基于厭氧微生物的碳鏈延長(zhǎng)合成高價(jià)值化學(xué)品反應(yīng)機(jī)理及研究進(jìn)展:不同電子供體

劉昊鵬 劉 超 王 雯 劉廣青

(北京化工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 生物質(zhì)能源與環(huán)境工程研究中心, 北京 100029)

引 言

隨著全球經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展以及化石能源的日益匱乏,可再生能源及化學(xué)品的生產(chǎn)受到了極大的關(guān)注[1]。 微生物技術(shù)是一種生產(chǎn)能源和化學(xué)產(chǎn)品的重要途徑,隨著人們對(duì)微生物領(lǐng)域認(rèn)識(shí)的不斷加深,能夠?qū)崿F(xiàn)有機(jī)廢棄物循環(huán)利用的新型生物技術(shù)逐漸成為一大研究熱點(diǎn)。 與化學(xué)工藝(如費(fèi)托合成)相比,新型生物技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、能量消耗少、經(jīng)濟(jì)性高和環(huán)境可持續(xù)性好等優(yōu)點(diǎn)[2]。 其中,厭氧發(fā)酵技術(shù)以其高負(fù)荷、低能耗、低運(yùn)行成本和產(chǎn)生能源等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為一種替代傳統(tǒng)填埋和焚燒的廢棄物處理方式[3]。 在厭氧微生物的作用下,有機(jī)廢棄物首先轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物,包括短鏈的揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA,如乙酸和丙酸)、乳酸、氫氣(H2)等,這些中間產(chǎn)物能夠被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為富含甲烷(CH4)的沼氣[3]。 很多學(xué)者指出,甲烷的熱值較低(55 MJ/kg)且儲(chǔ)存和運(yùn)輸成本高,只能在一定程度上緩解日益嚴(yán)峻的能源危機(jī)[4-5]。 為了獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益,一些研究選擇將VFAs/乙醇作為厭氧發(fā)酵的最終產(chǎn)物。 但如何高效、經(jīng)濟(jì)地從水溶液中分離出高親水性的VFAs/乙醇仍然是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。 相比之下,具有更高疏水性的中鏈脂肪酸(medium chain fatty acid, MCFA,如己酸和辛酸)便更具有吸引力。

研究表明,基于厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的微生物可以將VFAs 作為電子受體,通過(guò)碳鏈延長(zhǎng)途徑合成具有更高價(jià)值的MCFAs[6-7]。 MCFAs 是具有6 ～12個(gè)碳原子的一元直鏈羧酸,能夠用于制造動(dòng)物飼料添加劑、食品添加劑、制藥工藝的抗菌劑、植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、香料和藥物[8-9]。 目前,MCFAs 主要來(lái)源于化石燃料或天然油料,但這種生產(chǎn)方式成本較高,限制了MCFAs 的廣泛應(yīng)用。 利用厭氧發(fā)酵系統(tǒng)將有機(jī)廢棄物(如城市固體廢棄物、農(nóng)作物秸稈和廚余垃圾)轉(zhuǎn)化為MCFAs 不僅成本低、可再生性強(qiáng),還能避免生產(chǎn)原料與人類(lèi)生產(chǎn)生活發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)[10]。 MCFAs 的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和能量密度均高于CH4、H2和VFAs,更長(zhǎng)的碳鏈?zhǔn)沟肕CFAs 疏水性更強(qiáng),這使得一定濃度的MCFAs 會(huì)以油狀液體的形式浮于反應(yīng)溶液表面,能夠直接從液體表面分離提取[6]。 對(duì)比現(xiàn)有技術(shù),傳統(tǒng)的化工合成過(guò)程通常需要高溫高壓,而厭氧微生物發(fā)酵過(guò)程能夠在常溫常壓下合成MCFAs。 此外,厭氧發(fā)酵不需要各種性質(zhì)復(fù)雜的化合物,可以直接利用來(lái)源豐富的乙醇或乳酸等含碳化合物作為能量來(lái)源和底物用于產(chǎn)物的合成。 盡管生物催化比化學(xué)催化的轉(zhuǎn)化速率慢,但是能耗和設(shè)備成本低、生物酶的選擇性高、副產(chǎn)物少、對(duì)污染物具有一定的耐受性,因而微生物催化轉(zhuǎn)化技術(shù)具有重要的研究?jī)r(jià)值及意義[11]。

在VFAs 實(shí)現(xiàn)碳鏈延長(zhǎng)制取MCFAs 的過(guò)程中,乙酰輔酶A 是逆β 氧化循環(huán)重要的中間體,也是合成細(xì)胞物質(zhì)(包括氨基酸、核苷酸和脂類(lèi)化合物)的理想前驅(qū)體。 電子供體和電子受體是碳鏈延長(zhǎng)必不可少的兩個(gè)重要部分。 一般來(lái)說(shuō),電子供體是碳鏈延長(zhǎng)發(fā)生的先決條件。 電子供體通過(guò)自身氧化形成乙酰輔酶A,為碳鏈延長(zhǎng)過(guò)程提供能量和還原當(dāng)量。乙酰輔酶A 與電子受體在微生物的作用下結(jié)合,在經(jīng)過(guò)一系列酶作用后完成一次碳鏈延長(zhǎng)循環(huán)。 每次循環(huán)結(jié)束后電子受體的碳鏈增加兩個(gè)碳原子[8,12]。電子供體的類(lèi)型和性質(zhì)將直接影響最終產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率和類(lèi)型。 因此,選擇合適的電子供體是實(shí)現(xiàn)碳鏈延長(zhǎng)的重要保障。 Claassens 等[13]提出了一套可用于微生物固碳的電子供體選擇標(biāo)準(zhǔn):1)來(lái)源豐富與可持續(xù)性;2)具有適合的氧化還原電位(E°′),其中,理想電子供體的E°′小于-400 mV;3)具有較好的溶解性、擴(kuò)散性,便于儲(chǔ)存與運(yùn)輸;4)供體的快速酶利用;5)對(duì)微生物毒性低,無(wú)環(huán)境危害;6)能適用于微生物;7)能夠使用成本低、產(chǎn)量高的反應(yīng)器生產(chǎn)。 這些標(biāo)準(zhǔn)也可以作為碳鏈延長(zhǎng)電子供體選擇的參考標(biāo)準(zhǔn)。 目前,本課題組已經(jīng)利用混合厭氧菌群實(shí)現(xiàn)了合成氣(CO 和H2)和有機(jī)廢水轉(zhuǎn)化為VFAs 和MCFAs 的生物合成過(guò)程,并結(jié)合宏組學(xué)(宏基因組學(xué)、宏蛋白組學(xué)等)以及實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)(q-PCR)分析等技術(shù)揭示了合成氣與有機(jī)廢水制取VFAs 和MCFAs 的代謝途徑和功能微生物[11,14-18]。

乙醇和乳酸是目前研究最為廣泛的電子供體,也有文獻(xiàn)利用CO、H2、甲醇、甘油和糖類(lèi)等作為電子供體實(shí)現(xiàn)碳鏈延長(zhǎng)以制取MCFAs[19-21]。 本綜述將著重介紹幾種常用的電子供體,闡明不同電子供體進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)的作用機(jī)制以及該過(guò)程中的功能微生物,并對(duì)厭氧微生物碳鏈延長(zhǎng)技術(shù)的發(fā)展做出展望。

