添加鐵氧化物和活性炭對玉米秸稈兩相厭氧消化性能和微生物學(xué)特性影響研究

石思慧 郭榮欣 張 良 左曉宇 李秀金 袁海榮

(北京化工大學(xué) 北京市環(huán)境污染控制與資源化工程研究中心, 北京 100029)

引 言

2018 年,全球可再生能源增長14.5%,其中45%的增長來自中國[1]。 厭氧消化生產(chǎn)沼氣是生產(chǎn)可再生能源最為經(jīng)濟(jì)高效的方法之一,而木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)已成為厭氧消化技術(shù)中越來越重要的一種原料。 2018 年我國玉米秸稈資源量約為2.83億噸[2],有多達(dá)25%的玉米秸稈被直接燃燒或廢棄,造成了資源的巨大浪費和對環(huán)境的嚴(yán)重污染。對玉米秸稈進(jìn)行厭氧消化是將其變廢為寶的有效手段之一[3]。

在厭氧消化過程中,多種微生物通過相互協(xié)作來降解有機物的現(xiàn)象被稱為微生物互營,而在互營氧化產(chǎn)甲烷過程中,種間電子傳遞(interspecies electron transfer,IET)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 微生物種間電子傳遞分為間接種間電子傳遞(mediated IET,MIET)和直接種間電子傳遞(direct IET,DIET)[4]。 傳統(tǒng)的互營理論是以H2或甲酸為電子載體的間接種間H2/甲酸轉(zhuǎn)移機制(interspecies hydrogen/formate transfer,IHT/IFT)[5],存在水解酸化慢、有機酸易積累、種間電子傳遞效率低的缺點[6]。 直接種間電子傳遞作為厭氧消化新型互營機制,被認(rèn)為可以通過促進(jìn)電子傳遞來提高甲烷生成率[7]。 與MIET 相比,DIET 的優(yōu)勢顯而易見,據(jù)報道,DIET 通過導(dǎo)電菌毛(納米導(dǎo)線機制)、c 型細(xì)胞色素(氧化還原蛋白機制)或利用外源導(dǎo)電顆粒(導(dǎo)電物質(zhì)介導(dǎo)機制)將電子從產(chǎn)酸細(xì)菌轉(zhuǎn)移到產(chǎn)甲烷菌[4],同時促進(jìn)揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids,VFAs)的降解,緩解酸抑制,有效地保持產(chǎn)甲烷系統(tǒng)的穩(wěn)定。 有理論計算表明,DIET 的電子傳遞速率比IHT 高106倍[5]。

近年來,通過添加導(dǎo)電物質(zhì)來刺激厭氧消化中的DIET 成為研究熱點[8]。 Kato 等[9]首先提出導(dǎo)電材料可以刺激DIET 產(chǎn)生甲烷。 Liu 等[10]以乙醇為原料,添加顆?；钚蕴窟M(jìn)行實驗,結(jié)果表明顆?；钚蕴靠梢源龠M(jìn)種間電子轉(zhuǎn)移,該研究認(rèn)為顆粒活性炭由于其較高的電導(dǎo)率使得微生物之間形成的電連接導(dǎo)電性更強。 Yang 等[11]在厭氧污泥消化中加入顆粒狀活性炭,甲烷產(chǎn)量提高了17.4%,顆?；钚蕴康奶砑蛹涌炝怂峄彤a(chǎn)甲烷菌之間的直接電子轉(zhuǎn)移,從而提高了污泥的厭氧消化性能。 Zhang 等[12]對比了零價鐵和生銹鐵屑對污泥厭氧消化的影響,結(jié)果表明生銹鐵屑可進(jìn)一步提高甲烷產(chǎn)率(提高率29.51%),高于零價鐵粉,其原因是Fe(III)氧化物可引起微生物異化鐵還原以分解復(fù)雜有機物,從而加速了厭氧過程的水解酸化,促進(jìn)甲烷化作用。Yamada 等[13]研究證明了導(dǎo)電氧化鐵顆粒的添加有利于乙酸和丙酸酯的降解以及甲烷的生成,其認(rèn)為有機酸氧化細(xì)菌與產(chǎn)甲烷古菌之間的互營作用可能加速了甲烷的生成。 可見,鐵氧化物和活性炭均能促進(jìn)厭氧消化過程中的直接電子傳遞,但對于不同的原料效果不同。

