基于形態(tài)和DNA序列分析的海龍類藥材商品的基原調查

劉富艷 金艷 袁媛 秦雯 蔣超 趙玉洋 黃璐琦

摘要 目的：為市售海龍藥材的鑒別以及建立質量控制標準提供科學依據(jù)。方法：對我國主要藥材市場的海龍類商品進行收集，并通過形態(tài)鑒別和DNA分子鑒別確定海龍商品基原。結果：共有刁海龍Solenognathus hardwickii（Gray，1830）、擬海龍Syngnathoides biaculeatus（Bloch，1785）、舒氏海龍Syngnathus schlegeli Kaup，1856、寶珈槍吻海龍Doryichthys boaja（Bleeker，1850）、黑斑刁海龍Solegnathus lettiensis Bleeker，1860、斗氏刁海龍Solegnathus dunckeri Whitley，1927、多棘刁海龍Solegnathus spinosissimus Günther，1870、粗吻海龍Trachyrhamphus serratus（Temminck et Schlegel，1847）、光粗吻海龍Trachyrhamphus bicoarctatus（Bleeker，1857）、長吻粗吻海龍Trachyrhamphus longirostris Kaup，1856、葛氏海蠋魚Halicampus grayi Kaup，1856等11種基原，其中黑斑刁海龍、斗氏刁海龍、光粗吻海龍、長吻粗吻海龍為首次在中藥市場中發(fā)現(xiàn)。結論：本文所進行的DNA序列分析結合形態(tài)鑒別方法也對其他中藥材的市場調查和商品基原鑒別研究提供了模式。

關鍵詞 海龍藥材；市場調查；分子鑒別

Abstract Objective：To provide scientific basis for the identification and establishment of quality control standards of medicinal Syngnathus sold in the markets.Methods：The Syngnathus commodities in herbal markets were collected，and the origin base of Syngnathus commodities was determined through morphological characteristics and DNA molecule identification.Results：There were 11 species of origin including Solenognathus hardwickii（Gray，1830），Syngnathoides biaculeatus （Bloch，1785），Syngnathus schlegeli （Kaup，1856），Doryichthys boaja（Bleeker，1850），Solegnathus lettiensis （Bleeker，1860），Solegnathus dunckeri （Whitley，1927），Solegnathus spinosissimus（Günther，1870），Trachyrhamphus serratus（Temminck et Schlegel，1847），Trachyrhamphus bicoarctatus（Bleeker，1857） and Halicampus grayi （Kaup，1856）.The origin of S.lettiensis，S.dunckeri，T.bicoarctatus and T.longirostris was observed for the first time in commercial herbal markets.Conclusion：The method of DNA sequences analysis combined with morphological characteristics identification also provided a model of other market surveys and commodity origin identification study in Chinese herbal markets.

Key Words Syngnathus； Market survey； Molecular identification

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.001

中藥商品基原調查是系統(tǒng)整理中藥品種，改善藥材市場品種混亂情況，確定真?zhèn)舞b別目標，提高中藥質量標準的前提條件。海龍是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，有溫腎壯陽、散結消腫的作用。2015年版《中華人民共和國藥典》收載其基原為海龍科動物刁海龍（Solenognathus hardwickii，Gray）、擬海龍（Syngnathoides biaculeatus，Bloch）或尖海龍（Syngnathus acus Linnaeus）的干燥體[1]。由于目前海龍未能實現(xiàn)有效的人工養(yǎng)殖，海龍野生資源日益減少，市場情況日趨復雜。此前調查研究認為，市場上常見混偽品主要有粗吻海龍（Trachyrhamphus serratus）、海蠋魚（Halicampus grayi）、寶珈海龍（Doryichthys boaja）、多棘刁海龍（又名貢氏柄頜海龍，Solegnathus spinosissimus）、藍海龍（又名藍點副海龍，Hippichthys cyanospilos）、低海龍（又名低副海龍，Hippichthys heptagonus）、冠海龍（Corythoichthys conspicillatus）、舒氏海龍（Syngnathus schlegeli）等，但目前由于外來藥材數(shù)量增加，且海龍的性狀鑒別特征主要包括體長、體色、眼徑、頭長、背鰭、胸鰭、尾鰭形態(tài)等，在干制過程中，部分性狀損壞，難以區(qū)分，而其體色和表面紋理特征在去除皮膜過程中消失或發(fā)生改變，部分混偽品與正品海龍形態(tài)差異不明顯，需要建立更為穩(wěn)定準確的基原鑒別方法。近年來隨著分子系統(tǒng)學和生物信息學的發(fā)展，包含管口魚目在內的動植物核酸數(shù)據(jù)庫已逐步建立[2-4]。而此前不同的藥源研究結果均不一致、對于同一基原的形態(tài)描述也有差異[5-7]，造成市場上品種混亂，摻偽摻假現(xiàn)象普遍存在，急需對商品海龍的基原進行進一步的澄清。本文通過形態(tài)歸類結合細胞色素c氧化酶I基因（COI）序列分析對收集到的126批市售商品海龍進行物種基原調查，為海龍鑒別提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Veriti 96孔梯度PCR擴增儀（Applied Biosystem公司）、VORTEX-2 GENIE漩渦震蕩儀（Scientific industries公司）、SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)（GENE公司）、Nanodrop 2000微量核酸定量分析儀（Thermo Fisher公司）。