1 乙醇作為電子供體的反應(yīng)機(jī)理及研究現(xiàn)狀

乙醇是在碳鏈延長(zhǎng)方面已有較多研究的一種電子供體。 乙醇本身是一種清潔能源, 能夠與水完全混溶,在生物燃料工業(yè)中通常采用蒸餾的方式獲得。但有機(jī)廢棄物中的乙醇含量普遍很低,不適合采用蒸餾這種昂貴的方式進(jìn)行回收。 如果將乙醇通過(guò)碳鏈延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化為易于從水中分離的MCFAs,不僅能夠減少蒸餾過(guò)程中的燃料消耗,還能夠獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益:在微生物厭氧發(fā)酵體系中,微生物每生成1 mol 己酸需要大約2 mol 乙醇,而經(jīng)碳鏈延長(zhǎng)獲得的己酸的價(jià)格(6 000 ～10 000 美元/噸)遠(yuǎn)高于生產(chǎn)所需的乙醇的價(jià)格(500 ～1 000 美元/噸)[22]。

1.1 乙醇作為電子供體實(shí)現(xiàn)碳鏈延長(zhǎng)的機(jī)理

早期研究中發(fā)現(xiàn)克氏梭狀芽胞桿菌(Clostridium kluyveri)能夠利用乙醇和乙酸生產(chǎn)己酸[23]。 隨著研究的不斷深入,研究者們建立了基于C.kluyveri 的碳鏈延長(zhǎng)模型。 如圖1 所示,碳鏈延長(zhǎng)過(guò)程包括電子供體氧化和逆β 氧化循環(huán)兩個(gè)部分。 當(dāng)乙醇作為電子供體時(shí),乙醇首先氧化為乙醛,并在乙醛脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。此后,約1/6 的乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為乙酸,通過(guò)底物水平磷酸化以三磷酸腺苷(ATP)的形式為碳鏈延長(zhǎng)過(guò)程提供初始能量[24]。 剩余的乙酰輔酶A 則進(jìn)入逆β 氧化循環(huán)。 以乙酸延伸到丁酸的過(guò)程為例,乙酰輔酶A 先與另一個(gè)輔酶A 衍生物偶聯(lián)形成增加了兩個(gè)碳的乙酰乙酰輔酶A,再經(jīng)過(guò)一系列的酶促反應(yīng)獲得丁酰輔酶A。 丁酰輔酶A 將輔酶A 轉(zhuǎn)移到乙酸上從而獲得丁酸和乙酰輔酶A。 釋放的乙酰輔酶A 與乙醇氧化提供新的乙酰輔酶A,再次進(jìn)行逆β 氧化循環(huán)。 目前,由乙醇、乳酸和甲醇等電子供體引導(dǎo)的碳鏈延長(zhǎng)過(guò)程主要在電子供體的氧化步驟上存在差異,而逆β 氧化循環(huán)的步驟是相似的[8-9,20]。

在標(biāo)準(zhǔn)條件下(101.325 kPa,25 ℃),乙醇作為電子供體的碳鏈延長(zhǎng)過(guò)程中涉及的主要反應(yīng)方程式見(jiàn)表1。 反應(yīng)式(1)表示乙醇氧化途徑,反應(yīng)式(2) ～(6)表示乙醇對(duì)VFAs 的碳鏈延長(zhǎng)。 此外,反應(yīng)式(7) ～(11)是羧酸在碳鏈延長(zhǎng)體系中可能發(fā)生的氧化反應(yīng),在反應(yīng)過(guò)程中應(yīng)盡量避免發(fā)生。

表1 乙醇作為電子供體時(shí)主要反應(yīng)方程式[25]Table 1 The main reaction equations for ethanol as an electron donor[25]

1.2 乙醇作為電子供體時(shí)的主要微生物

C. kluyveri 是在以乙醇為電子供體的純菌研究中使用最多且碳鏈延長(zhǎng)效果最好的菌株,最早從大型食草動(dòng)物瘤胃和河道污泥中分離獲得[23]。 一般來(lái)說(shuō),C. kluyveri 主要使用乙醇和乙酸作為底物并獲得丁酸、己酸和H2。 Kenealy 等[26]確定了C.kluyveri 的最適生長(zhǎng)pH 值,該值與CO2(H2CO3)和HCO-3的酸度系數(shù)(6.3)接近,確保了C. kluyveri 能夠以CO2為生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物。 另外,C. kluyveri 會(huì)因?yàn)殡娮庸w與電子受體的組合不同而得到不同產(chǎn)物。 如Coma 等[25]發(fā)現(xiàn)丙醇與乙酸的組合獲得了丙酸和戊酸。

早期對(duì)于碳鏈延長(zhǎng)的研究主要集中在C.kluyveri 等特定菌株的碳鏈延長(zhǎng)上,獲得了這些細(xì)菌菌株進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)的最適生長(zhǎng)條件。 近年來(lái),為了降低生產(chǎn)工藝對(duì)特定菌株的依賴(lài)并提高系統(tǒng)穩(wěn)定性,研究人員開(kāi)始傾向于在混合培養(yǎng)微生物反應(yīng)器中進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)。 相比于純培養(yǎng)的反應(yīng)器,混合培養(yǎng)反應(yīng)器不需要嚴(yán)格的滅菌,穩(wěn)定性更強(qiáng),而且能夠處理成分更加復(fù)雜的底物。 表2 總結(jié)了部分文獻(xiàn)中的主要功能微生物。 可以發(fā)現(xiàn),雖然C. kluyveri 在混合培養(yǎng)反應(yīng)器中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,但在混合培養(yǎng)反應(yīng)器中往往表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。 例如Weimer等[27]使用C. kluyveri 與瘤胃細(xì)菌混合培養(yǎng),縮短了碳鏈延長(zhǎng)時(shí)間并提高了己酸產(chǎn)量。 此外,還發(fā)現(xiàn)脫硫芽孢彎曲菌(Desulfosporosinus meridiei)、顫螺旋菌屬(Oscillospira spp.)、伯克氏菌屬(Burkholderia spp.)和許多未鑒別菌株都在混合培養(yǎng)的碳鏈延長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用[28-29]。 這些菌株的最適pH 值和最適溫度都有一定區(qū)別,但絕大部分實(shí)驗(yàn)認(rèn)為pH=7 和30 ℃是最適宜的MCFAs 生產(chǎn)條件,這與C.kluyveri 的最適溫度(34 ℃)與pH 值都比較接近。

表2 乙醇作為電子供體時(shí)的MCFAs 產(chǎn)量和其他參數(shù)Table 2 MCFAs yields and other parameters when ethanol is used as the electron donor