然而,目前關(guān)于DIET 的研究主要集中在純有機物和廢活性污泥等原料上,對玉米秸稈等木質(zhì)纖維素類難降解原料的研究較少[14]。 因此,本文以玉米秸稈為原料,在酸化相中添加不同鐵氧化物以促進(jìn)玉米秸稈的水解酸化,并在甲烷相中添加活性炭,兩者聯(lián)合應(yīng)用以強化厭氧消化系統(tǒng)中的電子傳遞。通過分析酸化相產(chǎn)物以及甲烷相中的甲烷產(chǎn)量,探究鐵氧化物和活性炭對提升玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)甲烷潛力的影響。

1 材料與方法

1.1 原料

本試驗使用的玉米秸稈來自北京市順義區(qū),經(jīng)自然風(fēng)干后,用粉碎機(WN-30B1,北京錕捷玉誠有限公司)粉碎至直徑約1 mm,于干燥處存放待用。用于厭氧消化試驗的接種物來自北京市順義區(qū)某沼氣站,經(jīng)自然沉降后存于4 ℃冰箱中備用。 表1 列出了玉米秸稈和接種物的性質(zhì)。 外源添加物為三氧化二鐵粉末(Fe2O3,試劑純)、四氧化三鐵粉末(Fe3O4,試劑純)和活性炭粉末(powder activated carbon,PAC,試劑純)。

1.2 試驗方法

本文試驗采用兩相厭氧消化工藝,試驗裝置如圖1 所示。厭氧反應(yīng)器容積為1 L(工作容積為0.6 L),采用排水集氣法收集氣體,集氣瓶容積為1 L。

表1 玉米秸稈和接種物性質(zhì)Table 1 Characteristics of corn stover and inoculum

在酸化相中,玉米秸稈負(fù)荷(以TS 計,下同)為60 g/L,接種負(fù)荷為15 g/L,設(shè)置兩個試驗組,在一組中添加Fe2O3粉末,另一組中添加Fe3O4粉末,添加量均設(shè)置為15 g/L[12,15],加水定容至0.6 L,將反應(yīng)器放入(37 ±1) ℃水浴中反應(yīng)7 d,每隔12 h 搖瓶一次,同時設(shè)置空白對照組。 每日記錄氣體產(chǎn)量并測定H2含量。 酸化7 d 后,測定各反應(yīng)器出料中的VFAs 濃度。 酸化相反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)入甲烷相試驗。向酸化出料中加入?yún)捬踅臃N物,接種負(fù)荷為15 g/L,在兩個試驗組(Fe2O3+PAC 試驗組和Fe3O4+PAC試驗組)中分別添加10 g/L 活性炭粉末,繼續(xù)將反應(yīng)器放入(37 ±1)℃水浴中進(jìn)行中溫厭氧消化,設(shè)置時間為45 d,每隔12 h 搖瓶一次,每日記錄沼氣產(chǎn)量并測定氣體組分。 每個條件的所有試驗均設(shè)置3 個平行組,試驗結(jié)果為3 個平行組的平均值。

1.3 分析方法

總固體(TS)、揮發(fā)性固體(VS)依照美國公共衛(wèi)生協(xié)會《水和廢水檢驗標(biāo)準(zhǔn)方法》測定。 使用pH計(CHN868,美國Thermo Orion 公司)測量厭氧消化系統(tǒng)的pH 值。 通過元素分析儀(Vario EL micro cube elemental analyzer,德國艾力蒙塔公司)分析原料的總碳(TC)和總氮(TN)。 厭氧消化系統(tǒng)的電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀(DDB-303A, 上海雷磁儀器有限公司)配電極(DJS-10C,上海雷磁儀器有限公司)進(jìn)行測定。 Fe2+濃度采用鄰菲羅啉分光光度法測定。 VFAs 含量通過氣相色譜儀(GC-2014,日本島津公司)分析,儀器配備火焰離子化檢測器和DBWAX123-7032 色譜柱,以氮氣為載氣,檢測器溫度、進(jìn)樣口溫度、柱溫分別為250、250 ℃和180 ℃,設(shè)置保留時間為2 min。 通過氣相色譜儀(SP2100,北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司)檢測沼氣中H2、N2、CH4和CO2的含量,采用熱導(dǎo)檢測器,進(jìn)樣口、柱烘箱和檢測器的工作溫度分別為150、140 ℃和150 ℃,使用氬氣作為載氣。

