葡萄籽油有效成分分析方法研究進(jìn)展

劉青，劉煜琦銘，田慧敏，邱一秀，宋元達(dá)

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東淄博 255000）

葡萄籽油（Grape seed oil）是由釀造葡萄酒或果汁壓榨的副產(chǎn)物葡萄籽進(jìn)一步加工獲得的高級(jí)食用油[5]。葡萄籽油常見的提取方法有機(jī)械壓榨、水酶法、超聲波和微波輔助提取法、有機(jī)溶劑提取法、超臨界提取法、亞臨界提取法等[6]。葡萄籽油因其具有獨(dú)特的酒香、葡萄清香和多種營(yíng)養(yǎng)成分而被消費(fèi)者公認(rèn)為是一種無(wú)毒無(wú)害、完全符合食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的功能型油脂，并具有較高的營(yíng)養(yǎng)保健和食療功效[3]。葡萄籽油是一種極具商業(yè)價(jià)值的食用油，已在意大利和法國(guó)兩地被充分開發(fā)，目前歐美和日本等國(guó)家和地區(qū)，葡萄籽油被用作嬰兒和老人的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)油。葡萄籽油以其較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和優(yōu)越的生物活性效應(yīng)已經(jīng)成為一種極具潛力的產(chǎn)品，其在制藥和食品領(lǐng)域的應(yīng)用日趨活躍，具有十分可觀的市場(chǎng)前景和經(jīng)濟(jì)效益。

葡萄籽油中的不飽和脂肪酸占總脂肪酸的91%以上[7]。其中亞油酸和油酸是主要組成成分，占總脂肪酸的86%～91%，屬于典型的亞油酸-油酸型油脂[8]。此外，葡萄籽油含有大量的生物活性成分，包括維生素E（VE）[9-10]、植物甾醇[11,12]、多酚[13,14]、角鯊烯[9]和類胡蘿卜素[15]等，這些健康伴隨物的存在使得葡萄籽油具有較高的營(yíng)養(yǎng)保健作用，可以增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝、抗癌、降低膽固醇，具有減肥、調(diào)節(jié)血糖和血脂、延緩動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化等功能。

本文對(duì)近年來(lái)葡萄籽油中有效成分的分析方法進(jìn)行了綜述，以期對(duì)今后深入研究葡萄籽油的成分差異提供參考，為開發(fā)更高效的分析方法提供依據(jù)。

1 葡萄籽油有效成分及其分析方法

1.1 脂肪酸

葡萄籽油的重要組成成分是脂肪酸，研究表明，葡萄籽油中常見脂肪酸為亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸等[16]。其中，亞油酸和油酸均可與低密度脂蛋白顆粒結(jié)合，抑制其氧化，使總血清膽固醇和壞膽固醇的沉積量下調(diào)，從而可以防治高血壓、冠心病、高膽固醇疾病以及減少動(dòng)脈粥樣硬化的形成[5,17]。此外，亞油酸還具有免疫[18]、抗腫瘤[19]、抗病毒[20]等作用。