1.3 乙醇作為電子供體的研究進(jìn)展

表2 總結(jié)了部分文獻(xiàn)報(bào)道中,使用乙醇作為電子供體的厭氧微生物碳鏈延長(zhǎng)反應(yīng)器的運(yùn)行方式與條件參數(shù)。 pH 值是乙醇碳鏈延長(zhǎng)的一個(gè)重要的影響參數(shù)。 首先,pH 值會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)。 San-Valero 等[30]比較了不同pH 值下C. kluyveri 進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)的過(guò)程,并在pH=7.5 下獲得了最高微生物生長(zhǎng)量和正己酸產(chǎn)量。 一般認(rèn)為,無(wú)論是純菌還是混菌發(fā)酵體系,pH 值接近7 的中性環(huán)境都是乙醇碳鏈延長(zhǎng)適宜的條件[7]。 對(duì)于混菌發(fā)酵體系,降低pH值還有利于抑制產(chǎn)甲烷菌的活性,減少抑菌劑的添加[6]。 但較低的pH 值會(huì)導(dǎo)致MCFAs 的毒性增強(qiáng)。這是因?yàn)镸CFAs 在水中的溶解度比VFAs 的溶解度更低,在低pH 值環(huán)境下,更多的MCFAs 會(huì)以油狀液體的形式浮于液體表面,這些未解離的MCFAs對(duì)微生物具有毒性,少量的積累便會(huì)導(dǎo)致功能細(xì)菌無(wú)法正常生長(zhǎng)和代謝,電子供體的氧化和逆β 氧化循環(huán)過(guò)程停止[12,31]。 例如Ge 等[24]在利用乙醇進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)中認(rèn)為,己酸發(fā)生嚴(yán)重抑制的最大未解離濃度僅為7.5 mmol/L(30 ℃,pH =5.5);但他們也充分利用MCFAs 溶解度降低的特點(diǎn),在低pH 值條件下加裝在線(xiàn)膜萃取,不僅能夠保證反應(yīng)器中的己酸濃度低于估算的MCFAs 抑制閾值,還獲得了可觀(guān)的產(chǎn)量。 目前,很多研究認(rèn)為采用更低的pH值(pH≈5.5)來(lái)降低MCFAs 的溶解度并加裝在線(xiàn)提取裝置的生產(chǎn)策略是未來(lái)實(shí)現(xiàn)MCFAs 商業(yè)化生產(chǎn)最具有前景的一種方式[12]。

熱力學(xué)計(jì)算和模型能夠幫助判斷碳鏈延長(zhǎng)的可行性、反應(yīng)條件、產(chǎn)物比例等。 González-Cabaleiro等[32]提出的熱力學(xué)模型不僅能夠證明乙酸和乙醇進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)和生理學(xué)可行性,也能夠識(shí)別生物反應(yīng)器在不同操作條件下的反應(yīng)瓶頸。 Angenent 等[6]開(kāi)發(fā)了化學(xué)計(jì)量模型,能夠以乙酸和乙醇的初始物質(zhì)的量比與負(fù)荷來(lái)計(jì)算最終產(chǎn)物中正丁酸、正己酸、H2和ATP 的形成。 例如在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下低濃度和高濃度乙醇與乙酸生產(chǎn)正丁酸的發(fā)酵過(guò)程如反應(yīng)式(12)和(13)所示。

在熱力學(xué)計(jì)算模型的幫助下,一些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)電子供體與電子受體的比例會(huì)影響產(chǎn)物的類(lèi)型與產(chǎn)量。 Leng 等[21]發(fā)現(xiàn)更高的乙醇與乙酸的物質(zhì)的量比,即更充足的電子供體能夠釋放的吉布斯自由能總量更多,但單個(gè)電子轉(zhuǎn)移平均所能獲得的吉布斯自由能并非一直升高。 他們通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析與熱力學(xué)計(jì)算認(rèn)為乙醇與乙酸的最佳物質(zhì)的量比應(yīng)保持在3∶1左右,此時(shí)每個(gè)電子轉(zhuǎn)移所能獲得的吉布斯自由能最高。 這一比例對(duì)實(shí)現(xiàn)電子供體的高效利用和獲得最佳產(chǎn)率具有指導(dǎo)性的意義。 除優(yōu)化產(chǎn)率外,當(dāng)乙醇與乙酸的物質(zhì)的量比低于2∶1時(shí),最終產(chǎn)物傾向于獲得丁酸[7]。 當(dāng)物質(zhì)的量比高于2∶1時(shí),按照反應(yīng)方程推算乙酸將完全消耗,剩余的乙醇則可以將丁酸進(jìn)一步延長(zhǎng)為己酸[28]。 Kucek 等[28]甚至通過(guò)更高的比值獲得了大量辛酸,但要獲得碳鏈更長(zhǎng)的MCFAs(如癸酸)依然是微生物碳鏈延長(zhǎng)的一大瓶頸。 目前,即使在使用在線(xiàn)提取的系統(tǒng)中,還沒(méi)有獲得10 個(gè)碳以上的MCFAs。

以乙醇為電子供體實(shí)現(xiàn)碳鏈延長(zhǎng)制備MCFAs的工藝仍存在一些挑戰(zhàn)。 首先,高濃度乙醇(200 ～400 mmol/L)對(duì)微生物具有毒性,需要被稀釋才能使用[6]。 盡管連續(xù)反應(yīng)器能夠在保持低濃度乙醇的情況下獲得高效穩(wěn)定的MCFAs 產(chǎn)量,但乙醇濃度的降低勢(shì)必會(huì)犧牲MCFAs 產(chǎn)量[29]。 其次,當(dāng)乙醇作為電子供體時(shí),生產(chǎn)MCFAs 的微生物需要持續(xù)的外源CO2補(bǔ)充來(lái)合成蛋白質(zhì)[41]。 Jungermann 等[42]在使用C. kluyveri 生產(chǎn)正己酸的研究中,發(fā)現(xiàn)同化到生物質(zhì)中的碳有30% 是由CO2衍生而來(lái)。 同時(shí),Roghair 等[43]認(rèn)為CO2負(fù)荷是碳鏈延長(zhǎng)體系重要的控制參數(shù)。 他們發(fā)現(xiàn)高CO2負(fù)荷會(huì)刺激過(guò)量乙醇氧化,并在高CO2負(fù)荷(2.5 L/(L·d)) 下獲得10.8 g/(L·d)的高己酸鹽產(chǎn)量,而在低CO2負(fù)荷(0.5 L/(L·d))下僅獲得2.9 g/(L·d)的己酸。 目前,補(bǔ)充CO2的方式主要是添加碳水化合物或引入CO2,但很多研究認(rèn)為這兩種方式都不經(jīng)濟(jì)。 最后,乙醇的來(lái)源是實(shí)現(xiàn)碳鏈延長(zhǎng)技術(shù)商業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)重要瓶頸。 由于乙醇本身就是一種清潔能源,直接使用商業(yè)乙醇作為電子供體不具有經(jīng)濟(jì)可行性。 因此,如何充分利用有機(jī)廢棄物中的剩余乙醇或從廢棄物中原位生產(chǎn)乙醇用于碳鏈延長(zhǎng)成為一個(gè)研究重點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)室通常選擇純物質(zhì)來(lái)探索碳鏈延伸的最佳運(yùn)行參數(shù),但對(duì)實(shí)際有機(jī)廢棄物的研究具有更大的實(shí)用價(jià)值。 酒精發(fā)酵工業(yè)的廢水中普遍殘留了低濃度的乙醇,玉米發(fā)酵廢液、甘蔗汁發(fā)酵尾料、啤酒和白酒生產(chǎn)廢水等乙醇含量相對(duì)較高的原料已經(jīng)被大量應(yīng)用于MCFAs 的生產(chǎn)[24]。 此外,一些富含碳水化合物的復(fù)雜底物,如餐廚垃圾和污水污泥,也可以在水解和發(fā)酵過(guò)程中獲得VFAs 和其他碳鏈延伸所需的前驅(qū)體(如表2 中的OFMSW)。

