云紅梨1號(hào)HY5基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和純化

蘇俊 陳璐 馬偉榮

摘要：HY5為調(diào)控光形態(tài)建成的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控花青素的生物合成與累積。通過(guò)構(gòu)建云紅梨1號(hào)HY5基因的原核表達(dá)載體，旨在為研究HY5蛋白的生物功能奠定基礎(chǔ)。將云紅梨1號(hào)的HY5基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）親和層析色譜柱純化融合蛋白。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-PyHY5的酶切檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果均正確，表明重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，用100 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在37 ℃、220 r/min條件下誘導(dǎo)3 h后收集誘導(dǎo)菌株，在BL21菌株中均有明顯的目的條帶，誘導(dǎo)表達(dá)后的融合蛋白大小約為43.90 ku;PyHY5蛋白能夠與pGEX-4T-1載體上的GST標(biāo)簽蛋白進(jìn)行融合表達(dá)。通過(guò)研究成功構(gòu)建了pGEX-4T-1-PyHY5原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化出PyHY5融合蛋白為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：HY5基因;云紅梨1號(hào);原核表達(dá)載體;誘導(dǎo)表達(dá);純化

中圖分類號(hào)： S661.201? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）20-0062-06

我國(guó)是梨生產(chǎn)大國(guó)，年產(chǎn)量超過(guò)世界總產(chǎn)量的60%[1]。梨的果皮有綠色、黃色、褐色、紅色等多種顏色，其中紅皮梨最受消費(fèi)者的青睞[2]，選育優(yōu)質(zhì)紅皮梨已經(jīng)成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的育種目標(biāo)之一[3]。目前，云南紅梨主要包括早熟早白蜜、中熟32號(hào)（又稱美人酥）和中熟35號(hào)（又稱滿天紅）、晚熟云紅梨1號(hào)，其中云紅梨1號(hào)是由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院從云南省硯山縣的種質(zhì)資源中選育而來(lái)的[4]，其果皮著色面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他3種梨，達(dá)90%以上。由于云南紅梨外觀色澤鮮艷、內(nèi)在品質(zhì)優(yōu)良，目前已在云南安寧、江川、德宏、麗江、保山等地大面積種植，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷澳大利亞、新西蘭、泰國(guó)等，市場(chǎng)前景廣闊，在國(guó)內(nèi)現(xiàn)已引種到河南[5-7]、貴州[8]、安徽、山東、河北[9]、甘肅[10]等省。

HY5是光形態(tài)建成的正調(diào)控因子，是光調(diào)控植物發(fā)育的分子開關(guān)[11]。光誘導(dǎo)果皮著色的過(guò)程主要包括光作用于光受體、光受體通過(guò)某種途徑作用于轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花青素的生物合成和累積等。云南紅梨果皮的果色著色，主要是矢車菊素-3-O-半乳糖苷在果皮中合成和累積的結(jié)果[12]，影響果皮著色的主要因素是光照[13]。本研究對(duì)筆者所在課題組前期獲得的云紅梨1號(hào)HY5基因的序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，HY5蛋白除了bZIP域外，無(wú)其他明顯的結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明由于缺乏潛在的轉(zhuǎn)錄激活域，使得HY5蛋白要與其他轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生協(xié)同作用。pGEX-4T-1是一種可以高效表達(dá)插入的外源基因的融合蛋白表達(dá)載體，帶有tac啟動(dòng)子，具有氨芐青霉素（Amp）抗性，能夠克服轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)外源基因的表達(dá)可能造成的不利影響[14]。因此，pGEX-4T-1-PyHY5融合蛋白的成功誘導(dǎo)表達(dá)和純化，為云紅梨1號(hào)依光合成紅色果皮以及PyHY5基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 云紅梨1號(hào)果實(shí)于2019年9月采自云南省安寧市清水河果園，采后于筆者所在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行試驗(yàn)。使用水果刀迅速削取云紅梨1號(hào)的新鮮紅色果皮，立即投入盛有液氮的保溫桶中，之后于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱內(nèi)保存。大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞及表達(dá)菌株Escherichia coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，購(gòu)自GE Healthcare公司。

1.1.2 主要試劑? 試驗(yàn)中所用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（DP209-03）及質(zhì)粒小提試劑盒（DP103-02），購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ及T4 DNA連接酶，均購(gòu)自TaKaRa公司;LB培養(yǎng)基，購(gòu)自安琪公司;NI Crystarose FF，購(gòu)自晶誠(chéng)生物科技公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），購(gòu)自Amresco公司。

