天然化合物防治茄科青枯勞爾氏菌研究進(jìn)展

王琳琳，張恒愷，陳欣鑫，陳立，李建科

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710119）

青枯病（bacterial wilt）是由茄科青枯勞爾氏菌（）俗稱青枯菌引起的茄科植物萎調(diào)病，在我國長江流域及南方地區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。青枯菌寄主范圍廣泛，地理分布廣泛，青枯菌能夠在沒有寄主的情況下長期存活于土壤中[1]。青枯病一旦暴發(fā)就難以控制，造成作物的大面積萎蔫死亡甚至絕收[2]。是作為全世界危害最大的土傳病害之一?，F(xiàn)有的防控措施如化學(xué)防治、嫁接輪作、土壤改良和抗病品種培育等效果均不理想，并且存在污染環(huán)境和引起病菌抗性等諸多隱患。因此發(fā)展環(huán)境友好型的防治措施、開發(fā)新型天然抗菌化合物，成為青枯菌防治研究的熱點(diǎn)。

天然抗菌化合物因具有無毒、無污染和生物相容性好等特點(diǎn)被廣泛關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)天然化合物主要通過兩種途徑抑制病原菌增殖：一是破壞病原菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，改變菌體形態(tài)，影響細(xì)胞滲透性；二是干擾病原菌致病相關(guān)蛋白表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)[3-4]。本文就不同來源天然化合物的抑菌現(xiàn)狀，探究其對(duì)青枯菌的抑制機(jī)理，為青枯病的防治探尋環(huán)保新方法。

1 青枯病的防治方法

青枯菌通常從植物次生根部或莖部的傷口侵入，在根皮層細(xì)胞間隙定植，侵染皮層組織，然后感染侵入木質(zhì)部導(dǎo)管薄壁組織，分泌大量胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS），阻塞導(dǎo)管內(nèi)水分運(yùn)輸，從而引起植物萎蔫死亡[5]。青枯菌致病機(jī)理的研究滯后，導(dǎo)致了青枯病防治上的困難。

目前青枯病的防治以預(yù)防為主，結(jié)合土地輪種和抗性品種培育等方式控制病害。但是這種傳統(tǒng)的方法有一定的局限性，輪種不能徹底抑菌，而抗性品種由于病原菌變化快也容易喪失抗性。化學(xué)防治是目前防治青枯病的主要方法，但存在農(nóng)殘和污染環(huán)境等潛在危害。噬菌體和生防菌等生物防治方法具有效果好、無藥害等優(yōu)點(diǎn)，但是噬菌體防治青枯病易受到寄主范圍的限制，這也是噬菌體未能廣泛地推廣的原因。生防菌是近年來生物防治的研究熱點(diǎn)，但是因土壤環(huán)境復(fù)雜多樣，利用生防菌防控病害的效果并不穩(wěn)定。在這一背景下，環(huán)境友好型天然抗菌化合物的研發(fā)受到青睞。

2 抑制青枯菌的天然化合物及其研究現(xiàn)狀

2.1 植物來源的抑菌化合物

植物含有種類豐富的天然抗菌化合物，這些抗菌化合物易于降解、對(duì)環(huán)境友好、來源豐富。目前研究的植物天然抗菌化合物主要是植物各級(jí)組織的提取物或是其次生代謝產(chǎn)物，按化學(xué)結(jié)構(gòu)可劃分為酚類、生物堿類、黃酮類、醇類、苷類、醛類、醌類、有機(jī)酸類等[6]。

2.1.1 酚類

目前有很多酚類物質(zhì)能有效抑制青枯菌。張恒愷等[7]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚可顯著抑制青枯菌增殖及其細(xì)菌泳動(dòng)能力（swimming mobility）。掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)茶多酚作用于青枯菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞壁遭到明顯破壞，推測細(xì)胞膜的通透性增加導(dǎo)致了金屬離子和蛋白質(zhì)外滲，進(jìn)而使細(xì)胞代謝發(fā)生紊亂，逐漸破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Wanming Bai 等[8]研究發(fā)現(xiàn)紫丁香花蕾中的主要抗菌成分丁香酚可以顯著抑制青枯菌，導(dǎo)致鞭毛消失，內(nèi)容物泄漏和出現(xiàn)空腔。SDS-PAGE 顯示丁香酚降低了青枯菌中的蛋白質(zhì)含量，降低了中型碳水化合物的利用，并抑制了過氧化氫酶和琥珀酸脫氫酶的活性。