2 乳酸作為電子供體的反應(yīng)機(jī)理及研究現(xiàn)狀

研究人員發(fā)現(xiàn),當(dāng)復(fù)雜發(fā)酵底物中含有高濃度易降解底物時(shí),乳酸往往是初級(jí)發(fā)酵的主要產(chǎn)物[44]。 這些底物中豐富的乳酸也能夠作為電子供體應(yīng)用于MCFAs 的生產(chǎn),有些研究甚至發(fā)現(xiàn)乳酸在與乙醇作為混合電子供體時(shí)表現(xiàn)出優(yōu)于單獨(dú)一種電子供體作用的效果[45-46]。 乳酸作為一種廣泛應(yīng)用于MCFAs 生產(chǎn)的電子供體,在碳鏈延長(zhǎng)途徑、MCFAs 產(chǎn)量和產(chǎn)物分布等方面均與乙醇有很大的不同。

2.1 乳酸作為電子供體實(shí)現(xiàn)碳鏈延長(zhǎng)的機(jī)理

乳酸作為電子供體引導(dǎo)碳鏈延長(zhǎng)時(shí),除氧化為乙酰輔酶A 的過(guò)程和乙醇存在差異外,它們的逆β氧化循環(huán)步驟是相似的[7]。 圖2 為乳酸引導(dǎo)的逆β氧化循環(huán)過(guò)程,主要分為3 個(gè)步驟:1)乳酸首先在乳酸脫氫酶的作用下氧化為丙酮酸,如果考慮乳酸的異構(gòu)體,L-乳酸首先在乳酸消旋酶的作用下異構(gòu)化為D-乳酸,然后在D-乳酸脫氫酶的作用下形成丙酮酸[45];2)丙酮酸進(jìn)一步氧化為乙酰輔酶A,并在丙酮酸脫氫酶作用下釋放等物質(zhì)的量的CO2和ATP合成酶,再轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A(表3,反應(yīng)式(14));3)一部分乙酰輔酶A 氧化為乙酸,剩余的乙酰輔酶A 進(jìn)入逆β 氧化循環(huán)實(shí)現(xiàn)最終的碳鏈加長(zhǎng)。 值得注意的是,一部分乳酸可能會(huì)形成乳酰輔酶A 作為中間產(chǎn)物,經(jīng)由丙烯?；o酶A 轉(zhuǎn)化為丙酸(反應(yīng)式(15)),這被稱(chēng)為丙烯酸酯途徑。 這是一種不可逆的途徑,一旦達(dá)到氧化還原平衡便會(huì)持續(xù)產(chǎn)生丙酰輔酶A,并導(dǎo)致產(chǎn)物中出現(xiàn)大量丙酸。 當(dāng)丙酸積累到一定濃度后,還會(huì)以電子受體的角色參與乳酸作用的碳鏈延長(zhǎng),形成戊酸、庚酸等奇數(shù)碳MCFAs,并在最終產(chǎn)物中占有不可忽略的比例[45]。

表3 乳酸作為電子供體時(shí)的主要反應(yīng)方程式[46]Table 3 The main reaction equations for lactic acid as an electron donor[46]

2.2 乳酸作為電子供體時(shí)的主要微生物

埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)是一種最初從綿羊瘤胃中分離出來(lái)的菌株,可以將包括乳酸、葡萄糖、果糖和乳酸在內(nèi)的多種碳源轉(zhuǎn)化為VFAs和正己酸,在pH 值低于5.5 的酸性條件下具有獨(dú)特的耐受性,在pH =4.7 時(shí)依然能夠代謝乳酸[45]。過(guò)去的很長(zhǎng)一段時(shí)間中,M. elsdenii 被認(rèn)為是唯一能夠?qū)⑷樗徂D(zhuǎn)化為正己酸的微生物[47-48]。 Weimer等[48]發(fā)現(xiàn)當(dāng)基質(zhì)中同時(shí)存在乳酸和葡萄糖時(shí),M. elsdenii會(huì)優(yōu)先利用乳酸并產(chǎn)生丙酸和乙酸,但幾乎沒(méi)有發(fā)生碳鏈延長(zhǎng)。 考慮到乳酸作為電子供體會(huì)存在丙烯酸酯途徑的特點(diǎn),Yoshikawa 等[49]從豬糞中分離出能夠以戊酸為主要產(chǎn)物的M. elsdenii 菌株。 Zhu 等[50]則提出M. elsdenii 某些基因的缺失可能會(huì)影響丙烯酸酯途徑相關(guān)酶的活性,并可以實(shí)現(xiàn)對(duì)MCFAs 選擇性的控制。 隨著混合培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展,梭菌屬Clostridium Ⅵ[51]、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的細(xì)菌CPB6[50]和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter spp.)[45]也被發(fā)現(xiàn)在一些乳酸引導(dǎo)的碳鏈延長(zhǎng)體系中發(fā)揮著重要作用。 表4 總結(jié)了部分文獻(xiàn)中乳酸作為電子供體的主要功能微生物的類(lèi)型或所屬菌科,以乳酸為電子供體的混合培養(yǎng)群落結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步探究。

表4 乳酸作為電子供體的MCFAs 產(chǎn)量和其他參數(shù)Table 4 MCFAs yields and other parameters when lactic acid is used as an electron donor

2.3 乳酸作為電子供體的研究進(jìn)展

Marounek 等[52]在1989 年發(fā)現(xiàn)乳酸可以形成乙酰輔酶A 并經(jīng)由逆β 氧化過(guò)程形成正丁酸和正己酸。 但在早期的研究中只能產(chǎn)生微量的正己酸,所以很長(zhǎng)一段時(shí)間都未將乳酸作為生產(chǎn)MCFAs 的底物[48,52-53]。 隨著反應(yīng)條件的調(diào)整以及更多能夠代謝乳酸的微生物的發(fā)現(xiàn),乳酸逐漸發(fā)展為碳鏈延長(zhǎng)的一種重要的電子供體[53]。

與乙醇相比,乳酸作為電子供體的優(yōu)勢(shì)在于能夠添加更高的濃度卻不會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒性抑制,并且不用補(bǔ)充外源CO2。 但是乳酸的使用也存在挑戰(zhàn):1)碳源會(huì)以CO2的形式分流;如圖2 所示,在乳酸氧化為丙酮酸再形成乙酰輔酶A 的必經(jīng)過(guò)程中,有1/3 的碳會(huì)以CO2的形式釋放并造成碳源的損失,最終造成MCFAs 的產(chǎn)量降低;2)丙烯酸酯途徑的發(fā)生造成碳源的分流。 丙烯酸酯途徑與逆β 氧化循環(huán)為競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,而丙烯酸酯途徑的不可逆性會(huì)大大降低MCFAs 的選擇性[45]。 例如Str?uber 等[54]和Kucek 等[45]發(fā)現(xiàn)乳酸負(fù)荷過(guò)高時(shí)會(huì)發(fā)生丙酸和戊酸的積累。 為控制丙烯酸酯途徑,Prabhu 等[53]選擇將乳酸保持在低濃度狀態(tài),Kucek 等[45]通過(guò)控制殘留乳酸濃度、pH 值、水力停留時(shí)間(HRT)和在線(xiàn)提取等措施有效提高了正己酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率。 然而,Zhu 等[50]在使用瘤胃球菌科細(xì)菌Ruminococcaceae CPB6 對(duì)乳酸進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)時(shí),發(fā)現(xiàn)即使使用高濃度乳酸(45.1 g/L)也不會(huì)發(fā)生丙烯酸酯途徑,他們認(rèn)為這與該菌株不含丙烯酸酯途徑相關(guān)的基因有關(guān)。