3 L S1（裂解緩沖液）配方：150 mL 1 mol/L Tris （pH值為8.0），9 g NaCl，30 mL 500 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）。

3 L S2（洗滌緩沖液）配方： 150 mL 1 mol/L Tris （pH值為8.0），9 g NaCl，30 mL 500 mmol/L EDTA。洗滌時(shí)取40 mL，加入2 mL 20%Triton X-100。

20 mL S3（洗脫緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用）配方：1 mL 1 mol/L Tris （pH值為8.0）， 0.2 g 谷胱甘肽（GSH），用去離子水定容至20 mL。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備? PTC-200 PCR儀、SiGMA 3k15 高速離心機(jī)、NANODROP 2000 紫外分光光度計(jì)、DYY-10C 型電泳槽和電泳儀，均購(gòu)自北京六一儀器廠;SYNGENE G： BOX 凝膠成像系統(tǒng)儀，購(gòu)自英國(guó)Syngene公司;TS-1 脫色搖床，購(gòu)自上海圣科儀器設(shè)備有限公司;YLN-III 超強(qiáng)紫外透射儀，購(gòu)自北京譽(yù)朗諾科技有限公司;超聲破碎儀，購(gòu)自南京先歐儀器制造有限公司;NGC Quest 10 蛋白純化系統(tǒng)儀，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司（Bio-Rad）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 云紅梨1號(hào)HY5基因的克隆 根據(jù)已有的蘋果MdHY5基因序列（登錄號(hào)：AB710143.1），設(shè)計(jì)特異性引物（PyHY5-F：5′-ATGCAAGAGCAGGCG-3′;PyHY5-R：5′-TCAATCCGCATTTGCAC-3′）。以云紅梨1號(hào)紅色果皮cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件：98 ℃ 3 min;98 ℃ 10 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。回收PCR 產(chǎn)物，加尾，連接到pGEX-4T-1 載體上，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR 檢測(cè)和酶切鑒定后測(cè)序。

對(duì)于構(gòu)建好的pGEX-4T-1-PyHY5， 挑選菌落進(jìn)行PCR 鑒定，切取大小正確的條帶后，用 PGEX-5（正向通用引物，序列為5′-GGGCTGGC AAGCCACGTTTGGTG-3′）進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果表明，序列中有包含雙酶切位點(diǎn)（BamHⅠ和XhoⅠ）的PyHY5基因片段，大小為495 bp，且含有雙酶切位點(diǎn)BamHⅠ（GGATCC）和XhoⅠ（CTCGAG），與預(yù)期的載體片段相符，說(shuō)明pGEX-4T-1-PyHY5原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，詳見(jiàn)圖1。

2.2 pGEX-4T-1-PyHY5原核表達(dá)載體的表達(dá)

將含有重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-PyHY5的原核表達(dá)菌株BL21（DE3）在100 mmol/L IPTG、37 ℃、220 r/min的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，3 h后收集誘導(dǎo)菌株。12%SDS-PAGE凝膠電泳鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，推測(cè)PyHY5的蛋白質(zhì)大小為17.9 ku，pGEX-4T-1載體上所帶GST標(biāo)簽蛋白大小為26 ku，因此推測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)出的融合

蛋白大小為43.90 ku。由圖2可知，該融合蛋白在BL21表達(dá)菌株中均有明顯表達(dá)，且目的蛋白大小與預(yù)測(cè)蛋白大小吻合，而未誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-PyHY5的原核表達(dá)菌株BL21（DE3）在4390 ku處沒(méi)有出現(xiàn)明顯條帶，證明pGEX-4T-1-PyHY5原核表達(dá)載體得到了成功表達(dá)。

2.3 pGEX-4T-1-PyHY5原核表達(dá)蛋白的可溶性鑒定

選取表達(dá)最好的誘導(dǎo)菌液，離心收菌、去除上清后加入600 μL PBS，混勻后，置于超聲破碎離心管中離心，取出上清，向去除上清的沉淀中加入100 μL PBS，混勻，分析目的蛋白是否為可溶性表達(dá)。用12% SDS-PAGE 凝膠電泳進(jìn)行鑒定，由圖3可知，pGEX-4T-1-PyHY5原核表達(dá)蛋白經(jīng)誘導(dǎo)后在約43.90 ku處出現(xiàn)了1條蛋白條帶，在未經(jīng)誘導(dǎo)的空白對(duì)照中沒(méi)有出現(xiàn)此條帶;同時(shí)，在菌液離心后得到的上清液及沉淀中，位置相近的地方也出現(xiàn)與誘導(dǎo)成功的菌液相同的蛋白條帶，表明pGEX-4T-1-PyHY5原核表達(dá)蛋白在上清中也有表達(dá)，且可溶性較好。