2.1.2 精油類

植物精油是廣泛存在于植物中的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抑菌廣譜、通用性好等優(yōu)點(diǎn)。Paret 等[9]比較了三種精油化合物（玫瑰草精油、桉樹精油、香茅精油）對(duì)青枯菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)三者都能破壞青枯菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起胞內(nèi)物質(zhì)氨基酸、核酸、脂類、碳水化合物等活性成分流失。黃雯等[10]比較了薄荷精油、草果精油、薰衣草精油、山蒼子油對(duì)青枯菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)這四種精油對(duì)于青枯菌都具有抑制活性，并發(fā)現(xiàn)山蒼子油抑菌主要成分為烯烴類化合物，抑菌機(jī)理需要進(jìn)一步探究。

2.1.3 醛醇類

醛類、醇類化合物具有抑菌作用，通常把高濃度醛醇作為抑菌劑。于艷梅等[11]比較了四種植物源化合物香豆素、原兒茶醛、香荊介酚和白藜蘆醇對(duì)青枯菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)這四種天然化合物不同程度地影響了青枯菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、泳動(dòng)能力和生物膜形成能力。郭兵等[12]通過探究玉米中重要的次生代謝產(chǎn)物2,4-二羥基-7-甲氧基-2H-1,4-苯并嗪-3(4H)酮（丁布，DIMBOA）對(duì)青枯菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)DIMBOA 及其衍生物能抑制青枯雷爾氏菌生物膜的形成和泳動(dòng)性，且抑制作用具有顯著的濃度效應(yīng)，同時(shí)-Cl 和-SH 取代基能夠提高抑菌活性。

2.1.4 其它類物質(zhì)

除了酚類、精油類、醛醇類等，還有很多天然化合物具有抑制青枯菌的效果。如Fan 等[13]發(fā)現(xiàn)甲基沒食子酸對(duì)青枯菌有較強(qiáng)的抑制作用，掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，甲基沒食子酸能夠損傷青枯菌細(xì)胞壁。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其能干擾青枯菌蛋白質(zhì)合成，抑制琥珀酸脫氫酶和胞外酶的活性，從而抑制青枯菌增殖。李麗萍等[14]通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭提取物可影響青枯菌鞭毛形態(tài)。王翠穎等[15]發(fā)現(xiàn)木麻黃的單寧提取物能夠顯著影響青枯菌生物膜的合成。此外，有研究者還從多種植物中提取活性成分，發(fā)現(xiàn)其提取物如厚樸皮和葉的提取物、大蒜提取物、莧菜提取物、長葉苦竹提取物、苦參生物堿等都對(duì)青枯菌顯示出了一定的抑菌活性[16-17]。

總之，目前多數(shù)植物源化合物對(duì)青枯菌的抑制機(jī)理都不明確，研究水平多限于細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)外流等層面。西南大學(xué)Yang 等[18]從基因水平解析了天然植物源化合物抑制青枯菌的機(jī)理，研究發(fā)現(xiàn)具有苯環(huán)和-吡咯烷環(huán)的植物源化合物能夠影響青枯菌III 型分泌系統(tǒng)（Type III secretion system，T3SS）的表達(dá)。傘形酮（umbelliferone）為一種7-羥基香豆素，能夠通過和途徑抑制T3SS 調(diào)控基因表達(dá)，降低6 個(gè)T3SS 效應(yīng)子的基因表達(dá)水平。

2.2 動(dòng)物來源的抑菌化合物

近年來，來源于動(dòng)物及其附屬物的天然抗菌物質(zhì)越來越多，這些成分來自于動(dòng)物外殼、內(nèi)臟等，它們來源廣泛、易于降解、抗菌活性好。這些天然抗菌物質(zhì)能夠損傷細(xì)胞并有效抑制青枯菌增殖，但抑制機(jī)理需要進(jìn)一步探尋。目前研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖等組分對(duì)青枯菌有較好的抑制作用，這使它成為研究的熱點(diǎn)，未來有望開發(fā)成新型抑菌劑。昆蟲體內(nèi)包含能抑制青枯菌活性的物質(zhì)，比如蜂膠、天蠶抗菌肽等。這些物質(zhì)具有天然無公害、抑菌廣泛等優(yōu)點(diǎn)，主要通過破壞菌體形態(tài)、抑制游動(dòng)性等來抑制青枯菌的活性。目前還有許多昆蟲來源的天然化合物具有抑菌作用，但是機(jī)理不明。

2.2.1 殼聚糖

殼聚糖（chitosan）又稱脫乙酰甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)（chitin）經(jīng)過脫乙酰作用后得到的，是蟹、蝦等昆殼類動(dòng)物外殼的重要成分，在自然界中資源豐富。殼聚糖安全無毒，易于生物降解，且具有較好的抗菌活性，能夠抑制真菌、細(xì)菌和病毒增殖[19-20]。蘇婷等[21]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖能較好地抑制青枯菌增殖。掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)殼聚糖處理后的青枯菌細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞外膜分離，且細(xì)胞內(nèi)部形成空泡，影響細(xì)胞通透性，滲透壓失衡。同時(shí)，青枯菌的生物膜形成量也受殼聚糖的影響，但殼聚糖對(duì)青枯菌的抑制機(jī)理仍不清楚。

