CRISPR/Cas9技術(shù)在農(nóng)作物中應(yīng)用的局限及改進(jìn)

武林琳 竹夢婕 王咪 李曉萍 劉躍鵬 裴蕾 楊淑巧 許琦 王華 郭文治

摘要 ? ?基因編輯技術(shù)是一種可以直接對DNA序列進(jìn)行穩(wěn)定、精準(zhǔn)改造的技術(shù)，其中CRISPR/Cas9技術(shù)以簡便、高效、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢脫穎而出。CRISPR/Cas9技術(shù)被廣泛應(yīng)用于作物遺傳育種、植物基因改造和農(nóng)作物品種改良等多個方面，給農(nóng)作物領(lǐng)域帶來巨大機(jī)遇。但機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存，該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中亦遇到一些困難。因此，本文圍繞CRISPR/Cas9技術(shù)的原理、局限及改進(jìn)方案進(jìn)行綜合闡述，以期為CRISPR/Cas9技術(shù)在農(nóng)作物中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ? ?基因編輯;CRISPR/Cas9;農(nóng)作物;局限;脫靶效應(yīng);改進(jìn)手段

中圖分類號 ? ?Q943.2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）22-0026-04 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Abstract ? ?Gene editing technology is a technology that can directly modify the DNA sequence stably and accurately， in which CRISPR/Cas9 technology stands out for the advantages of simplicity， high efficiency and economy. CRISPR/Cas9 technology is widely used in crop genetic breeding， plant genetic modification， crop variety improvement and other aspects， bringing great opportunities to the field of crops. However， there are both opportunities and challenges， and the technology also encounters some difficulties in practical application. Therefore， this paper comprehensively expounded the principle， limitation and improvement scheme of CRISPR/Cas9 technology， in order to provide theoretical basis for the further application of CRISPR/Cas9 technology in crops.

Keywords ? ?gene editing; CRISPR/Cas9; crop; limitation; off-target effect; improvement mean

隨著世界人口的增加，到2050年為全球超過90億的預(yù)期人口提供食物是21世紀(jì)的主要挑戰(zhàn)之一。Henry等[1]研究結(jié)果表明，在耕地?cái)U(kuò)張不超過地球邊界的情況下，至2050年向全球人口提供充足的食物是可能的，但需要對糧食系統(tǒng)的需求方進(jìn)行重大改變或推進(jìn)生物技術(shù)。因此，基因編輯技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

基因編輯是一種在基因組水平上對DNA序列進(jìn)行精確敲除、插入和替換，從而實(shí)現(xiàn)基因組序列穩(wěn)定改善的技術(shù)[2]?；蚓庉嫾夹g(shù)的原理是利用人工內(nèi)切核酸酶（SSNs）在目標(biāo)基因組位置產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSBs），激活細(xì)胞的DNA修復(fù)系統(tǒng)，在修復(fù)過程中改變DNA序列[2]。DSBs可以通過非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重組（homologous-directed recombination，HDR）進(jìn)行修復(fù)。NHEJ是DNA斷裂后最常見的修復(fù)方式，僅能造成DNA序列的隨機(jī)改變，而HDR則能夠引入一個與DSBs同源的外源DNA作為修復(fù)模板，使基因組DNA產(chǎn)生精確的序列改變。

目前，在農(nóng)作物中應(yīng)用的基因編輯技術(shù)主要有3種，即鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs）[3]、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）[4]和成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/Cas9）技術(shù)，其中以CRISPR/Cas9最為常用。CRISPR/Cas9技術(shù)已被用于作物遺傳育種、植物基因改造、農(nóng)作物品種改良等多個方面。

1 ? ?CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

能夠識別并特異性切割DNA序列的核酸酶是各種基因編輯技術(shù)的特色所在，CRISPR/Cas9技術(shù)中的核酸酶為Cas9，通過識別前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）進(jìn)行DNA雙鏈切割[5]。

CRISPR廣泛存在于古細(xì)菌和細(xì)菌中，是細(xì)菌進(jìn)行自我防御的重要機(jī)制。當(dāng)噬菌體侵入細(xì)菌后，細(xì)菌會將病毒DNA短片段整合到自己的染色體上，之后將該序列轉(zhuǎn)錄為短RNA，稱為crRNA（CRISPR RNA），然后與另一個稱為tracrRNA（反式激活CRISPR RNA）的RNA形成復(fù)合體。這種復(fù)合物被稱為“引導(dǎo)RNA（gRNA）”，引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9至病毒DNA部位定點(diǎn)切割，產(chǎn)生DSBs。當(dāng)gRNA通過識別PAM序列在噬菌體DNA中找到其匹配序列時(shí)，Cas9核酸酶就會裂解病毒DNA，從而抵抗病毒攻擊[6]。