將樣品送至上海美吉生物公司進(jìn)行微生物群落分析。 細(xì)菌PCR 的上下游引物分別為338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和 806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’);古菌PCR 上下游引物分別為524F10ext(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3 ’) 和 Arch958Rmod ( 5 ’-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3’)。 PCR 擴(kuò)增程序為:95 ℃預(yù)變性3 min,共27 個循環(huán)(95 ℃變性30 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。 PCR 擴(kuò)增結(jié)束后,使用2%瓊脂糖凝膠回收其產(chǎn)物,經(jīng)過純化、洗脫后,再通過2%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測,并利用QuantiFluorTM-ST 微型熒光計(美國Promega 公司)進(jìn)行檢測定量。 然后根據(jù)Illumina MiSeq 平臺上的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行測序,分析比對數(shù)據(jù)庫為Silva(Release128),置信閾值為70%[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加不同鐵氧化物條件下玉米秸稈的酸化性能

玉米秸稈在酸化過程中會產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和乙醇,兩者決定了厭氧發(fā)酵類型。 添加不同鐵氧化物對玉米秸稈VFAs 與乙醇產(chǎn)量的影響如圖2 所示。 經(jīng)過7 d 的酸化,各組VFAs 產(chǎn)量最多的是乙酸,丁酸其次,兩者之和占VFAs 和乙醇總量的80%以上,故為丁酸型發(fā)酵。 丁酸型發(fā)酵較為穩(wěn)定,有利于后期甲烷化。 添加Fe3O4粉末的試驗組VFAs 與乙醇總量為9 564 mg/L,比對照組提高了25.4%,其中乙酸含量提高了27.1%, 丁酸含量提高了55.8%,丙酸含量降低了13.1%;與添加Fe2O3粉末的試驗組相比,添加Fe3O4粉末的試驗組的VFAs 與乙醇總量提高了8.5%,乙酸含量提高了6.0%,丁酸含量提高了14.7%。 Fe3O4粉末的添加有效提高了玉米秸稈水解酸化效果,在提高乙酸和丁酸產(chǎn)量的同時還減少了丙酸的生成,其可能的原因是在酸化過程中,Fe(Ш)氧化物可以富集異化鐵還原菌,該類細(xì)菌可以通過異化鐵還原過程參與到復(fù)雜有機物的降解過程中,產(chǎn)生更多小分子酸類物質(zhì),為產(chǎn)甲烷菌提供了良好的底物形式。

2.2 添加鐵氧化物和PAC 條件下玉米秸稈的甲烷化性能

在甲烷化過程中,各組日產(chǎn)沼氣量、甲烷含量和累積產(chǎn)甲烷量如圖3 所示。 可以看出,各組日產(chǎn)沼氣量趨勢相同[圖3(a)],在產(chǎn)氣過程中均出現(xiàn)兩個產(chǎn)氣高峰。 Fe3O4+PAC 試驗組啟動最快,第1 個產(chǎn)氣高峰在甲烷化開始的第5 天,比其余兩個組提前了4 d,最高日產(chǎn)氣量為1 544 mL,比對照組提高了119.3%,比Fe2O3+PAC 試驗組提高了22.4%;該組的第二個產(chǎn)氣高峰在第18 天,分別比對照組、Fe2O3+PAC 試驗組提前8 d 和2 d。 26 d 后,各組日產(chǎn)沼氣量逐漸減少,甲烷化進(jìn)入后期。 在甲烷化過程中,各組甲烷含量變化呈現(xiàn)出相同的趨勢[圖3(b)],均先升高后降低最后穩(wěn)定在某一范圍。 各組最高甲烷含量均在68.0% ～69.8%之間,后期甲烷含量穩(wěn)定在52.6% ～58.5%之間,對照組與試驗組差別不大。 在甲烷化過程中,產(chǎn)甲烷效果最好的是Fe3O4+PAC 試驗組[圖3(c)],該組累積產(chǎn)甲烷量達(dá)7 965 mL,單位TS 產(chǎn)甲烷量達(dá)221 mL,與對照組相比提高了27.8%,比Fe2O3+PAC 試驗組提高了6.9%,與Zhang 等[17]的研究結(jié)果一致。