2.2.2 核黃素

核黃素（Riboflavin）又稱為維生素B2，主要功能是作為輔酶促進(jìn)代謝，廣泛存在于各類食品中。它是許多動(dòng)物生長的必需因素，所以在肝臟、蛋、奶等動(dòng)物性食品中的含量很高。核黃素可以激活煙草細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物的積累增加，從而抑制青枯菌。Liu Fei 等[22]發(fā)現(xiàn)核黃素可以在煙草細(xì)胞中引起防御反應(yīng)，促進(jìn)煙草細(xì)胞中總酚類化合物、香豆素和木質(zhì)素的積累。當(dāng)將其用于受寄生性瘧原蟲和茄形青枯菌侵染的煙草植物時(shí)，核黃素處理分別產(chǎn)生47.9%和48.0%的保護(hù)作用。這些結(jié)果表明核黃素可以在細(xì)胞懸浮液中誘導(dǎo)一系列防御反應(yīng)和次級(jí)代謝，并保護(hù)煙草免受寄生性瘧原蟲和青枯菌的侵害。

2.2.3 蜂膠

蜂膠是蜜蜂科昆蟲采集的植物樹脂與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的具有黏性的固體膠狀物，是一種傳統(tǒng)的天然藥物，具有廣泛的藥理學(xué)活性，如抗菌、抗病毒、抗病原蟲等。許晏等[23]研究發(fā)現(xiàn)蜂膠渣的乙醇提取物對(duì)青枯菌具有良好的抑制活性，蜂膠渣35%乙醇提取物能夠破壞青枯菌形態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞膜粗糙甚至破裂，部分細(xì)胞生長畸形。并且，蜂膠渣提取物的濃度與其對(duì)青枯勞爾氏菌泳動(dòng)的抑制作用呈近似的正相關(guān)。Esin Basim 等[24]研究了土耳其花粉和蜂膠提取物對(duì)13 種不同農(nóng)業(yè)細(xì)菌病原體的“體外”抗菌活性，發(fā)現(xiàn)番茄青枯雷爾氏菌在細(xì)菌的敏感性中排第三位，對(duì)測試細(xì)菌的最低活性濃度是花粉提取物的1/100 和蜂膠提取物的1/1 000。

2.2.4 抗菌肽

抗菌肽是生物體產(chǎn)生的一種具有抗菌活性的多肽，廣泛存在于自然界中。江仕龍等[25]以天蠶抗菌肽（Cecropin）為基礎(chǔ)，修飾合成新型多肽色氨酸-賴氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-亮氨酸-賴氨酸-酪氨酸-亮氨酸（WKLFKKILKYL）對(duì)青枯菌有較好的抑制效果，其抑菌圈顯著增大。該新型抗菌肽的疏水性基團(tuán)占54%，推測其可能直接作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性、造成細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。利用基因工程技術(shù)和微生物發(fā)酵技術(shù)繁殖，具有抗菌活性的新型抗菌肽，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治青枯病，是一種全新的生物防治技術(shù)。李乃堅(jiān)等[26]采用花粉管通道技術(shù)，將天蠶抗菌肽B 基因質(zhì)粒導(dǎo)入到不同煙草子房中，經(jīng)過基因轉(zhuǎn)化和青枯菌的抗病性鑒定獲取抗病植株，并多代接種青枯菌鑒定，然后對(duì)植株進(jìn)行胭脂堿檢測、點(diǎn)印跡雜交、PCR 擴(kuò)增和Southern 印跡雜交檢測。結(jié)果表明，天蠶抗菌肽月基因已導(dǎo)入煙草基因組，并獲得了抗性后代。田間發(fā)病率和病情指數(shù)分析顯示T3 代轉(zhuǎn)基因株系耐病能力增強(qiáng)，病情也明顯減輕。T4 代各株系均來自T3 代株系中抗病力最強(qiáng)的單株，抗青枯病能力更強(qiáng)。

3 小結(jié)

青枯病防治較困難，目前關(guān)于青枯菌的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥為主，但效果不理想且對(duì)環(huán)境造成污染。從自然界獲取天然化合物來防治青枯菌具有廣闊的前景，但天然化合物的提取加工工藝復(fù)雜，并且抑菌機(jī)理不明確。隨著人們對(duì)綠色農(nóng)業(yè)的認(rèn)可，開發(fā)利用環(huán)境友好型天然化合物防治青枯菌成為大勢所趨。尋找、開發(fā)天然抑菌物質(zhì)，制備生物農(nóng)藥，對(duì)于防治青枯菌獲取經(jīng)濟(jì)效益具有重要的意義，環(huán)境友好型抑菌劑未來將有廣泛的應(yīng)用。