CRISPR/Cas9技術(shù)來源于上述細(xì)菌獲得性免疫產(chǎn)生機(jī)制，該系統(tǒng)主要包括Cas9核酸內(nèi)切酶和單鏈引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）。CRISPR/Cas9在sgRNA與Cas9蛋白的特定位點(diǎn)相結(jié)合后進(jìn)入激活狀態(tài);sgRNA識別具有PAM序列的DNA序列，通過前20個核苷酸與目標(biāo)DNA堿基配對;然后引導(dǎo)Cas9核酸酶至靶切割位點(diǎn)切割DNA，產(chǎn)生DSBs;最后通過NHEJ和HDR進(jìn)行細(xì)胞修復(fù)[7]（圖1）。

由上可知，CRISPR/Cas9技術(shù)只需改變sgRNA的前20個核苷酸序列就可對基因組的不同位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)靶向編輯，理論上能夠識別任何含PAM序列的DNA片段。其因具有方便、精準(zhǔn)、高效、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，在農(nóng)作物改良中被迅速推廣。

2 ? ?CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的局限性

CRISPR/Cas9已被成功用于編輯超過25種植物和100個基因，創(chuàng)造出符合人們要求的主要作物的理想性狀[8-9]。但CRISPR/Cas9技術(shù)仍有局限性，如該技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因編輯有賴于PAM序列，在附近無PAM序列的區(qū)域無法進(jìn)行編輯;由于CRISPR/Cas9技術(shù)會出現(xiàn)sgRNA與DNA間的錯配，基因組中與靶位點(diǎn)序列相似的序列也會被CRISPR/Cas9識別并切斷，出現(xiàn)脫靶。

Cas9復(fù)合體與非靶標(biāo)區(qū)域結(jié)合并啟動切割，稱為脫靶效應(yīng)[10]。與ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)更易發(fā)生脫靶效應(yīng)。原因在于Cas9的靶向準(zhǔn)確度主要由基因組目標(biāo)序列附近的20 nt sgRNA和PAM位點(diǎn)決定，單鏈的sgRNA更易產(chǎn)生識別DNA序列的錯配，導(dǎo)致脫靶[11]。

脫靶可能導(dǎo)致染色體重排，造成不完全匹配的基因組位點(diǎn)的破壞[12]。另外，除干擾染色體穩(wěn)定性外，脫靶效應(yīng)還可能導(dǎo)致功能基因活性的喪失，從而導(dǎo)致各種信號異常[13]（圖2）。潛在的脫靶效應(yīng)是CRISPR/Cas9在作物應(yīng)用中備受關(guān)注的問題[14]，它限制了該技術(shù)在作物育種及作物改良中的進(jìn)一步擴(kuò)展應(yīng)用[15]。

3 ? ?對CRISPR/Cas9技術(shù)局限性的改進(jìn)手段

鑒于CRISPR/Cas9技術(shù)的強(qiáng)大優(yōu)勢，科研工作者采取多種策略降低CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9核酸內(nèi)切酶和sgRNA兩部分組成，對降低脫靶效應(yīng)策略的研究大都集中在兩方面。

3.1 ? ?設(shè)計(jì)最優(yōu)sgRNA

設(shè)計(jì)最優(yōu)sgRNA，有利于消除基因編輯致命的脫靶現(xiàn)象。為此，首先需要選擇該目標(biāo)基因型的高質(zhì)量基因組作參考基因組[16];其次，選擇CRISPR-P 2.0[17]、E-CRISP[18]、Breaking-Cas[19]、CasFinder[20]來設(shè)計(jì)最優(yōu)的sgRNA序列以最小化脫靶機(jī)會。

3.2 ? ?改進(jìn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)

3.2.1 ? ?CBES和ABES（Cytosine and Adenine Base Edi-tors，BEs，胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器）。BEs是由催化結(jié)構(gòu)域和DNA靶向模塊組成的嵌合蛋白，具有脫氨腺嘌呤或胞苷的能力。通過靶向sgRNA，將具有脫氨酶結(jié)構(gòu)域的蛋白酶引導(dǎo)至靶標(biāo)位置，進(jìn)行切割，同時(shí)可將目標(biāo)部位配對堿基中的C精確轉(zhuǎn)化為T或?qū)轉(zhuǎn)化為G[21-23]。該過程不產(chǎn)生DSBs，大大減小了靶點(diǎn)位置上隨機(jī)插入、缺失產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)。