脂肪酸的檢測(cè)方法主要是氣相色譜法（GC）。氣相色譜法適用于沸點(diǎn)低于400 ℃的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物，近年來(lái)采用高靈敏選擇性檢測(cè)器，比如FID、TCD 和ECD 等，配合高效能的化學(xué)鍵合毛細(xì)管色譜柱，使氣相色譜法具有分離效果好、靈敏度高、速度快和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。楊碧霞等[21]對(duì)葡萄籽油進(jìn)行甲酯化處理，采用氣相色譜分析了其中的主要脂肪酸組成。結(jié)果顯示葡萄籽油的成分以不飽和脂肪酸為主，包括亞油酸和油酸，總含量超過(guò)88%；飽和脂肪酸主要是硬脂酸和棕櫚酸，其中硬脂酸含量為3.6%，棕櫚酸含量為8.1%。趙雅霞[22]對(duì)15 種品牌的葡萄籽油進(jìn)行了甲酯化前處理，用氣相色譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示15 種葡萄籽油的幾種不飽和脂肪酸平均含量是亞油酸71.7%、油酸16.2%、棕櫚酸7.3%、硬脂酸4.1%、亞麻酸0.41%、芥酸0.21%。目前，隨著質(zhì)譜技術(shù)在分析領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，可以在色譜分析技術(shù)的基礎(chǔ)上大大提高定性定量分析的靈敏度和檢測(cè)效率，逐步成為一種高效分離鑒定的儀器分析技術(shù)。邊梅娜等[18]對(duì)赤霞珠葡萄籽油進(jìn)行甲酯化處理后，利用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀對(duì)其中的脂肪酸成分和含量進(jìn)行了研究。采用GC-MS 法共鑒定出30 種化合物，亞油酸的相對(duì)含量最高，達(dá)到80.83%。唐春江等[23]以刺葡萄籽為原料，采用超臨界法萃取了刺葡萄籽中的脂肪酸，利用GC-MS 鑒定了刺葡萄籽油的成分分析；并利用質(zhì)譜庫(kù)對(duì)各個(gè)組分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確定，鑒定出刺葡萄籽油脂肪酸成分為亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、十三烷酸、壬酸和亞麻酸。其中不飽和脂肪酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86%。

1.2 維生素E

維生素E 的含量在葡萄籽油中較大，主要分為生育酚和生育三烯酚兩個(gè)亞族。每一類都有、、和共4種單體。生育酚是一種普遍存在于植物油中的天然抗氧化劑，其提供的H 離子可以與R·或ROO·自由基結(jié)合，從而中斷氧化反應(yīng)。另外，單線態(tài)氧也能被生育酚自身的酚-氧基團(tuán)猝滅，抑制植物油中雙鍵或三鍵的氧化[5,24]。α-生育酚和-生育三烯酚可以誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋零，抑制膽固醇的合成，減少肥胖以及肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生[25]。另外，-和-生育三烯酚可以通過(guò)降低體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞的增殖行為，預(yù)防腫瘤的產(chǎn)生[26]。

生育酚和生育三烯酚的檢測(cè)主要采用液相色譜法。高效液相色譜法是目前應(yīng)用極為廣泛的一種化學(xué)分離分析方法，主要適用于沸點(diǎn)高、極性大、熱不穩(wěn)定的有機(jī)和無(wú)機(jī)類化合物，具有高壓、高速、高效、高靈敏度的特點(diǎn)。Wie 等[27]對(duì)14 種葡萄籽油中的總維生素E 含量和組成進(jìn)行分析，結(jié)合保留值定性、外標(biāo)法定量的方法利用高效液相色譜對(duì)樣品進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)維生素E 主要以-生育酚、-生育三烯酚、-生育三烯酚和-生育酚四種形式存在，其中主要成分是-生育三烯酚，含量范圍是11.2～53.81 mg/100 g；其次是-生育三烯酚和-生育酚；-生育酚的含量最低，范圍是0.70～4.39 mg/100 g。趙芳等[28]利用正己烷溶解油脂樣品，通過(guò)HPLC-FLD 對(duì)葡萄籽油和亞麻籽油中的維生素E 進(jìn)行定量測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維生素E 在兩種油中的含量分別為38.8 mg/100 g 和41.38 mg/100 g。王向云等[29]采用國(guó)標(biāo)GB/T 26635-2011中的方法對(duì)葡萄籽油進(jìn)行皂化、有機(jī)試劑提取方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣HPLC 進(jìn)行分析，測(cè)得葡萄籽原油中VE 含量為(52.520.029)mg/100 g。

1.3 植物甾醇

植物甾醇（Phytosterol or Plant sterol）是一類在C4 位上由于甲基數(shù)目的差異，C11 位上側(cè)鏈長(zhǎng)度、雙鍵的不同，且以3 個(gè)側(cè)鏈環(huán)戊烷全氫菲甾核為骨架而形成的一系列多種不同形式的甾體化合物[5]。植物甾醇是一類極有意義的天然甾醇資源，在自然界廣泛分布，主要以游離甾醇、甾醇酯、甾醇糖苷和?；薮继擒战Y(jié)構(gòu)存在于植物油、堅(jiān)果及谷物中[30]。據(jù)報(bào)道，植物甾醇具有良好的抗氧化能力，可以抑制油脂的酸敗反應(yīng)，延緩氧化[31]。而且植物甾醇還具有抑制血清總膽固醇吸收[32]、抗腫瘤和抗菌抗炎癥[27,33]等作用。