乳酸作為厭氧分解的重要中間產(chǎn)物,在城市污水中約占化學(xué)需氧量(COD)的18%,在一些食品加工廢水中約占COD 的70%[55]。 富含乳酸的底物包括玉米青貯、微藻、污泥、酸性乳清、酒糟、木質(zhì)纖維素發(fā)酵廢液和中國(guó)白酒廢水等都是可以用于MCFAs 生產(chǎn)的理想原料。 Xu 等[56]從酸性乳清獲得乳酸,并得到了1.68 g/(L·d)的己酸產(chǎn)率。Zhu 等[51]使用從白酒窖泥中獲得的乳酸代謝微生物,獲得的正己酸的最大生產(chǎn)速率和最大濃度能夠達(dá)到2.97 g/(L·d)和23.41 g/L。 其他實(shí)驗(yàn)中使用乳酸進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)的底物與反應(yīng)條件總結(jié)見(jiàn)表4。

3 合成氣作為電子供體的反應(yīng)機(jī)理及研究現(xiàn)狀

目前,通過(guò)熱化學(xué)的方法將沼渣和其他難以生物降解的生物質(zhì)(例如秸稈)轉(zhuǎn)化為合成氣(主要成分為CO、CO2和H2),再將合成氣轉(zhuǎn)化為其他燃料和化學(xué)品(CH4和VFA)的方式引起了人們的廣泛關(guān)注。 研究表明,H2/H+(E°′ ～-410 mV)[13]和CO/CO2(E°′ ～-520 mV)[61]具有較低的氧化還原電位,可以作為電子供體實(shí)現(xiàn)MCFAs 的制備。 需要特別注意的是,合成氣厭氧發(fā)酵的主要產(chǎn)物是乙醇和乙酸。 一些研究先將合成氣轉(zhuǎn)化為乙醇和乙酸的混合物,再由乙醇引導(dǎo)碳鏈延長(zhǎng);也有研究認(rèn)為合成氣可以直接作為電子供體[19,62]。 盡管一些文獻(xiàn)基于C. kluyveri 的熱力學(xué)分析認(rèn)為合成氣(如H2)不能直接作為電子供體,但在混菌體系中或許是可以實(shí)現(xiàn)的[26,63]。

由于將合成氣轉(zhuǎn)化為MCFAs 可實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)能最大限度的利用,因而具有巨大的應(yīng)用前景。 雖然目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)合成氣生產(chǎn)乙醇、乙酸的工業(yè)化應(yīng)用,但微生物轉(zhuǎn)化制取MCFAs 的技術(shù)還尚未在工業(yè)上得到推廣。 為加強(qiáng)對(duì)合成氣轉(zhuǎn)化制取MCFAs 過(guò)程的認(rèn)識(shí),本文結(jié)合前人的文獻(xiàn)和本課題組的研究成果,總結(jié)了合成氣生產(chǎn)MCFAs 的代謝途徑、功能微生物和關(guān)鍵酶[11]。

3.1 合成氣作為電子供體實(shí)現(xiàn)碳鏈延長(zhǎng)的機(jī)理

乙酰輔酶A 的形成是合成氣碳鏈延長(zhǎng)過(guò)程的關(guān)鍵步驟。 研究表明厭氧微生物可以通過(guò)Wood-Ljungdahl 途徑,利用CO 和H2提供還原力并消耗ATP,經(jīng)甲基分支或羰基分支催化轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。 隨后,生成的乙酰輔酶A 進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇。 其具體合成途徑見(jiàn)圖3。

一般來(lái)說(shuō),利用CO 的微生物也有能力通過(guò)Wood-Ljungdahl 途徑所包含的同一套酶和轉(zhuǎn)化機(jī)制代謝CO2和CO2/H2[64]。 在Wood-Ljungdahl 途徑的甲基支鏈中,CO 在一氧化碳脫氫酶和氫化酶的共同作用下轉(zhuǎn)化為CO2,再由甲酸脫氫酶催化的可逆反應(yīng)將CO2還原為甲酸(反應(yīng)式(22))。

產(chǎn)生的甲酸鹽是甲基支鏈合成乙酰輔酶A 重要的前驅(qū)體。 隨后,甲酸鹽被四氫葉酸(tetrahydrofolic acid, THF)活化,并在甲酰四氫葉酸合成酶的催化下生成甲酰四氫葉酸(HCO-THF) (反應(yīng)式(23))。

甲酰四氫葉酸進(jìn)而在一系列酶的作用下被還原為甲基四氫葉酸。 在甲基分支的最后一步,甲基四氫葉酸與還原性的類(lèi)咕啉蛋白在轉(zhuǎn)甲基酶的作用下形成甲基化的類(lèi)咕啉蛋白(反應(yīng)式(24))。

在羰基分支中,一氧化碳脫氫酶將CO2還原為CO(反應(yīng)式(25))。

在最后合成乙酰輔酶A 的反應(yīng)中,羰基、甲基化的類(lèi)咕啉蛋白和輔酶A 在一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A 合成酶催化下合成乙酰輔酶A(反應(yīng)式(26))。

在合成代謝途徑中,乙酰輔酶A 可用作細(xì)胞碳或細(xì)胞能量的來(lái)源。 而在分解代謝途徑中,一部分乙酰輔酶A 通過(guò)轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸作為中間體進(jìn)而轉(zhuǎn)化為乙酸,另一部分在乙醛脫氫酶的存在下先形成乙醛再轉(zhuǎn)化為乙醇。

CO 通過(guò)兩種途徑參與碳鏈延長(zhǎng)。 一種是微生物直接利用CO 并轉(zhuǎn)化為H2、CO2、乙酸和丁酸等(表5,反應(yīng)式(28) ～(31))。 另一種是通過(guò)水煤氣反應(yīng)先轉(zhuǎn)化為H2和CO2(反應(yīng)式(27)),由CO 耐受微生物利用H2和CO2生產(chǎn)乙醇/乙酸后,再進(jìn)入逆β氧化循環(huán)獲得MCFAs (表5, 反應(yīng)式(32) ～(35))[65]。

表5 CO 轉(zhuǎn)化反應(yīng)方程式[65]Table 5 CO conversion reaction equations[65]

需要特別注意的是,CO/CO2具有比H2/H+更低的氧化還原電位,這使CO 不僅具有更好的提供電子的能力,還能夠單獨(dú)驅(qū)動(dòng)鐵氧化還原蛋白的還原而不需要分叉機(jī)制[61]。 Claassens 等[13]認(rèn)為CO更低的氧化還原電位將使細(xì)胞電子載體處于還原性更強(qiáng)的環(huán)境中,從而能夠獲得還原性更強(qiáng)的產(chǎn)物——即能夠獲得碳鏈更長(zhǎng)的MCFAs。