2.4 pGEX-4T-1-PyHY5原核表達(dá)蛋白的純化

收集400 mL大量表達(dá)菌體，加入100 mL S1溶液、1 mL 1 mol/L DTT和1 mL 100 mmol/L PMSF，混勻后超聲破碎（6號(hào)探頭，功率30%，超聲2 s，停止2 s，持續(xù)10～20 min），直至菌液達(dá)澄清半透明狀態(tài)，離心后收集上清，將商業(yè)化GST-瓊脂糖珠加入含有1 mL ddH2O的柱中，待珠子沉淀后，對(duì)融合蛋白進(jìn)行處理和純化。如圖4 所示，PyHY5 融合蛋白經(jīng)過(guò)S1、S2、S3溶液和GST-瓊脂糖珠處理、純化后得到單一的目的條帶，未出現(xiàn)雜帶，該蛋白與大量表達(dá)后PyHY5融合蛋白的位置一致，與預(yù)期蛋白大小相符，蛋白濃度、純度較高，共獲得8 mL純化蛋白，經(jīng)測(cè)定，純化蛋白的質(zhì)量濃度為500 μg/mL。

3 討論

光在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的意義重大，在調(diào)控植物光形態(tài)建成的過(guò)程中，紅光、遠(yuǎn)紅光、藍(lán)光、UV-、UV-B等均會(huì)影響HY5的積累，而且HY5調(diào)控光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的相關(guān)基因[15]。目前，在部分植物（如津田蕪菁[16]、擬南芥[17]、油菜[18]等）中，HY5的編碼基因已經(jīng)被成功克隆，HY5可直接與花青素合成的關(guān)鍵基因發(fā)生相互作用。在前人研究的植物中，HY5基因編碼的HY5蛋白的C末端具有bZIP結(jié)構(gòu)域，可直接與基因的啟動(dòng)子作用元件 G-box 結(jié)合，從而激活并誘導(dǎo)該基因的表達(dá)[11]。Ang等的研究表明，擬南芥的HY5過(guò)量表達(dá)植株在光下生長(zhǎng)時(shí)，表現(xiàn)為光形態(tài)建成[19]，表明HY5是光形態(tài)建成過(guò)程中的1個(gè)正調(diào)控因子。盡管有學(xué)者對(duì)植物中的HY5進(jìn)行了一些研究，關(guān)于HY5的結(jié)構(gòu)、功能及其分子機(jī)制也逐漸明晰，但HY5與其他蛋白的協(xié)同作用尚未明確。因此，開展云紅梨1號(hào)HY5基因的原核表達(dá)研究，可以為深入研究HY5的生物學(xué)活性和互作奠定基礎(chǔ)。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)制備重組蛋白有諸多優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于植物蛋白的表達(dá)研究中[20]。將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到帶有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷后，tac就會(huì)被誘導(dǎo)，tac啟動(dòng)子后的GST標(biāo)簽及其后的插入基因就會(huì)得到表達(dá)[21]。而pGEX-4T-1載體表達(dá)的蛋白產(chǎn)物在N端含有GST序列，加入融合標(biāo)簽GST后，重組蛋白的大小會(huì)隨即增加26.0 ku，蛋白正確折疊，以融合形式表達(dá)[14]。在本研究中，PyHY5的蛋白質(zhì)大小僅為17.90 ku，因此表達(dá)的融合蛋白分子量應(yīng)為43.90 ku;此外，由于pGEX-4T-1在表達(dá)菌株中高效表達(dá)，因此本試驗(yàn)以 pGEX-4T-1作為表達(dá)載體。構(gòu)建原核表達(dá)載體后，在特定條件下被誘導(dǎo)，收集誘導(dǎo)菌株，發(fā)現(xiàn)有明顯的目的條帶，蛋白大小為43.90 ku，表明PyHY5蛋白在BL21菌株中高效表達(dá)。綜上本研究以pGEX-4T-1作為表達(dá)載體，與云紅梨1號(hào)PyHY5基因的開放閱讀框構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）感受態(tài)，獲得了陽(yáng)性的原核表達(dá)菌株。同時(shí)，用IPTG誘導(dǎo)原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-PyHY5后，PyHY5蛋白獲得了高效表達(dá)，這也為進(jìn)一步闡明HY5調(diào)控花青素生物合成的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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