植物甾醇的分析方法主要有硫磷鐵比色法、氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。植物甾醇可以與磷硫鐵顯色劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的紫紅色化合物，該化合物可吸收特定可見光波長(zhǎng)（680 nm），依據(jù)郎伯比爾定律，可以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品中甾醇的含量[34]。彭麗霞等[11]以4 種葡萄籽為原料，提取得葡萄籽油，經(jīng)皂化、萃取制得植物甾醇。首先采用硫磷鐵比色法測(cè)定甾醇含量，后利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定甾醇組成并進(jìn)行定量分析。結(jié)果從葡萄籽油中共檢測(cè)到6 種甾醇，分別是菜油甾醇、豆甾醇、-谷甾醇、巖藻甾醇、豆甾烷醇和環(huán)木菠蘿烯醇。其中-谷甾醇含量最高，約占總甾醇的50%以上。以氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)得6 種甾醇在每種葡萄籽油中的總和明顯小于以硫磷鐵比色法檢測(cè)的結(jié)果。這說(shuō)明比色法的準(zhǔn)確度一般，因?yàn)樵谄咸炎延椭胁恢圭薮?硫磷鐵配合物在680 nm 下有吸收，其他沒(méi)有被皂化的雜質(zhì)可能也參與了顯色，從而使響應(yīng)值偏大。Dulf 等[35]利用氣相色譜分析了包括葡萄籽油在內(nèi)的四種植物油中各甾醇的組分含量差異。利用固相萃取小柱（SPE）對(duì)甾醇進(jìn)行分離后，對(duì)其進(jìn)行皂化提取，衍生為三甲基甲硅烷基醚，進(jìn)樣GC-FID 進(jìn)行分析。根據(jù)保留值定性峰面積定量，測(cè)得葡萄籽油中總甾醇含量高達(dá)301.10 mg/100 g。

1.4 酚類物質(zhì)

植物油中的多酚類物質(zhì)是分子中具有多個(gè)羥基酚類植物成分的總稱，是植物源食品中的常見組成成分，也是人類飲食中重要的活性物質(zhì)，其獨(dú)特的多元酚結(jié)構(gòu)賦予了它們豐富多樣的生物活性[36]。近年來(lái)，多酚由于具有良好的抗氧化活性備受關(guān)注。有研究者提出多酚具有強(qiáng)有力的自由基清除活性[37]。在油脂的氧化過(guò)程中，分子中的鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)可以通過(guò)多酚與促進(jìn)氧化的分子結(jié)合而阻斷[38]。同時(shí)，多酚對(duì)癌癥、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化具有積極的預(yù)防作用，是一種治療心血管疾病的有效輔助劑[39]。

由于多酚類物質(zhì)大多在紫外-可見光譜區(qū)有吸收響應(yīng)，因此紫外-可見分光光度計(jì)和高效液相-紫外檢測(cè)器常被用于多酚類物質(zhì)的測(cè)定。Bjelica 等[40]收集了不同釀酒階段的葡萄籽并對(duì)其進(jìn)行冷榨處理，對(duì)得到的8 種葡萄籽油樣品進(jìn)行了成分分析。首先利用福林酚-紫外可見分光光度計(jì)法對(duì)總酚進(jìn)行了測(cè)定，含量范圍是(7.921.50)～(24.920.93)mgGAE/kg。然后，利用HPLC-DAD 串連三重四級(jí)桿質(zhì)譜分別對(duì)多酚類物質(zhì)進(jìn)行具體分析，經(jīng)過(guò)C18 反相柱梯度洗脫，利用標(biāo)準(zhǔn)品鑒定得出8 種葡萄籽油中含量最高的是熊果酸（34.1～247 mg/kg），其次分別是白藜蘆醇、山柰酚和香草酸，但含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于熊果酸。Zeliha[41]利用LC-QTOF-MS 分析了5 種土耳其產(chǎn)的冷榨葡萄籽油中多酚成分。通過(guò)Metlin-Metabolomic 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共鑒定了77 種多酚化合物，包括常見的木犀草素、山柰酚、槲皮黃素和芹黃素等。后期的抗氧化試驗(yàn)表明，葡萄籽油的DPPH 自由基清除能力(31.00%0.349%)～(45.31%0.116%)與樣品中多酚種類多少成正比。