目前,關(guān)于CO 和H2作為電子供體實(shí)現(xiàn)碳鏈延伸的作用機(jī)理還存在爭(zhēng)議,即CO 和H2能否直接作為碳鏈延長(zhǎng)的電子供體的問(wèn)題[66]。 以H2為例,有文獻(xiàn)表明在僅使用C. kluyveri 菌株進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)時(shí),H2無(wú)法替代乙醇作為電子供體制取MCFAs[26]。González-Cabaleiro 等[32]通過(guò)熱力學(xué)模型分析,認(rèn)為H2直接作為電子供體實(shí)現(xiàn)碳鏈延長(zhǎng)過(guò)程存在熱力學(xué)瓶頸(反應(yīng)式(36)),即使在極高的H2分壓條件下也難以實(shí)現(xiàn)H2和CO2向MCFAs 的直接轉(zhuǎn)化。 但Zhang 等[67]在中空纖維膜反應(yīng)器中利用厭氧混合微生物轉(zhuǎn)化H2和CO2并成功實(shí)現(xiàn)了己酸和辛酸的合成,認(rèn)為H2是可以作為電子供體實(shí)現(xiàn)碳鏈延長(zhǎng)的。存在這一爭(zhēng)論的原因主要是因?yàn)槟壳斑€無(wú)法說(shuō)明是H2直接作用于電子受體還是需要形成乙醇后才能實(shí)現(xiàn)碳鏈延長(zhǎng)。 但這一爭(zhēng)論也是基于C. kluyveri 的代謝途徑,混合培養(yǎng)體系中的其他微生物是否能直接以H2作為電子供體進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)還需要更多的研究。

3.2 合成氣作為電子供體時(shí)的主要微生物

合成氣目前主要通過(guò)混合培養(yǎng)的方式作為電子供體進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)。 Richter 等[62]建立了揚(yáng)氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)和C. kluyveri 的共培養(yǎng)體系:CO 首先在C. ljungdahlii 的作用下轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇,然后在C. kluyveri 的作用下進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)獲得MCFAs。 類(lèi)似地,Diender 等[68]建立了由乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)和C. kluyveri 組成的利用CO 的共發(fā)酵體系,其中,C. autoethanogenum 也是一種典型合成氣代謝的菌株;其最終獲得的丁酸和己酸產(chǎn)率分別為(8.5 ±1.1)mmol/(L·d)和(2.5 ±0.63) mmol/(L·d)。 Liu 等[16]發(fā)現(xiàn)當(dāng)CO為電子供體、乙酸/正丁酸為電子受體時(shí),黏液真桿菌(Eubacterium limosum)是碳鏈延長(zhǎng)制取正己酸的功能微生物。 目前,還沒(méi)有文獻(xiàn)提及直接以H2作為電子供體進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)的微生物菌株。 在使用C. kluyveri的實(shí)驗(yàn)中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)較高的氫分壓會(huì)抑制微生物活性,但這種抑制作用是否同樣存在于混合微生物碳鏈延長(zhǎng)體系中尚不明確[69]。 此外,由于混合培養(yǎng)體系利用合成氣生產(chǎn)MCFAs 的過(guò)程高度復(fù)雜,目前還缺乏對(duì)相應(yīng)的微生物和代謝途徑的認(rèn)識(shí)。

Perez 等[70]發(fā)現(xiàn)CO 能在一氧化碳營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌作為生物催化劑時(shí)獲得還原性更強(qiáng)的產(chǎn)物,他們使用Clostridium ljungdahlii ERI-2 和拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei) P11 這兩種一氧化碳營(yíng)養(yǎng)的細(xì)菌,在CO 和H2的合成氣環(huán)境下成功將VFAs 還原為對(duì)應(yīng)的醇。 在探究了VFAs 生產(chǎn)醇的可行性之后,Richter 等[62]希望在碳鏈延長(zhǎng)的體系中獲得碳鏈更長(zhǎng)的醇產(chǎn)物,他們使用C. ljungdahlii 和C. kluyveri在合成氣環(huán)境下進(jìn)行了碳鏈延長(zhǎng)與酸還原為醇的連續(xù)生產(chǎn)。 在獲得丁酸和己酸的碳鏈延伸產(chǎn)物的同時(shí),還能夠獲得丁醇(0.725 g/(L·d))、己醇(0.465 g/(L·d))和辛醇(0.57 mg/(L·d))。 此外,C. autoethanogenum 也是一種能夠在CO 環(huán)境中將MCFAs 轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的高級(jí)醇的梭菌,從而進(jìn)一步豐富了碳鏈延長(zhǎng)的產(chǎn)物種類(lèi),對(duì)于拓展鏈延長(zhǎng)體系的適用范圍具有重要的意義[71]。

3.3 合成氣作為電子供體的研究進(jìn)展

生物質(zhì)熱解氣化產(chǎn)生的合成氣組分隨熱解氣化工藝條件的變化而變化。 例如以氧氣或者水蒸氣為氣化劑時(shí),氣態(tài)產(chǎn)物的主要成分為CO 和H2。 而目前國(guó)內(nèi)通常選擇更為經(jīng)濟(jì)的空氣作為氣化劑,通常獲得的是具有不同比例的CO、CO2和H2的混合氣體。 但需要注意的是,CO 和H2參與碳鏈延長(zhǎng)的途徑有區(qū)別,對(duì)碳鏈延長(zhǎng)的過(guò)程也具有不同的影響。在此,對(duì)CO 和H2分別進(jìn)行總結(jié)與討論。

3.3.1 氫氣作為電子供體

H2和乙醇均被稱(chēng)為第二代生物質(zhì)產(chǎn)品,H2在作為電子供體時(shí),一般認(rèn)為需要先與CO2經(jīng)Wood-Ljungdahl 途徑轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A、乙酸和乙醇,然后再進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)。 由于需要先轉(zhuǎn)化為乙醇才能被用作電子供體,H2作為電子供體的反應(yīng)器通常需要更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。 此外,H2的溶解度低、爆炸極限范圍廣,這使得它在生物反應(yīng)器中的應(yīng)用仍具有挑戰(zhàn)性。 在H2作為電子供體的發(fā)酵過(guò)程中,氫分壓的升高能夠提高合成氣發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物中乙醇與乙酸的比例,這有利于后續(xù)MCFAs 的生產(chǎn)。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過(guò)高的氫分壓可抑制C. kluyveri 活性,但在混菌體系中這種抑制作用卻并不明顯。 例如在Steinbusch等[9]使用1.5 ×105Pa 氫分壓的實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)菌群在H2與乙醇的混合電子供體組中獲得了產(chǎn)量更高的己酸和辛酸,并認(rèn)為pH=7 應(yīng)該是H2與乙醇作為混合電子供體的適合環(huán)境。 對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的原因和過(guò)程機(jī)理,還有待進(jìn)一步研究。 本課題組前期探究了合成氣(CO 和H2)與不同有機(jī)廢水耦合發(fā)酵制取有機(jī)酸的潛力,結(jié)合16S rRNA 高通量測(cè)序、qPCR 分析和非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué),從基因和蛋白質(zhì)的層面揭示了該發(fā)酵系統(tǒng)的內(nèi)在機(jī)理。 結(jié)果表明,產(chǎn)乙酸菌在合成氣與碳水化合物豐富的廢水(5 g/L 葡萄糖)聯(lián)合發(fā)酵過(guò)程中得到更多的富集,不僅提高了CO、H2的轉(zhuǎn)化率和利用速率,還獲得了具有較長(zhǎng)碳鏈的脂肪酸[17]。