1.2 試劑 蛋白酶K（Promega公司）、Ex Taq DNA聚合酶（Takara公司）、SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶（Takara公司）、2000 bp DNA Marker（Takara公司）、Wizad SV Genomic DNA Purification System試劑盒（Promega公司）。

1.3 分析樣品 海龍藥材采購于河北安國、安徽亳州、四川成都、廣西玉林、廣東清平、廣東普寧、山東鄄城、云南昆明中藥材市場，共收集樣品126份，憑證標本保存于中國中醫(yī)科學院中藥資源中心。見表1。

2 方法與結果

2.1 形態(tài)鑒別 所有樣品均根據(jù)《中華人民共和國藥典》《南海魚類志》[8]、《黃渤海魚類圖志》[9]、《東海魚類志》[10]、《中國海洋魚類》[11]、FishBase全球魚類數(shù)據(jù)庫[12]的要求進行形態(tài)鑒別。

2.2 PCR鑒別

2.2.1 DNA提取 樣品使用70%乙醇擦拭表面，晾干。取海龍肌肉組織樣品約30 mg，置潔凈的2 mL離心管中，經(jīng)DNA提取研磨儀研磨至粉末，按照Wizad SV Genomic DNA Purification System試劑盒說明書提取總DNA，采用Nanodrop 2000微量核酸定量分析儀測定其濃度，并根據(jù)A260/A280，A260/A230的值判斷DNA提取質量，用于PCR反應或于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 PCR擴增及電泳檢測 取所提取的DNA，使用COI通用引物、魚類通用引物Fish 1或魚類通用引物Fish 2進行PCR擴增[13-14]。PCR反應體系為25 μL，包含dd H2O 19 μL，2.5 μL 10× PCR buffer，1.5 μL dNTP（10 mmol/L），上游及下游引物各0.25 μL（10 μmol/L）、0.2 μL Ex Taq DNA聚合酶或SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶（5 U/μL），1 μL Mg2+（10 μmol/L），1 μL DNA模板。擴增結束后取5 μL PCR產物，加入4 μL 6×Loading buffer于EtBr染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像，擴增引物及反應程序見表2。

2.2.3 測序及數(shù)據(jù)處理 取陽性擴增產物經(jīng)純化后使用ABI3730XL（Applied Biosystems Co.，USA）測序儀以對應引物進行雙向測序，測序由睿博興科生物技術有限公司完成。使用BioEdit 7.2.6軟件對測序峰圖進行校對、去除引物序列及拼接，獲得對應測序結果。序列使用DNAsp 5.0軟件進行單倍型分析，每種單倍型均經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和BOLD Systems v3（boldsystems.org）數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，獲得最相似物種信息。利用MEGA 6.0對獲得的單倍型序列進行分析，基于Kimura-2-parameter模型使用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設定為1 000次重復。

