重陽木錦斑蛾寄生真菌的分離與鑒定

洪權(quán)春 趙雷 王爽 童玲

摘要? ? 本文將被真菌寄生的重陽木錦斑蛾僵蟲收集并帶回實驗室，進行了分離、純化與鑒定，并開展人工飼養(yǎng)條件下回接試驗。結(jié)果表明，噴霧和干孢子粉接種處理下真菌寄生率分別為49.4%和68.1%。通過形態(tài)學(xué)特征和ITS序列的測序分析確定分離到的菌株為黃曲霉。

關(guān)鍵詞? ? 重陽木錦斑蛾;黃曲霉;分離;鑒定

中圖分類號? ? R446.5? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）21-0122-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Isolation? and? Identification? of? Fungus? Parasitizing? on? Histia? rhodope

HONG Quanchun 1，2? ? ZHAO Lei 2? ? WANG Shuang 1? ? TONG Ling 2

（1 College of Biology and Food， Shangqiu Normal University， Shangqiu Henan 476000; 2 Luohe City South-central of Henan Enemies Breeding and Research Center of Forestry Pest， Luohe Henan 462000）

Abstract? ? In this paper， the cadavers of Histia rhodope parasitized by the fungus were collected and brought back to the laboratory for isolation， purification and identification， and the inoculation tests were carried out under artificial rearing conditions. The results showed that the parasitic rate of strain was 49.4% and 68.1% respectively under spray and dry sporangia powder inoculation treatments. The strain was identified as Aspergillus flavus by morphological feature and ITS sequencing analysis.

Keywords? ? Histia rhodope; Aspergillus flavus; isolation; identification

重陽木（Bischofia polycarpa）是中國著名的園林行道觀賞樹種。城市綠地系統(tǒng)將重陽木規(guī)劃為園林綠化重要樹種之一。隨著漯河市打造“國家園林城市”“國家森林城市”，豐富了園林樹木種類和數(shù)量;同時，園林植物的病蟲害結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，給園林植被管理帶來了新的挑戰(zhàn)。重陽木錦斑蛾（Histia rhodope）屬于鱗翅目（Lepidoptera）斑蛾科（Zygaenidae），為重陽木的主要食葉害蟲，危害輕時可造成葉片缺刻，嚴重時可吃光整株樹上的葉片，嚴重影響城市綠化效果[1]。目前對重陽木錦斑蛾的研究以害蟲的發(fā)生規(guī)律[2-4]、生物學(xué)特性[5-7]等方面為主。防治以傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥防治為主[8-9]，有關(guān)生物防治報道僅限于生物農(nóng)藥防治，如使用印楝素、BT、阿維菌素等生物農(nóng)藥防治[10-11]。已報道的重陽木錦斑蛾天敵甚少，僅有絨繭蜂[12]、日本追寄蠅[13]、微孢子蟲[14]等。

在漯河市區(qū)重陽木錦斑蛾調(diào)查中，筆者從采集的幼蟲中得到被寄生僵蟲，進行分離得到1株寄生真菌。為了進一步確認該菌株為重陽木錦斑蛾寄生菌，在試驗條件下飼養(yǎng)重陽木錦斑蛾幼蟲進行接菌試驗，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列測序分析，確定其分類地位。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

被真菌寄生樣品為采集自漯河市人民路重陽木行道樹樹皮縫隙、樹洞中被真菌感染的老熟幼蟲或蛹，帶回實驗室供分離寄生真菌。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? 蟲口密度調(diào)查。2016年于漯河市郾城區(qū)進行了重陽木錦斑蛾蟲口密度調(diào)查，在行道樹兩旁隨機選取5株重陽木，每株剪取東、南、西、北方向距離樹干1.5～2.5 m之間的樹枝各1枝，記錄枝條葉片數(shù)及對應(yīng)蟲量，并統(tǒng)計百葉蟲量。