在無(wú)外源H2添加時(shí),厭氧發(fā)酵過(guò)程的H2產(chǎn)量極低,只是底物水解酸化以及VFA 產(chǎn)生過(guò)程中的副產(chǎn)物,但頂空中少量H2的存在被認(rèn)為是非常重要的[72]。 首 先,Grootscholten 等[37]認(rèn) 為 保 持3 ×10-2atm(1 atm=101 325 Pa)以上的氫分壓能夠抑制過(guò)量乙醇的氧化。 由于乙醇氧化為乙酸產(chǎn)生ATP是為碳鏈延伸提供能量的關(guān)鍵步驟,如果過(guò)多的乙醇被氧化,碳鏈延伸過(guò)程不能有效地捕獲過(guò)剩能量,反而會(huì)造成乙酰輔酶A 含量的降低。 此外,Agler等[73]和Zinder 等[74]認(rèn)為一定的氫分壓的存在能夠防止羧酸鹽的氧化,避免MCFAs 產(chǎn)物的損失。

當(dāng)添加外源H2進(jìn)入頂空時(shí),氫分壓的增高還可能將MCFAs 轉(zhuǎn)化為還原性更強(qiáng)的產(chǎn)物。 例如Arslan 等[75-76]在以馬鈴薯廢水為底物并添加了2 bar(1 bar=105Pa) H2頂空的發(fā)酵罐中,以及Steinbusch 等[9]在添加了1.5 ×105Pa H2的反應(yīng)器中,均發(fā)現(xiàn)某些微生物能夠在這樣的環(huán)境下將乙酸和丁酸還原為乙醇和丁醇。 同時(shí),他們通過(guò)熱力學(xué)分析發(fā)現(xiàn),H2將酸轉(zhuǎn)化為醇的過(guò)程與氫分壓和pH值密切相關(guān)(反應(yīng)式(37))[77]。 隨著氫分壓的升高和pH 值的降低,酸容易被還原為醇。 Sarkar等[78]對(duì)這一過(guò)程的解釋為H2可影響電子轉(zhuǎn)移速率和氧化還原介質(zhì)(NAD+/NADH、黃素蛋白和鐵硫簇)催化活性,胞內(nèi)胞外H2的不平衡狀態(tài)導(dǎo)致厭氧細(xì)菌改變種間H2傳遞途徑,從而導(dǎo)致了醇的生成。 此外,Weimer 等[79]發(fā)現(xiàn)在僅使用乙醇和乙酸作為底物時(shí),CO2分壓和氫分壓可以控制產(chǎn)物選擇性。 Weimer 等[79]認(rèn)為高氫分壓能夠影響碳鏈延長(zhǎng)產(chǎn)物中奇偶數(shù)碳鏈分布。 丙酮酸形成丙酸能產(chǎn)生比形成丁酸更多的NAD+,而在氫氣產(chǎn)量高的產(chǎn)酸條件下,NADH 的可用性更高[80]。 因此,在氫分壓較高的反應(yīng)器中為了維持NADH/NAD+比例,丙酮酸產(chǎn)丁酸的途徑被生產(chǎn)丙酸的代謝途徑所取代。 目前采用的控制H2分壓的方法包括使用真空泵[81]或者使用耗氫的微生物(氫營(yíng)養(yǎng)的產(chǎn)甲烷菌,同型產(chǎn)乙酸菌)消耗H2。

3.3.2 一氧化碳作為電子供體

作為合成氣的主要成分,CO 能夠參與多種微生物的同化與異化途徑[82]。 在過(guò)去數(shù)十年里,將CO作為碳鏈延長(zhǎng)的電子供體和碳源引起人們的注意,CO 已經(jīng)在多種合成氣厭氧發(fā)酵模型中扮演底物。

在生產(chǎn)MCFAs 過(guò)程中,如何在抑制產(chǎn)甲烷菌的同時(shí)不影響其他微生物的活性一直是一大難題。Steinbusch 等[9]和Vasudevan 等[40]將產(chǎn)甲烷菌稱(chēng)為碳鏈延伸中的電子陷阱,未控制產(chǎn)甲烷菌活性的反應(yīng)器會(huì)造成電子與碳源損失,并最終導(dǎo)致MCFAs 產(chǎn)量降低。 目前,實(shí)驗(yàn)室采用的解決方法包括縮短HRT、降低pH 值或添加2-溴乙烷磺酸來(lái)達(dá)到抑制產(chǎn)CH4的目的[83]。 Esquivel-Elizondo 等[65]認(rèn)為這些方法不具有經(jīng)濟(jì)和環(huán)境可行性,并且持續(xù)抑制產(chǎn)甲烷菌的能力不足,他們認(rèn)為CO 不僅能夠作為電子供體,還能夠抑制產(chǎn)甲烷菌的活性。 Luo 等[83]、Ferry[84]和Sipma 等[85]的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CO 對(duì)產(chǎn)甲烷菌的抑制作用大于對(duì)產(chǎn)氫菌和產(chǎn)乙酸菌的抑制作用。Esquivel-Elizondo 等[65]發(fā)現(xiàn)在pCO≥0.11 atm 時(shí)就已經(jīng)可以部分抑制產(chǎn)甲烷菌的活性。 在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),CO 分壓的增高能夠改變微生物代謝途徑,使電子流由產(chǎn)乙酸途徑偏向碳鏈延長(zhǎng)途徑。 這種既能作為電子供體與碳源,又能實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)CH4的控制是目前其他碳鏈延長(zhǎng)的電子供體所不具備的[86]。

CO 作為電子供體的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)為CO 具有較低的氧化還原電位,可以在不添加還原劑的情況下獲得短鏈醇和長(zhǎng)鏈脂肪醇。 但過(guò)低的氧化還原電位也可能破壞生物體的氧化還原平衡,需要輔助因子的再氧化以避免細(xì)胞完全還原[61]。 需要注意的是,CO 的毒性常導(dǎo)致這一類(lèi)碳鏈延長(zhǎng)反應(yīng)啟動(dòng)緩慢,需要長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)與馴化才能夠獲得高效轉(zhuǎn)化CO 的微生物菌群。 為解決這一問(wèn)題,Fox 等[87]提出可以通過(guò)基因工程培育出對(duì)CO 具有更高耐受性的菌株和酶。 除此之外,如何提高CO 的氣液傳質(zhì)速率是其作為電子供體的一大挑戰(zhàn)。 CO 難溶于水,CO 壓力的提高能夠緩解其供應(yīng)量的不足,但過(guò)高的CO 壓力可能會(huì)降低碳鏈延長(zhǎng)過(guò)程的效率。 本課題組探究了CO 作為電子供體與不同濃度的乙酸/丁酸作為電子受體進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)制取MCFAs 的可行性,結(jié)果表明當(dāng)CO 作為電子供體時(shí),正丁酸比乙酸更適宜作電子受體來(lái)提高M(jìn)CFAs 的產(chǎn)量并縮短正己酸生成停滯期[16]。 關(guān)于CO 作為電子供體的其他產(chǎn)物參考表6。

