地膚子粗提物對(duì)變異鏈球菌作用的體外實(shí)驗(yàn)研究

張夢(mèng)馳， 常 琳， 涂方祥， 盧友光

齲病是一種細(xì)菌感染性疾病，變異鏈球菌是主要的致齲菌。細(xì)菌以食物為底物，分解糖產(chǎn)酸，使黏附于牙面的牙菌斑內(nèi)pH降低，造成局部脫礦，產(chǎn)生齲損。因此，通過抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)、黏附、產(chǎn)酸可以起到防齲作用。天然藥物有毒副作用小、不會(huì)引起菌群失調(diào)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)齲病的預(yù)防作用日益受到重視，越來越多針對(duì)天然藥物防治齲病的相關(guān)研究相繼出現(xiàn)，如針對(duì)非洲的斑鳩菊、榆綠木、藤黃，拉美國家的可可果、血根草，以及中國和日本的中草藥、茶的研究[1]。在國內(nèi)，已有研究發(fā)現(xiàn)，厚樸、茶多酚、五倍子等天然藥物對(duì)致齲菌均有一定的抑制作用[2-4]。地膚子俗稱掃帚草，是一種傳統(tǒng)的中草藥，有抗菌、抗炎、抗敏等功效。地膚子復(fù)方制劑對(duì)尿路感染、急性乳腺炎及多種皮膚病均有較好的療效。有研究顯示，地膚子有良好的抗病原微生物的作用[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究地膚子粗提物對(duì)致齲菌(變異鏈球菌)生長(zhǎng)、黏附、產(chǎn)酸的抑制作用，為天然藥物地膚子用于齲病的預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 變異鏈球菌國際標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25175(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng))；地膚子(產(chǎn)地河北，購自福州市回春堂大藥房，由福建中醫(yī)藥大學(xué)車蘇容副教授鑒定)；BHI固體及液體培養(yǎng)基，無水乙醇(分析純)，磷酸鹽緩沖液，卡那霉素(EZ2811F23，上海易匯生物科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE2000，上海亞榮生化儀器廠)；pH檢測(cè)儀(Sartorius AG，北京賽多利斯公司)。

1.2方法

1.2.1地膚子粗提物的制備 將地膚子研磨成粉，稱取100 g置于燒杯中，加入2 L體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，25 ℃浸提48 h[6]。過濾，棄濾渣得到浸提液，55～60 ℃水浴中負(fù)壓冷凝旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，密封放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2實(shí)驗(yàn)菌株及菌懸液的制備 變異鏈球菌國際標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25175復(fù)蘇48 h后，接種于BHI液體培養(yǎng)基中，置于厭氧箱(80% N2，10% CO2，10% H2，37 ℃)中培養(yǎng)18 h。涂片檢查及生化鑒定為純培養(yǎng)后，細(xì)菌在BHI固體培養(yǎng)基上傳代，接種環(huán)取固體培養(yǎng)基上的單菌落，用無菌生理鹽水將細(xì)菌配制成0.5號(hào)麥?zhǔn)瞎軡岫鹊木鷳乙簜溆肹7]。

1.2.3地膚子粗提物對(duì)變異鏈球菌體外生長(zhǎng)的影響 稱取地膚子粗提物1.0 g，加入10 mL BHI液體培養(yǎng)基，配制成濃度為100 mg/mL的母液，置于高壓滅菌器中(0.1 MPa，121.5 ℃)，高壓15 min，置于無菌操作臺(tái)中備用。設(shè)置8個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)陽性對(duì)照組。倍比稀釋法將母液稀釋成8個(gè)濃度梯度(0.78，1.56，3.13，6.25，12.5，25，50及100 mg/mL)，設(shè)置卡那霉素濃度50 mg/mL為陽性對(duì)照組。BHI固體培養(yǎng)基倒板(每平板約5 mL)，凝固備用。BHI固體培養(yǎng)基(低熔點(diǎn))冷卻至室溫，加入菌液混合均勻，倒入已凝固的培養(yǎng)基表層(每平板約5 mL)，放入4 ℃冰箱凝固。用已滅菌的小鋼管在凝固平板上層打孔，小心挑去小塊培養(yǎng)基做成圓孔，每板3孔，共9孔。圓孔中分別注入80 μL實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組藥物，置入4 ℃冰箱中，預(yù)擴(kuò)散2 h，37 ℃厭氧箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈大小[8]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