2.3 結果分析

2.3.1 基于形態(tài)的初步鑒別 商品海龍藥材除小海龍和六角海龍外均有去除皮膜和未去皮膜的類型，由于是否去皮膜僅影響商品藥材表面顏色和紋理特征，不影響棘棱數(shù)、頭部形態(tài)或骨環(huán)數(shù)等，可明顯將去皮膜和未去皮膜的同種藥材歸于一類。商品海龍藥材形態(tài)上根據(jù)軀干部棘棱數(shù)和體型大小可明顯分為5大類：1）四棱形的擬海龍類（三角海龍）；2）五棱形的刁海龍類（刁海龍）；3）六棱形的寶珈海龍類（六角海龍）；4）柱狀六棱形的粗吻海龍類（粗吻海龍、海蛇或黑海龍）；5）細長呈鞭狀的尖海龍類（小海龍、尖海龍或海針）。同類海龍僅骨環(huán)數(shù)、吻長、體表棘刺有無，形態(tài)大小等具有可定性的區(qū)別，背鰭、胸鰭等數(shù)目難以準確測量，差異不顯著。為確定市售海龍藥材基原，本研究對所有樣品的COI片段進行擴增、測序及比對分析。

2.3.2 PCR和DNA序列分析結果 使用試劑盒提取的海龍類樣品總DNA濃度均大于10 ng/μL，OD260/280在1.5左右，符合中華中醫(yī)藥學會團體標準“T/CACM 010-2016中藥分子鑒別通則”的基本要求。使用COI1490/2198通用引物和條件進行PCR擴增其條帶較弱，部分刁海龍類樣品無法獲得陽性條帶，總測序成功率為66.12%，無法獲得序列的樣品經(jīng)由魚類通用引物對Fish1.F/Fish1.R和Fish2.F/Fish2.R進行重擴增測序，經(jīng)程序調整后均可獲得DNA序列。以3對引物的最小共有PCR擴增產物序列為最終序列，進行BLAST比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析。126條序列長度均為649 bp，共獲得68種單倍型，BLAST比對結果見表3。除單倍型Hap17～Hap23、Hap33、Hap34、Hap38、Hap66～Hap68外，利用NCBI和BOLD數(shù)據(jù)庫鑒別結果均一致，各單倍型序列所對應的物種分別為寶珈槍吻海龍、粗吻海龍、刁海龍、多棘刁海龍、擬海龍、舒氏海龍等6種。為進一步確定各單倍型尤其是兩數(shù)據(jù)庫比對結果不一致的單倍型所對應的物種，對單倍型序列比齊后進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

從Genbank數(shù)據(jù)庫中選擇海龍科不同種屬序列為參照序列，與所獲得的單倍型序列一起，使用BioEdit軟件進行序列對齊后一同構建系統(tǒng)發(fā)育樹，海龍類單倍型序列共可分為6大支。見圖1。21種單倍型與粗吻海龍聚為一類，13種單倍型與擬海龍聚為一支，4種單倍型與刁海龍聚為一支，2種單倍型與多棘刁海龍聚為一支，5種單倍型與寶珈槍吻海龍聚為一支，12種單倍型與舒氏海龍聚為一支，另有11種單倍型單獨分為5支，與BLAST結果相一致。其中單倍型Hap17、Hap18聚為一支，與單倍型Hap19～Hap22及粗吻海龍共同聚為一大支；單倍型Hap32、Hap33聚為一支，與單倍型Hap66及刁海龍共同聚為一大支；單倍型Hap67、Hap68與黃帶冠海龍Corythoichthys flavofasciatus聚為一支。為進一步確定各單倍型所對應的物種，對未能鑒別到種的樣品依據(jù)對應分類學文獻進行全屬物種性狀比較。