t80表示累積產(chǎn)甲烷量達(dá)到總甲烷產(chǎn)量的80%所用的時間。 Fe3O4+PAC 試驗組的t80為18 d,比對照組提前了8 d,比Fe2O3+ PAC 試驗組提前了2 d,明顯縮短了玉米秸稈厭氧消化所需時間。Fe3O4+PAC 試驗組產(chǎn)甲烷性能顯著增強,可能的原因一是酸化相中Fe3O4粉末的添加使得玉米秸稈水解酸化效率良好,VFAs 的產(chǎn)量較高,產(chǎn)甲烷菌有豐富的底物可以利用;二是由于Fe3O4粉末和PAC 具有良好的導(dǎo)電性能,將兩者添加到厭氧消化系統(tǒng)中可在微生物之間建立直接種間電子傳遞機制[7,15],且Fe3O4粉末和活性炭可作為電子導(dǎo)管,將酸化菌降解VFAs 過程中產(chǎn)生的電子直接傳遞給產(chǎn)甲烷菌[18],強化厭氧消化過程中的電子傳遞,加快VFAs的消耗和甲烷的生成,從而提升玉米秸稈生物產(chǎn)甲烷的潛力。

2.3 沼液中的鐵離子含量

鐵元素作為微量元素,可以被微生物所利用,增強水解產(chǎn)酸過程中相關(guān)酶的活性[19]。 pH 大于4時,Fe3+就會形成氫氧化鐵完全沉淀,當(dāng)被還原成Fe2+后才能被微生物所利用[20]。 圖4 展示了酸化后與甲烷化后沼液中Fe2+的質(zhì)量濃度。 由于接種物中含有鐵元素,因此對照組中也有Fe2+檢出。添加鐵氧化物后,酸化相中Fe2+濃度明顯上升,添加Fe3O4試驗組的Fe2+質(zhì)量濃度約為119 mg/L,添加Fe2O3試驗組的Fe2+質(zhì)量濃度約88 mg/L,且該濃度不會對微生物造成抑制作用[21]。 Fe2+濃度的上升促進(jìn)了相關(guān)酶的活性,玉米秸稈酸化效果增強,這與酸化結(jié)果一致。 與酸化相相比,甲烷化發(fā)酵后各試驗組出料沼液中Fe2+質(zhì)量濃度明顯降低,均低于15 mg/L,可能的原因一是更多的Fe2+被微生物利用;二是甲烷化過程pH 較高導(dǎo)致更多的鐵離子形成沉淀;三是PAC 的吸附作用使得Fe2+濃度降低。 沼液中Fe2+濃度低說明大量的鐵在沼渣中沉積,但這并不會影響沼渣的后續(xù)利用,有研究表明,土壤中鐵的背景值范圍為5 ～50 g/L,因此,即使將厭氧消化后的沼渣用作農(nóng)業(yè)用途也不會造成不良影響[12]。

