青枯病菌進(jìn)行空間及營(yíng)養(yǎng)等方面的競(jìng)爭(zhēng)，反映到外部癥狀上，即LSN02菌劑的施用可明顯減輕煙草植株青枯病的發(fā)病率。

土壤微生物是土壤生物特性的重要組成部分，在土壤營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解等方面起著重要作用，是土壤肥力的一個(gè)重要指標(biāo)，其數(shù)量變化可反映出土壤環(huán)境變化，體現(xiàn)微生物活性變化。該研究中，微生物菌劑的添加能明顯增加植煙土壤中微生物數(shù)量。究其原因，將微生物菌劑添加入煙草根際，隨著微生物的生長(zhǎng)代謝，在一定程度上改變了土壤中的C/N比值，間接影響土壤微生物生長(zhǎng)繁殖，反映在土壤微生物的分離結(jié)果上則是施入微生物菌劑的煙草土壤分離到的真菌、細(xì)菌以及放線菌含量均有不同程度的增加。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

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