2.3.3 DNA和形態(tài)結合的商品海龍基原分析 單倍型Hap32、Hap33、Hap66以超過95%的支持度與刁海龍屬為一支，根據(jù)Dawson的文獻[15]進行形態(tài)鑒別，依據(jù)其骨環(huán)、尾部顏色、體表斑紋特征確定單倍型Hap32、Hap33對應物種為黑斑刁海龍（Solegnathus lettiensis）、單倍型Hap66對應物種為斗氏刁海龍（Solegnathus dunckeri）。以相同的方式，確定單倍型Hap17、Hap18、Hap19、Hap20、Hap21、Hap22為粗吻海龍屬物種序列，根據(jù)Dawson的文獻[16]進行形態(tài)鑒別，粗吻海龍屬僅有3個物種，依據(jù)其吻長、體寬、眼徑、骨環(huán)數(shù)特征確定單倍型Hap17、Hap18對應物種為長吻粗吻海龍（Trachyrhamphus longirostris），單倍型Hap19～Hap22對應物種為光粗吻海龍（Trachyrhamphus bicoarctatus）。單倍型Hap67、Hap68均與黃帶冠海龍（C.flavofasciatus）聚為一支，然而其體環(huán)上緣有細棘齒，體褐色有不明顯橫帶，吻背中央隆起嵴有鋸齒，與黃帶冠海龍不符而與葛氏海蠋魚（Halicampus grayi）相一致。分類上曾將葛氏海蠋魚處理為黃帶冠海龍的亞種（Corythoichthys flavofasciatus conspicillatus），序列有很高的相似性，推斷單倍型Hap67、Hap68對應物種為葛氏海蠋魚。

DNA序列分析結果表明商品名六角海龍基原物種為寶珈槍吻海龍，商品三角海龍基原物種為擬海龍，商品小海龍、尖海龍、海針的基原物種均為舒氏海龍，DNA鑒別結果與形態(tài)鑒別結果完全一致。商品刁海龍共有4種不同基原，分別為刁海龍、多棘刁海龍、黑斑刁海龍和斗氏刁海龍，除多棘刁海龍外，其余3種海龍均符合2015年版《中華人民共和國藥典》的性狀描述，但均非《中華人民共和國藥典》海龍基原物種。其中斗氏刁海龍形態(tài)與2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的刁海龍形態(tài)最為相似，僅尾部骨環(huán)形態(tài)具有區(qū)別，斗氏刁海龍尾部為平行的雙行骨環(huán)，刁海龍為單行骨環(huán)。商品海蛇、粗吻海龍、黑海龍商品為同一類，腹部均為柱狀六棱形，其基原物種包括粗吻海龍、光粗吻海龍、長吻粗吻海龍和葛氏海蠋魚，主要區(qū)別為吻長和骨環(huán)數(shù)，其中光粗吻海龍體細長，吻長1.2～2 cm，尾部骨環(huán)55節(jié)以上；長吻粗吻海龍體粗壯，吻長0.6～1.1 cm，吻背具小棘而呈鋸齒狀，尾部骨環(huán)41～50節(jié)；粗吻海龍體粗壯，吻長0.4～0.8 cm，尾部骨環(huán)41～50節(jié)；葛氏海蠋魚體粗壯，吻短，眼眶大而突出，尾部骨環(huán)32～37節(jié)。

2.3.4 海龍商品的快速性狀鑒別 目前《中華人民共和國藥典》中海龍性狀項較為簡略，無法完全區(qū)分正品和同屬混偽品，而《中國海洋魚類》等分類學著作僅關注原動物形態(tài)，其重要鑒別特征如體表顏色、棘棱位置、背鰭、胸鰭、尾鰭形態(tài)、骨環(huán)的數(shù)目在部分干燥的海龍藥材中難以準確測定或發(fā)生改變，無法準確對海龍進行基原鑒別。故而本研究篩選出海龍商品藥材特征性鑒別點（表4），以達到快速性狀鑒別目的。