1.5 其他成分

角鯊烯是一種高度不飽和脂肪族烴類化合物，又名鯊烯，最初是在黑鯊魚肝油中發(fā)現(xiàn)的。角鯊烯主要來(lái)自于深海鯊魚肝油，同時(shí)也少量存在于植物油中的不皂化物中，含量雖然稀少，卻具有極強(qiáng)的生理活性，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[42]、抗衰老[43]、抗菌[44]功能，可有效預(yù)防和抑制化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸癌、胰腺癌、皮膚癌等多種癌癥的發(fā)生[45]。由于在植物油脂中存在量較少，因此需要靈敏度高、檢測(cè)限低的分析儀器，一般用GC-MS 進(jìn)行分析。Zhao 等[46]采用GC-MS 方法從葡萄籽油中檢測(cè)出少量的角鯊烯活性物質(zhì)（17.81 mg/100 g）。Wen 等[9]用GC-MS 分析了我國(guó)5種葡萄籽油中的角鯊烯含量，檢測(cè)出10.20～16.29 mg/100 g微量的角鯊烯物質(zhì)。另外，葡萄籽油中還含有其他微量活性成分，如-胡蘿卜素。-胡蘿卜素是一種在自然界中廣泛存在的，極具抗氧化功能的活性物質(zhì)。Silva 等[47]利用HPLC-DAD 方法測(cè)得葡萄籽油中含有11.94 mg/kg 的-胡蘿卜素。

2 小結(jié)

作為一種新型食用植物油，葡萄籽油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，在抗氧化、抗衰老、預(yù)防及治療心血管疾病和抗癌等方面的功效顯著。葡萄的品種和產(chǎn)地不同，葡萄籽油中含有的活性成分也不盡相同。另外，葡萄籽經(jīng)過(guò)一系列提取、純化、精煉、儲(chǔ)藏等處理過(guò)程，其中的有效成分也會(huì)隨之損失一部分，這也必然會(huì)影響葡萄籽油的品質(zhì)和相關(guān)活性。目前常用的葡萄籽油提取方法包括溶劑提取法、壓榨法、超聲波提取法、微波輔助提取法、超臨界CO2萃取法等。由于不同的提取方法對(duì)葡萄籽油中有效成分的組成和含量影響差異較大，因此了解關(guān)于葡萄籽油的有效成分分析方法是進(jìn)一步考察其品質(zhì)和對(duì)功能性影響的基礎(chǔ)和前提。本文針對(duì)葡萄籽油中主要成分的分析方法進(jìn)行了探討，通過(guò)分析得出普通分光光度計(jì)法應(yīng)用廣泛，操作簡(jiǎn)單，但靈敏度較低，容易漏檢或誤判。隨著分析儀器的發(fā)展，色譜法被較多地應(yīng)用到葡萄籽油成分測(cè)定中，氣相色譜和液相色譜法對(duì)大多數(shù)有效成分的微量檢測(cè)有較高的準(zhǔn)確度；色譜-質(zhì)譜聯(lián)用可以更精確的鑒定化合物，對(duì)痕量化合物的定性定量分析更準(zhǔn)確，靈敏度也更高，在葡萄籽油有效成分的分析中會(huì)將越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用。通過(guò)對(duì)葡萄籽油中有效成分及分析方法的總結(jié)，以期為將來(lái)開發(fā)葡萄籽油多組分同步快速檢測(cè)方法、構(gòu)建特征指紋圖譜，建立準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定的微量成分檢測(cè)方法提供理論參考。