兩種中藥酊劑微生物限度方法適用性研究

楊群，肖文濤

九江市食品藥品檢驗所，江西 九江 332000

酊劑系指將原料藥物用規(guī)定濃度的乙醇提取或溶解而制成的澄清液體制劑，微生物污染情況是重要的藥品質(zhì)控指標(biāo)［1,2］。按照《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部規(guī)定，非無菌產(chǎn)品需做微生物限度檢査，且需采用通過方法適用性試驗的檢查方法。本研究中兩種酊劑復(fù)方補芷酊、養(yǎng)血首烏酊由不同中藥原料經(jīng)乙醇提取制成，由于提取溶劑為75%的乙醇，以及中藥原料固有成分的復(fù)雜性，存在不同程度的抑菌作用。依據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1105、1106、1107 要求，制劑進行微生物限度檢查前應(yīng)先消除其抑菌活性，避免試驗干擾。本文對兩種酊劑需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌進行試驗，通過適用性試驗研究，消除制劑的抑菌性，建立準(zhǔn)確可靠的微生物限度檢查方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LMQ.C型高壓蒸汽滅菌器（山東新華儀器有限公司）；YP1002N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；BSC-1304IIB2型生物安全柜（蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）；LRH-150型細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SPX-150型霉菌培養(yǎng)箱（揚州慧科科學(xué)儀器有限公司）；GHP-9162型生化培養(yǎng)箱（揚州慧科科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑、試藥及培養(yǎng)基

復(fù)方補芷酊（批號：20200110、20200122、20200205）、養(yǎng)血首烏酊（批號：20200106、20200117、20200203），均由景德鎮(zhèn)市皮膚病醫(yī)院提供。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：190329），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：190518），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：190402），pH 7.0 氯化鈉緩沖蛋白胨水（批號：200319），均為北京陸橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；溴化十六烷基三甲胺瓊脂（批號：1073801），甘露醇氯化鈉瓊脂（批號：3102307）均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 工作菌株

枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501（批 號：200411），金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003（批號：200305），銅綠假單胞菌CMCC（B）10104（批號：200317），白色念珠菌CMCC（F）98001（批號：201108），黑 曲 霉CMCC（F）98003 （批號：200514），均由北京三藥技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

復(fù)方補芷酊和養(yǎng)血首烏酊均為皮膚給藥制劑，其微生物限度標(biāo)準(zhǔn)如下：需氧菌總數(shù)不超過100 cfu/mL（1 mL或1 g可接受的最大菌數(shù)為200 cfu），霉菌和酵母菌總數(shù)不超過10 cfu/mL（1 mL或1 g可接受的最大菌數(shù)為20 cfu），不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（1 mL）。

2.1 菌液制備

取枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉凍干物，分別吸取復(fù)溶液1 mL加入菌株西林瓶中，蓋上瓶蓋，靜置5～10 s，渦旋震蕩5～10 s。吸取1 mL加入9 mL無菌生理鹽水，混勻，逐級進行10倍稀釋，最終使其含菌數(shù)約5 000～10 000 cfu/mL。

2.2 供試液制備

取供試品10 mL，置錐形瓶中，加無菌生理鹽水至100 mL，震蕩混勻，作為1∶10供試液。

2.3 回收測定（平皿法）

2.3.1 需氧菌總數(shù)計數(shù)實驗組：取供試液9.9 mL，加入適宜濃度的試驗菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL供試品中含菌量不大于100 cfu。取1 mL注入平皿，立即注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h逐日觀察結(jié)果。

供試品對照組：取上述供試液，以稀釋液代替菌液，同實驗組操作，測定供試品本底菌數(shù)。

菌液對照組：取相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

2.3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)實驗組：取上述試液9.9 mL，加入適宜濃度的試驗菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL供試品中含菌量不大于100 cfu。取1 mL注入平皿，立即注入沙氏瓊脂培養(yǎng)基，置25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～120 h逐日觀察結(jié)果。供試品對照組：取上述供試液，以稀釋液代替菌液，同實驗組操作，測定供試品本底菌數(shù)。菌液對照組：取相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

2.4 回收計算

按如下公式計算試驗組的加菌回收比例：

表1 試驗組加菌的回收率 %

由表1可見，平皿法對金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌有極強的抑制作用，選用薄膜過濾法對需氧菌進行試驗。

2.5 回收測定（薄膜過濾法）

2.5.1 實驗組取供試液1 mL，采用薄膜過濾法，每筒用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL分3次沖洗，在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu的試驗菌，濾干，立即貼膜與胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h逐日觀察結(jié)果。

2.5.2 供試品對照組取上述供試液，以稀釋液代替菌液，同實驗組操作，測定供試品本底菌數(shù)。

2.5.3 菌液對照組取相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

表2 試驗組加菌的回收率 %

由表2可見，薄膜過濾法可消除制劑的抑菌作用，選用薄膜過濾法對需氧菌進行試驗。

2.6 樣品細(xì)菌、霉菌和酵母菌檢查結(jié)果

取復(fù)方補芷酊和養(yǎng)血首烏酊各3批，需氧菌總數(shù)按照薄膜過濾法操作步驟，霉菌和酵母菌總數(shù)按照平皿法操作步驟，對6批樣品進行微生物限度檢查，結(jié)果顯示，樣品中需氧菌總數(shù)均小于10 cfu/mL、霉菌和酵母菌總數(shù)均小于10 cfu/mL，符合相關(guān)規(guī)定。

2.7 控制菌檢查結(jié)果

取復(fù)方補芷酊和養(yǎng)血首烏酊各3批，金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌按照薄膜過濾法操作步驟，結(jié)果顯示，樣品中金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌均未檢出。

3 討論

兩種制劑采用平皿法檢驗時，對需氧菌有明顯抑菌作用，金色葡萄球菌和銅綠假單孢菌回收率遠(yuǎn)低于70%，對霉菌則無影響。該兩種醫(yī)院制劑由75%乙醇提取制成，經(jīng)測定制劑乙醇實際濃度60%～70%，乙醇溶劑20%即具有不同程度的抑菌作用。同時中藥成分復(fù)雜，自身也存在不同程度的抑菌作用，其抗菌作用不僅體現(xiàn)在方劑有效成分對細(xì)菌直接抑殺，同時還表現(xiàn)在方劑中各味藥多種成分相互作用的綜合效應(yīng)上［3］?？紤]兩種制劑均有一定的抑菌性，且易溶于水，采用薄膜過濾法可快速、有效地去除藥品中所含有的抑菌性，提高檢驗的效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性［4］，而平皿法相對簡單經(jīng)濟，微生物檢驗時可根據(jù)實際情況采用不同稀釋級的平皿法或薄膜過濾法檢測［5］。

本研究根據(jù)其對不同菌種的抑菌特性，可采用薄膜過濾法測定需氧菌，平皿法測定霉菌及酵母菌，結(jié)果可靠，回收率均達(dá)到0.5～2.0。建立了可靠的微生物檢查方法，消除干擾，為含抑菌成分的外用制劑的微生物限度檢查方法適用性試驗的研究提供參考和研究思路，進一步保證制劑的檢測可靠性和科學(xué)性。