3 討論

3.1 市售海龍商品基原及其流變 本研究對主要中藥材市場購買的126批海龍商品進行DNA提取，并進行性狀鑒別和DNA序列分析，結果表明，126批海龍基原物種有刁海龍（14批）、多棘刁海龍（14批）、黑斑刁海龍（14批）、斗氏刁海龍（2批）、寶珈槍吻海龍（14批）、粗吻海龍（14批）、光粗吻海龍（14批）、長吻粗吻海龍（14批）、擬海龍（14批）、葛氏海蠋魚（2批）和舒氏海龍（16批）。其中黑斑刁海龍、斗氏刁海龍、光粗吻海龍、長吻粗吻海龍為首次在中藥市場上發(fā)現(xiàn)，表明近年來海龍商品基原已開始發(fā)生較大的流變。在商品標為刁海龍的樣品中，多棘刁海龍所占比例與前期相比有所減少[2]，但出現(xiàn)了2種新的混偽品黑斑刁海龍和斗氏刁海龍。市場中多家商戶將刁海龍樣品直接標注為澳洲海龍，由于刁海龍和黑斑刁海龍主產南海海域和澳大利亞海域，斗氏刁海龍產澳大利亞海域，市場上的刁海龍也有可能是從澳大利亞進口而來，表明我國海龍藥材進口壓力有所增加，也反映了我國海龍資源減少的現(xiàn)狀。亳州、安國等多個藥材市場的海龍商品中粗吻海龍類已占主流，且從單一的粗吻海龍發(fā)展為粗吻海龍和光粗吻海龍并重，并有長吻粗吻海龍和葛氏海蠋魚混入，顯示出海龍商品物種基原的復雜化。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，市場所稱尖海龍、海針、小海龍的樣品均非正品尖海龍，其基原均為海龍屬舒氏海龍。雖然本研究僅收集到16批尖海龍類樣品，不代表所有市場產品的基原，但其結果也對以海龍入藥的中藥飲片和中成藥質量提出警示。稅丕先、丁維毅等[6-7]認為，海龍商品的基原物種還有藍海龍、低海龍和冠海龍，但均為稀見種，本研究搜集的樣品未出現(xiàn)，可能是多年來市場品種發(fā)生改變的結果。

3.2 分子鑒別用于中藥商品市場調查 中藥商品的市場調查是正本清源，確定鑒別和監(jiān)管目標的前提條件。隨著中藥資源需求量擴大，資源蘊含量減少及中藥國際貿易的進一步深化，市場地方習慣用藥品種、民間藥和民族藥種類以及進口藥材的呈現(xiàn)增加的趨勢，中藥材商品的物種基原日趨復雜，形態(tài)鑒別對于性狀極為相似的近緣物種鑒別日趨困難。分子鑒別方法有望提高中藥商品市場調查的結果準確性和穩(wěn)定性，是傳統(tǒng)市場調查的重要工具和有效補充。溫蓮瓏等[17]對市售海馬商品物種基原進行分析，通過形態(tài)鑒別分為13個物種，而經(jīng)DNA序列分析后修訂10個物種。本研究也發(fā)現(xiàn)粗吻海龍、光粗吻海龍和長吻粗吻海龍DNA序列存在巨大差異，而其形態(tài)非常相似，極易混淆?；贒NA分子鑒別的手段，可以準確識別中藥商品出可能存在的非藥典收載基原物種，確定市場的混偽情況，賈靜等[18]對市售鹿茸粉進行COI測序，發(fā)現(xiàn)62%的商品為馴鹿基原；Newmaster等[19]使用rbcL+ITS2片段對北美12家公司中藥材產品進行測序，發(fā)現(xiàn)59%的商品中含有未在標簽上列出的物種；蔣超等[20-21]使用PCR-RFLP、DNA測序和CCP-FRET熒光標記對我國藥店、醫(yī)院和飲片生產企業(yè)的鹿茸和川貝母飲片進行檢測，發(fā)現(xiàn)67.8%的川貝母和52.8%的鹿茸均含有混偽品，市售鹿茸基原物種包括馴鹿、騾鹿、白唇鹿和麋鹿等。但僅通過DNA序列分析或形態(tài)鑒別均進行物種基原鑒別均存在一定的局限性。受限于核酸序列數(shù)據(jù)庫的準確性和完備程度，部分樣品進行比對時僅在屬這一層級具有高的支持度（>95%），在物種層級則容易出現(xiàn)錯誤。見表2、圖2。而在確定屬的情況下，通過對標本和圖片進行核對，可以進一步確定其基原物種。

將分子鑒別手段和形態(tài)鑒別結合品種鑒別的步驟如下：通過廣泛采集有代表性的商品藥材→對樣品進行DNA提取和標準片段測序→分析單倍型的種類，進行序列比對從而確定商品藥材所對應的屬→對照樣品的模式標本、模式圖片或分類學文獻，根據(jù)分類特征確定基原物種。在必要時，可以取經(jīng)過確證動植物標本進行測序，與所獲得的單倍型序列進行比對，進行交叉驗證是否為同一物種。進而，在確定市場基原物種的情況下，根據(jù)各同類藥材的共有特征，總結出核心鑒別點，將進一步規(guī)范中藥商品市場，提高中藥質量標準。

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