1.2.2? ? 寄生真菌的分離純化。將采集到的重陽木錦斑蛾僵蟲用70%乙醇浸泡3～5 s，再移至0.1%升汞水溶液中浸泡2～3 min，取出僵蟲用無菌水換洗5次后，將其移至鋪有雙層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋，并置于25 ℃下保濕培養(yǎng);待蟲體長出菌絲后，用接種針挑取少量外緣菌絲劃線接種于PDA平板上;隨后將其用接種環(huán)挑取少量外邊緣新鮮菌絲劃線接種于PDA培養(yǎng)基中進行菌的純化，4～5 d形成菌落;然后再觀察證實為同一種真菌，再接到新的PDA培養(yǎng)基上，純化3～4 次;挑取菌絲劃線于試管培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～4 d后放置于5 ℃冰箱進行菌種的保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? ? 寄生菌的形態(tài)觀察。將室外采集的寄生菌，在解剖顯微鏡下進行觀察拍照。然后，用解剖針刮取少量放置載玻片上，在電子顯微鏡下觀察分生孢子和分生孢子梗，并拍照。分離純化后，對分離純化得到的寄生真菌鏡檢，觀察分生孢子梗及分生孢子的形態(tài)，對比前后拍得的形態(tài)圖片判斷是否為一種菌，然后進行拍照記錄。

1.2.4? ? 分子生物學(xué)鑒定。采用改良的CTAB法提取真菌基因組DNA[15]，利用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGT

GAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT

ATGC-3′），以10×PCR Buffer 5 μL、模板DNA 3 μL、Taq酶0.5 μL、10 pmol引物各1 μL，補足ddH2O 39.5 μL構(gòu)成50 μL反應(yīng)體系;PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、50 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳后切割電泳條帶進行PCR產(chǎn)物膠回收，并連接于T19載體上，經(jīng)感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆，經(jīng)過PCR確認陽性克隆后，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。對測序結(jié)果的序列進行BLAST比對，經(jīng)BLAST比對分析，把測序結(jié)果提交到GenBank，獲登錄號為MT645322。應(yīng)用ClustalX 2.0.10、MEGAX等軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，用N-J法構(gòu)建進化樹。

1.2.5? ? 室內(nèi)接菌。采集剛孵化聚集幼蟲帶回實驗室，置于養(yǎng)蟲籠，每日換1次新鮮重陽木嫩枝。室內(nèi)溫度控制在29～32 ℃之間，相對濕度為56%～70%。飼養(yǎng)7 d，當(dāng)幼蟲長度約0.5 cm時，選取活躍、大小一致重陽木錦斑蛾幼蟲480頭，均分為3份，分別置于3個規(guī)格為65 cm×65 cm×65 cm的養(yǎng)蟲籠中，然后分別置于3個培養(yǎng)室內(nèi)，設(shè)置3個接種處理，分別是菌液噴霧接種處理，即在分離純化培養(yǎng)的寄生菌平板上刮取孢子，用蒸餾水10 mL浸泡、加一小滴吐溫80后充分攪拌混勻，稀釋至孢子濃度為106～108個/mL，用微量噴霧器于離蟲體50 cm處均勻噴灑完;吹撒菌粉處理，即刮取大致與菌液配制相同的孢子量置于培養(yǎng)皿蓋上，離蟲體50 cm處用吸耳球均勻吹散孢子;空白對照（CK），即不做任何處理。每天定時清理養(yǎng)蟲盒殘渣，更換重陽木新鮮幼嫩枝葉，并詳細記錄重陽木錦斑蛾幼蟲生長狀況。寄生率及矯正寄生率計算公式如下：

寄生率（%）=被感染蟲數(shù)/供試蟲數(shù)×100;

矯正寄生率（%）=（接菌處理被感染蟲數(shù)-對照處理被感染數(shù)）/供試蟲數(shù)×100。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 漯河市重陽木錦斑蛾發(fā)生現(xiàn)狀