3.2.2 ? ?xCas9和Cas9-NG。xCas9和Cas9-NG是SpCas9的變異體，在提高靶點(diǎn)特異性和擴(kuò)大靶點(diǎn)范圍方面顯示出巨大的潛力。xCas9-3.7是一個高效的xCas9變體，可針對多達(dá)16個候選NGN PAM組合（如NGG、NG、GAA和GAT）進(jìn)行有針對性地編輯。xCas9已被證明具有最廣泛的PAM識別能力，與SpCas9相比，xCas9表現(xiàn)出更高的DNA特異性，在全基因組范圍內(nèi)所有NGG PAM的脫靶效應(yīng)明顯降低[24]。xCas9具有靶向標(biāo)準(zhǔn)NGG PAM的能力，而Cas9-NG是植物基因編輯中識別非標(biāo)準(zhǔn)PAM的首選酶[25]。

3.2.3 ? ?Cas9n（Cas9 Nickase） and dCas9（Dead Cas9）。成對的Cas9n是Cas9的一個突變體，其中Cas9的HNH或RuvC結(jié)構(gòu)域通過引入H840A或D10A改變而失活。成對的Cas9n由2個針對相鄰位點(diǎn)的sgRNA引導(dǎo)至靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割、插入[26]。Cas9n也被用作高頻堿基編輯的靶向模塊[27]。dCas9工作模式與Cas9n非常相似。由于堿基編輯不產(chǎn)生DSBs，Cas9n和dCas9都被用來通過靶向脫氨酶結(jié)構(gòu)域來編輯特定的堿基。

3.2.4 ? ?Tru-gRNAs（Shorter/Truncated Guide RNAs for On-Target Site）。研究表明，gRNA由最初20 bp縮短至17～18 bp，基因編輯效率并未改變，而脫靶位修飾減少[26]。在植物中，在使用組成型啟動子的CRISPR/Cas9系統(tǒng)中使用截短的sgRNA會導(dǎo)致靶上編輯率增高，脫靶效應(yīng)大大降低[27]。此外，將Tru-gRNAs與Cas9n相結(jié)合，進(jìn)一步減少了脫靶突變[26]。

3.2.5 ? ?Cas9高保真突變體。①SpCas9-HF1（High-Fidelity Engineered Variants of SpCas9）。SpCas9-HF1是一種高保真的變體，旨在減少非特異性DNA相互作用。由于其非凡的準(zhǔn)確性，可成為臨床治療的替代品[28]。②eSpCas9（Enhanced Specificity of SpCas9）。eSpCas9減少了脫靶效應(yīng)并保持了有效的靶位編輯。對于需要高特異性的基因編輯工具（例如臨床醫(yī)學(xué)），eSpCas9非常實(shí)用?？赏ㄟ^合理設(shè)計(jì)生成的eSpCas9（K848A，K1003A，R1060A）減少與非目標(biāo)序列的結(jié)合，提高基因編輯的特異性[29]。③HypaCas9（Hyper-Accurate Cas9 Variant）。HypaCas9系統(tǒng)能夠在不影響人類細(xì)胞目標(biāo)基因組編輯的情況下實(shí)現(xiàn)更高的全基因組保真度。這個系統(tǒng)提供了一種平衡核酸酶激活和目標(biāo)識別之間關(guān)系的改進(jìn)方法，以實(shí)現(xiàn)精確的基因編輯[30]。

4 ? ?總結(jié)與展望

CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)為植物基因操作領(lǐng)域帶來了新的機(jī)遇。作為用于定點(diǎn)誘變的基因組編輯工具，CRISPR/Cas9滿足了人們的所有期待：高效率、高特異性、價(jià)格低廉、操作方便，這些是傳統(tǒng)誘變方法無法企及的。由于人們對CRISPR/Cas9系統(tǒng)了解相對較深，其構(gòu)建方法已逐漸得到改善，同時(shí)研究者們正在嘗試將脫靶效應(yīng)降至最低。所有這些優(yōu)點(diǎn)使研究者迫切將其用于植物基因組學(xué)研究和作物改良，特別是在與產(chǎn)量、品質(zhì)以及非生物和生物脅迫耐受性/抗性相關(guān)的特征方面。目前，脫靶效應(yīng)仍是CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)一步廣泛應(yīng)用的阻礙，還需要更多的研究來進(jìn)一步提高靶標(biāo)的特異性，以避免或減輕脫靶效應(yīng)。

5 ? ?參考文獻(xiàn)

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