2.4 厭氧消化系統(tǒng)的電導(dǎo)率

電導(dǎo)率是電子傳導(dǎo)能力的重要指標(biāo)[22],厭氧消化系統(tǒng)的導(dǎo)電性能可以通過電導(dǎo)率來衡量,電導(dǎo)率越高說明系統(tǒng)的導(dǎo)電性能越強。 根據(jù)DIET理論,互營微生物可以利用外源導(dǎo)電物質(zhì)進(jìn)行電子傳遞,導(dǎo)電物質(zhì)的添加可以增強厭氧消化系統(tǒng)的導(dǎo)電性能。 表2 是各試驗組分別在初始狀態(tài)時、酸化后與甲烷化后厭氧消化系統(tǒng)的電導(dǎo)率?？梢钥闯?經(jīng)過7 d 酸化后,各組電導(dǎo)率相差不大,均在7 500 ～8 200 μS/cm之間,但都明顯高于初始狀態(tài),這是因為在酸化過程中產(chǎn)生大量的可溶性酸類物質(zhì),溶液中的離子濃度增加,使得電導(dǎo)率顯著提高。 在甲烷化結(jié)束后,Fe3O4+PAC 試驗組的電導(dǎo)率最 高, 可 達(dá)10 200 μS/cm, 比 酸 化 結(jié) 束 提 高 了24.7%,高出對照組33.3%,比Fe2O3+PAC 試驗組提高了11.8%。 根據(jù)石笑羽等[22]的相關(guān)研究,在甲烷化過程中電導(dǎo)率變化較小,隨著反應(yīng)的進(jìn)行電導(dǎo)率略有上升,說明產(chǎn)甲烷過程中系統(tǒng)導(dǎo)電性能較為穩(wěn)定。 在水中添加與Fe3O4+ PAC 試驗組等量的Fe3O4粉末、活性炭粉末和接種物制成的懸濁液,測定其電導(dǎo)率僅為3 650 μS/cm,遠(yuǎn)小于Fe3O4+PAC試驗組的電導(dǎo)率,說明厭氧消化系統(tǒng)導(dǎo)電性的增強不僅是因為導(dǎo)體物質(zhì)的添加。 有研究表明,可以通過添加Fe3O4、活性炭等導(dǎo)體物質(zhì)來增強厭氧消化系統(tǒng)中的導(dǎo)電能力,促進(jìn)互營微生物之間建立DIET機制[15,23]。 Zhu 等[23]將玉米秸稈與廢活性污泥進(jìn)行共發(fā)酵,并向其中添加活性炭,在厭氧消化進(jìn)行到第30 天時測定電導(dǎo)率,結(jié)果表明,與對照組相比,試驗組的電導(dǎo)率顯著提高,存在構(gòu)建DIET 的巨大潛力。 結(jié)合各組產(chǎn)甲烷情況分析,Fe3O4+PAC 試驗組電導(dǎo)率的顯著提高說明Fe3O4粉末和活性炭粉末的添加可能加強了厭氧消化系統(tǒng)中基于DIET 的生物電連接,進(jìn)一步增強了系統(tǒng)的導(dǎo)電性能,提高電子傳遞效率,在增加甲烷產(chǎn)量的同時縮短了甲烷化周期,改善了玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)甲烷性能。

表2 各組在初始狀態(tài)時、酸化后與甲烷化后厭氧消化系統(tǒng)的電導(dǎo)率Table 2 Conductivity of each group of anaerobic digestion system in the initial state, after acidification and after methanation

2.5 微生物學(xué)特性分析

為了進(jìn)一步探究鐵氧化物與活性炭的添加對玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)甲烷的影響,采用高通量測序?qū)e2O3+PAC 試驗組和Fe3O4+PAC 試驗組反應(yīng)器中的細(xì)菌、古菌群落進(jìn)行分析,結(jié)果如圖5 所示。 從細(xì)菌群落分布圖中可以看出,Clostridium_sensu_stricto_1 豐度較高,在Fe2O3+ PAC 試驗組與Fe3O4+PAC 試驗組中的豐度分別為36.3%、39.5%,Fe3O4+PAC 試驗組略高于Fe2O3+PAC 試驗組。 Clostridium_sensu_stricto_1 為嚴(yán)格梭菌屬,可以利用糖類物質(zhì)作為碳源,生成小分子物質(zhì)供甲烷菌利用。 同時,Clostridium_sensu_stricto_1 還可參與異化鐵還原過程[24],在Fe(III)含量較高的條件下,可逐漸成為優(yōu)勢菌屬[25]。 該類細(xì)菌的存在為異化鐵還原提供了證據(jù),通過這類細(xì)菌的異化鐵還原作用可以有效促進(jìn)復(fù)雜有機物的水解酸化,這與酸化相試驗結(jié)果一致。 除Clostridium_sensu_stricto_1 之外,DMER64 與Petrimonas 也是潛在的能參與DIET 的互營細(xì)菌[5,26],且Petrimonas 作為硫還原細(xì)菌,其還原潛力通常與將電子轉(zhuǎn)移到Fe(III)氧化物的能力相關(guān),在兩組試驗組中DMER64 豐度均為4.5%,Petrimonas豐度均為1.6%,這說明鐵氧化物與PAC 的添加可以富集參與DIET 的微生物,為厭氧消化系統(tǒng)中DIET 的建立提供了可能性。