漯河市區(qū)重陽木行道樹的路段重陽木錦斑蛾危害極為嚴重，常常造成葉片發(fā)黃、枝干變禿，呈夏季冬景，不僅降低觀賞價值，而且嚴重影響城市綠化效果。老熟幼蟲樹上吐絲落地，對行人造成極大困擾，也使環(huán)衛(wèi)工人的工作加重。2016年調(diào)查結(jié)果顯示，人民路、黃河路蟲口密度分別為1 952頭/百葉和1 335頭/百葉，重陽木錦斑蛾的危害情況較為嚴重。

2.2? ? 重陽木錦斑蛾幼蟲寄生真菌的分離和形態(tài)觀察

2016年7月20日在漯河市郾城區(qū)黃河路兩旁采集到了重陽木錦斑蛾寄生真菌，如圖1（a）所示。然后挑取少量在電子顯微鏡下觀察分生孢子梗和分生孢子，并進行拍照記錄，如圖1（b）所示。用消毒好的解剖刀切去幼蟲蟲體上的寄生真菌菌絲，在PDA培養(yǎng)基上分離純化形成的菌落拍照記錄，如圖1（c）所示，然后挑取少量在電子顯微鏡下觀察，拍照記錄。對比分離純化前后照片，判定其為一種真菌，并記為CMY。

純化后，培養(yǎng)物早期白色，隨后呈綠色。經(jīng)顯微鏡觀察，分生孢子呈綠色，分生孢子梗是一根直立的菌絲，菌絲的末端形成球狀頂囊，頂囊直徑為21～48 μm，平均直徑為39 μm，頂囊部分被初生小梗所覆蓋。每個瓶梗向莖地產(chǎn)生一條球形、有色、不分隔的分生孢子鏈，分生孢子球形或近球形，直徑為3.3～4.5 μm，平均直徑為3.5 μm。

2.3? ? 寄生菌株的分子鑒定

以提取的CMY菌株基因組DNA為模板進行PCR獲得了570 bp左右的產(chǎn)物（圖2）。從系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果來看，本研究中菌株MT645322與KX852295、MK-028959、MK989660、HQ28553、HQ285572、LC105697以及LT745394位于同一分支，均為Aspergillus flavus，序列相似性達99%以上（圖3）。

2.4? ? 室內(nèi)接種

接種處理后第13天開始出現(xiàn)僵蟲（圖4），到第16天達到高峰，第24天所有供試幼蟲或寄生死亡，或非寄生死亡或開始化蛹。最后一批化蛹第7天再計數(shù)被寄生蛹蟲數(shù)量，統(tǒng)計于被感染死亡蟲數(shù)目中。

由表1可知，噴霧和孢子粉接種處理幼蟲寄生率分別為49.4%和68.1%，明顯高于空白對照（CK），且干孢子粉處理較噴霧處理幼蟲寄生率高。噴霧和孢子粉接種處理的矯正死亡率分別為41.9%和60.6%。

3? ? 結(jié)論與討論

重陽木錦斑蛾7—9月危害重，漯河地區(qū)1年發(fā)生3代，全年有世代重疊現(xiàn)象。近幾年，重陽木錦斑蛾危害呈逐年嚴重趨勢。目前，多采用蘇云金桿菌、白僵菌粉劑與化學(xué)藥劑結(jié)合噴殺低齡幼蟲進行防治。