表6 CO 作為電子供體時(shí)的主要產(chǎn)物和其他參數(shù)Table 6 Main products and other parameters when CO is used as an electron donor

4 展望

MCFAs 作為一種具有高能量密度和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新型生物技術(shù)產(chǎn)物,既能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)廢棄生物質(zhì)的綜合利用,也能夠減少對(duì)化石能源的依賴(lài)。 但是到目前為止,很多研究依舊處于實(shí)驗(yàn)室階段,距離達(dá)到商業(yè)化還存在諸多限制。 為實(shí)現(xiàn)將MCFAs 的生產(chǎn)從當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室規(guī)模擴(kuò)大到工業(yè)水平,未來(lái)的研究還需要克服的挑戰(zhàn)和相應(yīng)的建議如下。

(1)拓展電子供體的類(lèi)型。 除文章中提及的4種電子供體外,目前還發(fā)現(xiàn)甲醇、葡萄糖、乳糖和丙酮酸能夠作為碳鏈延長(zhǎng)的電子供體[88-89]。 借鑒Claassens 等[13]提出的電子供體選擇標(biāo)準(zhǔn),完善電子供體的選擇指南可以幫助研究者們快速選擇合適的電子供體。 例如具有低氧化還原電位的亞磷酸酯(E°′～-650 mV)就成為電子供體的候選者,但目前還未被用于厭氧微生物碳鏈延長(zhǎng)。 此外,Tremblay 等[90]發(fā)現(xiàn)在電化學(xué)系統(tǒng)中一些自養(yǎng)微生物能夠繞過(guò)電子供體,直接從陰極接收電子。 盡管這些微生物是借助某些中間載體如H2和甲酸鹽還是直接通過(guò)電極傳遞給微生物還存在爭(zhēng)議,但如果碳鏈延長(zhǎng)微生物也能夠直接從電極捕獲電子,不僅能夠減少電子供體類(lèi)型對(duì)碳鏈延長(zhǎng)的影響,還能夠大大提高碳鏈延長(zhǎng)的效率,這將為碳鏈延長(zhǎng)打開(kāi)一個(gè)全新的領(lǐng)域。 此外,混合電子供體的使用在MCFAs 的生產(chǎn)上可能更具有優(yōu)勢(shì)。 依靠混合電子供體可以克服單一電子供體的缺陷,提高最終產(chǎn)物的選擇性或產(chǎn)量,還能夠拓展碳鏈延長(zhǎng)產(chǎn)物的種類(lèi),提高整體收益。 例如,以乳酸和乙醇作為混合電子供體時(shí),乳酸氧化過(guò)程中釋放的CO2能滿(mǎn)足乙醇碳鏈延長(zhǎng)微生物的生長(zhǎng)需求。 同時(shí),將乳酸作為補(bǔ)充的電子供體可降低對(duì)乙醇的需求,避免過(guò)高的乙醇濃度造成微生物抑制[46]。

(2)提高M(jìn)CFAs 的產(chǎn)物選擇性。 首先,避免分散碳源的競(jìng)爭(zhēng)途徑,這是確保MCFAs 純度的一個(gè)重要前提,開(kāi)發(fā)更為經(jīng)濟(jì)和穩(wěn)定的方式控制產(chǎn)甲烷和丙烯酸酯途徑對(duì)提高產(chǎn)物的收益具有重要意義。 其次,提高電子供體與電子受體比例以及安裝在線(xiàn)提取設(shè)備能夠提高M(jìn)CFAs 整體的產(chǎn)量與選擇性,但還需要進(jìn)一步探究不同電子供體和電子受體的組合方式、微生物群落結(jié)構(gòu)和操作參數(shù)等對(duì)產(chǎn)量和選擇性的影響。 另外,利用逆β 氧化循環(huán)每次增加兩個(gè)碳的規(guī)律,通過(guò)控制電子受體碳鏈的奇偶數(shù),可以獲得相對(duì)單一的MCFAs(例如:乙醇和乙酸組合獲得己酸,乙醇和丙酸組合獲得庚酸)。 但實(shí)際厭氧發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物復(fù)雜,通過(guò)控制水解酸化過(guò)程可以獲得相對(duì)單一的VFAs 作為電子受體。

(3)在線(xiàn)提取系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)對(duì)實(shí)現(xiàn)MCFAs 的工業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。 對(duì)碳鏈延長(zhǎng)產(chǎn)物進(jìn)行在線(xiàn)提取有利于提高M(jìn)CFAs 的產(chǎn)量、產(chǎn)率和產(chǎn)物選擇性。 目前采用的提取技術(shù)主要有在線(xiàn)膜液-液萃取和膜電解等。 針對(duì)復(fù)雜的可生物降解底物,采用不同在線(xiàn)提取策略對(duì)提高M(jìn)CFAs 的產(chǎn)量具有重要的意義。 應(yīng)用數(shù)學(xué)模型和精確的自動(dòng)化控制設(shè)備對(duì)MCFAs 在線(xiàn)提取系統(tǒng)進(jìn)行精確的pH 值和提取時(shí)間控制,既保證微生物活性又確保系統(tǒng)效率的操作環(huán)境,對(duì)避免產(chǎn)品抑制、實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量最大化、優(yōu)化提取方式和效率具有非常重要的意義。

(4)合成氣發(fā)酵的反應(yīng)器優(yōu)化。 從應(yīng)用前景來(lái)看,利用H2和CO 這樣的氣體電子供體生產(chǎn)生物化學(xué)品的方法是具有一定潛力的。 通過(guò)改進(jìn)進(jìn)氣裝置、增大進(jìn)氣接觸面積、增加填料進(jìn)行微生物固定化或改進(jìn)攪拌等方式可以提高合成氣的利用率。 但是,如何提高氣液傳質(zhì)速率、縮短馴化時(shí)間、優(yōu)化MCFAs 產(chǎn)量和選擇性還有待進(jìn)一步研究。

(5)提高對(duì)實(shí)際生產(chǎn)廢棄物的利用。 城市垃圾中的有機(jī)成分,如廚房垃圾、食物垃圾和污水污泥是可利用的基質(zhì)。 然而,各種有機(jī)廢棄物的成分不同,復(fù)雜的組分使得它們很難用于MCFAs 生產(chǎn)。 根據(jù)不同的成分和性質(zhì),對(duì)每種基質(zhì)確定具體的預(yù)處理方式和工藝參數(shù),這樣可以大大拓展生產(chǎn)MCFAs 的原料范圍、減少副產(chǎn)物、提高M(jìn)CFAs 的選擇性。 如果作為底物的廢棄物能夠滿(mǎn)足電子供體或電子受體的需求(例如酒糟廢水),還可以大大降低MCFAs的生產(chǎn)成本[60]。 但要實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo),并最終實(shí)現(xiàn)這項(xiàng)技術(shù)的商業(yè)應(yīng)用,還有許多挑戰(zhàn)需要解決。