圖5(b)展示了厭氧消化系統(tǒng)中古菌群落的分布,在Fe2O3+PAC 試驗組中Methanosaeta 為優(yōu)勢菌屬,豐度高達(dá)47.6%。 Methanosaeta 是典型的專性乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌,主要利用乙酸作為底物產(chǎn)甲烷[27]。 在Fe3O4+ PAC 試驗組中,Bathyarchaeia與Methanobacterium 豐度較高,分別為43.6% 和31.4%。 Bathyarchaeia 屬于泉古菌門,能夠利用多種含碳有機物,代謝能力強,還有助于抵抗環(huán)境擾動,以維持系統(tǒng)穩(wěn)定性[28]。 Methanobacterium 為耗氫產(chǎn)甲烷菌,與酸化細(xì)菌的共生營養(yǎng)可以有效促進(jìn)丙酸的降解[29],這也是該組酸化相中乙酸含量上升、丙酸含量降低的原因之一。 此外,Fe3O4+PAC試驗組中還有部分耗乙酸產(chǎn)甲烷菌,包括Methanosaeta 與Methanosarcina,且Methanosarcina 比Methanosaeta 能利用更高濃度的酸類物質(zhì),底物可以被消耗得更徹底。 Methanosaeta、Methanosarcina 與Methanobacterium 均可參與DIET,有研究表明,在導(dǎo)電物質(zhì)與高氫分壓的誘導(dǎo)下,直接種間電子傳遞作用可能得到進(jìn)一步增強[30-31]。 結(jié)合產(chǎn)氣效果與電導(dǎo)率分析,由于Fe3O4+PAC 試驗組中不僅有耗乙酸產(chǎn)甲烷菌,還有大量耗氫產(chǎn)甲烷菌的存在,使得VFAs和H2都可以得到有效利用;除此之外,Fe3O4和PAC的添加顯著提高了系統(tǒng)的導(dǎo)電性,促使互營微生物之間DIET 機制的建立,強化了種間電子傳遞,有效促進(jìn)了玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)甲烷。

3 結(jié)論

在酸化相和甲烷相中分別添加鐵氧化物和活性炭,可以有效強化電子傳遞,提高玉米秸稈厭氧消化性能。 在酸化相中添加鐵氧化物可以強化玉米秸稈水解酸化,且Fe3O4比Fe2O3效果好,添加Fe3O4試驗組的VFAs 與乙醇總質(zhì)量濃度比對照組提高了25.4%,比添加Fe2O3的試驗組提高了8.5%。 酸化結(jié)束后加入活性炭粉末繼續(xù)進(jìn)行甲烷化試驗,Fe3O4+PAC 試驗組玉米秸稈累積產(chǎn)甲烷量達(dá)7 965 mL,與對照組相比提高了27.8%,且t80比對照組縮短了8 d,電導(dǎo)率提高了33.3%,明顯高于普通厭氧消化系統(tǒng)的電導(dǎo)率。 從微生物群落角度分析,在厭氧消化系統(tǒng)中添加鐵氧化物與活性炭可以富集參與DIET 的微生物,在Fe3O4+PAC 試驗組中,細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為Clostridium_sensu_stricto_1,古菌優(yōu)勢菌屬為Methanobacterium,這兩者可在促進(jìn)DIET 的同時提高H2利用率,從而進(jìn)一步提高甲烷產(chǎn)量。