本研究中，自重陽木錦斑蛾僵蟲分離得到的菌株CMY，從形態(tài)學(xué)和ITS序列分析確定為黃曲霉（Aspe-rgillus flavus）的一種。李文英等[16]報道，從罹病昆蟲，如日本錘角葉蜂老熟幼蟲（Cimbex japonca）、褐蟻（Lasius fuliginosus）、粟長蝽（Blissus pallipes）和棉蚜（Aphis go-ssypii）上分別分離出曲霉菌，并鑒定出黃曲霉（A. fla-vus）、黑曲霉（A. niger）、亮白曲霉（A. candidusk）和青霉?fàn)钋梗ˋ. penicilloides）等4個種，同時對其形態(tài)特征進行了詳細描述，并對黃曲霉進行了致病試驗。楊? 葉等[17]從自然死亡的瓜實蠅（Bactrocera cucurbitae）上分離到2株曲霉菌——黃曲霉（A. flavus）和溜曲霉（A. tamarii），二者對瓜實蠅成蟲有較高的毒力。本研究中，在室內(nèi)條件下，2種接種方式的寄生率明顯高于不做任何處理的對照，可以明確分離到的黃曲霉（A. flavus）為重陽木錦斑蛾寄生菌。2種接種方法寄生率的差異及黃曲霉的安全性問題等有待于進一步研究。

4? ? 參考文獻

[1] 周英，李壽田，闞林華，等. 重陽木錦斑蛾室內(nèi)藥效研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（11）：127-129.

[2] 黃邦侃.重陽木斑蛾的生物學(xué)及防治研究[J].福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1980（1）：61-79.

[3] 樊敏.上海地區(qū)重陽木帆錦斑蛾生活史及種群動態(tài)[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29（5）：122-124.

[4] 張萍.重陽木帆錦斑蛾的生物學(xué)特性及防治技術(shù)[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2014，20（10）：72-73.

[5] 潘鵬亮，張方梅，尹健，等.翅形態(tài)特征在重陽木斑蛾成蟲性別鑒定中的應(yīng)用[J].植物保護，2019，45（3）：71-77.

[6] 楊海博，胡鎮(zhèn)杰，董鈞鋒，等.重陽木錦斑蛾越冬幼蟲的耐寒性變化[J].昆蟲學(xué)報，2019，62（8）：979-986.

[7] 周英，耿曉東，顧國海.重陽木錦斑蛾蛹的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：129-130.

[8] 金有明，徐國行，華海土，等.重陽木錦斑蛾的發(fā)生與防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2010（16）：175.

[9] 王鳳，徐穎，趙志勇，等.6種藥劑對重陽木帆錦斑蛾的毒力測定和藥效試驗[J].中國森林病蟲，2012，31（2）：39-42.

[10] 秦正春.2種新型無公害殺蟲劑防治重陽木錦斑蛾試驗[J].中國園藝文摘，2009，25（7）：42.

[11] 湯留弟，周斌.印楝素等藥劑防治重陽木錦斑蛾藥效試驗簡報[J].中國園藝文摘，2009，25（4）：34-35.

[12] 劉露.萬州區(qū)絨繭蜂寄生重陽木錦斑蛾情況調(diào)查[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2016，36（24）：184.

[13] 趙建銘，梁思義.中國主要害蟲寄蠅[M].北京：科學(xué)出版社，1984.

[14] LIU H D，DING S T，QIN Q Z，et al.Morphological and phy-logenetic analysis of Nosema sp. H R （Microsporidia，Nosem-atidae）：a new microsporidian pathogen of Histia rhodope Cramer （Lepidoptera，Zygaenidae）[J].Parasitology Research，2015，114（3）：983-988.

[15] 張穎慧，魏東盛，邢來君，等.一種改進的絲狀真菌DNA提取方法[J].微生物學(xué)通報，2008（3）：466-469.

[16] 李文英，王建明，溫變英，等.山西蟲生真菌資源的研究Ⅰ：蟲生曲霉菌的研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2002（1）：26-28.

[17] 楊葉，王萌，馬曉燕，等.感染瓜實蠅的曲霉菌及其生物學(xué)特性[J].菌物學(xué)報，2016，35（1）：20-28.

基金項目? ?河南省高等學(xué)校重點科研項目（16B10006）。

作者簡介? ?洪權(quán)春（1962—），男，吉林琿城人，副教授。研究方向：生物防治。

收稿日期? ?2020-06-25