黏附抑制率=[(對(duì)照組OD630 nm-實(shí)驗(yàn)組OD630 nm)/對(duì)照組OD630 nm]×100%

1.2.5地膚子粗提物對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸作用的影響 同1.2.4的方法配制4個(gè)實(shí)驗(yàn)管和1個(gè)對(duì)照管溶液，混勻。用酸度計(jì)將已配制好的實(shí)驗(yàn)管與對(duì)照管溶液初始pH值調(diào)為7.4，厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。18 h后各試管以3 000 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)定pH值[10]，每管測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，計(jì)算pH的變化值(ΔpH)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

ΔpH=初始pH值(7.4)-終末pH值

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析比較各組總體均數(shù)，采用Dunnett-t檢驗(yàn)比較多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均數(shù)的差別。P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1地膚子粗提物對(duì)變異鏈球菌體外生長(zhǎng)的影響 3次實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組均未出現(xiàn)抑菌圈，陽性對(duì)照組均出現(xiàn)明顯抑菌圈，抑菌圈直徑平均值1.5 cm。實(shí)驗(yàn)表明，在100 mg/mL時(shí)地膚子粗提物對(duì)變異鏈球菌體外生長(zhǎng)無明顯抑制作用(圖1)。

2.2地膚子粗提物對(duì)變異鏈球菌黏附作用的影響 隨著地膚子粗提物濃度的升高，黏附于試管壁的細(xì)菌越少，黏附抑制率也隨之增高(圖2)。分析結(jié)果表明，各濃度組黏附細(xì)菌的OD值總體均數(shù)不全相等，經(jīng)Dunnett-t檢驗(yàn)，地膚子粗提物4個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)管與對(duì)照管比較具有明顯抑制變異鏈球菌黏附的作用。各實(shí)驗(yàn)管對(duì)變異鏈球菌黏附的抑制能力與對(duì)照管比較，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖2～3)。

2.3地膚子粗提物對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸作用的影響

隨著地膚子粗提物濃度的升高，ΔpH越來越小，各濃度管抗酸的pH值總體均數(shù)不全相等，經(jīng)Dunnett-t檢驗(yàn)，地膚子粗提物4個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)管與對(duì)照管比較具有抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸的作用。各實(shí)驗(yàn)管相比于對(duì)照管，對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸的抑制能力均有差異性，且差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖4)。

3 討 論

齲病的發(fā)生、發(fā)展與致齲菌的生長(zhǎng)、黏附、產(chǎn)酸、產(chǎn)胞外多糖等息息相關(guān)，而變異鏈球菌是公認(rèn)的致齲菌[11]?？刂讫x病的關(guān)鍵在于預(yù)防，目前防齲藥物主要包括氟化物、抗生素、免疫制劑等。氟化物應(yīng)用過量會(huì)導(dǎo)致氟牙癥及氟骨癥。長(zhǎng)期使用抗生素防齲會(huì)導(dǎo)致耐藥及菌群失調(diào)。免疫防齲效果目前尚不清楚[12]。而天然藥物具有毒副作用小、不會(huì)引起菌群失調(diào)的優(yōu)點(diǎn)，在齲病的預(yù)防中日益受到重視，相關(guān)研究通過探討天然藥物抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酸、黏附及促進(jìn)礦化等的作用機(jī)制，研究天然藥物防齲效果[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，地膚子粗提物的濃度為100 mg/mL時(shí)，雖然不能抑制變異鏈球菌的成長(zhǎng)，但可抑制變異鏈球菌黏附及產(chǎn)酸。這與林秀仙等使用超臨界萃取地膚子油在高濃度時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌及鏈球菌等有抑菌作用的研究結(jié)果相似[14]。地膚子的化學(xué)成分復(fù)雜，主要有萜類及其皂苷、揮發(fā)油等[15]，其具體有效活性成分有待進(jìn)一步篩選。另外，地膚子對(duì)變異鏈球菌合成葡聚糖、菌斑形成及牙體硬組織再礦化等方面的影響及其作用機(jī)制也有待進(jìn)一步探索。