苦菜、茵陳內(nèi)生真菌的分離鑒定與生物活性

王盈桐 李學(xué)威 陸云彪

摘要：植物內(nèi)生菌是尚未得到充分開發(fā)利用的微生物資源。為了充分開發(fā)苦菜、茵陳這2種菊科植物的內(nèi)生菌資源，獲得具有抗菌、抗氧化活性的內(nèi)生菌，采用組織分離法從茵陳、苦菜中分離內(nèi)生真菌，并使用平板對峙法對內(nèi)生真菌進行抗菌活性驗證，并測定內(nèi)生真菌提取物1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）清除率，以驗證內(nèi)生真菌的抗氧化活性。此外，對于具有抗菌和抗氧化活性的菌株，通過內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）測序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、形態(tài)學(xué)觀察進行鑒定。結(jié)果表明，分離自苦菜的KC-G-2-3-2和分離自茵陳的YC-J-4-2對串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌均具有拮抗作用，抑菌率在50%以上，其中KC-G-2-3-2對白絹病病菌也有較強的抑制作用;2株內(nèi)生真菌菌液和菌體提取物都表現(xiàn)出較好的DPPH·清除功效，其中YC-J-4-2的PDB培養(yǎng)基發(fā)酵液的菌液提取物對DPPH·的清除率超過90%。由菌株鑒定結(jié)果看出，KC-G-2-3-2為木霉屬菌株，YC-J-4-2為間座殼屬菌株。

關(guān)鍵詞：苦菜;茵陳;內(nèi)生真菌;抗菌活性;抗氧化活性

中圖分類號：S182?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0265-05

內(nèi)生菌（endophytes）是一類非常重要的微生物資源，在自然界中廣泛存在，它們具有獨特的生理和代謝機制，能夠適應(yīng)植物內(nèi)部特殊的環(huán)境，同時還能夠產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，幫助植物抵抗病原微生物[1-2]。此外，一些藥用植物內(nèi)生菌因長時間與宿主協(xié)同進化，可產(chǎn)生某些與宿主植物相似或相同的具有藥用價值的代謝物質(zhì)[3-6]。因此，從植物內(nèi)生菌中，特別是藥用植物內(nèi)生菌中挖掘活性天然產(chǎn)物，不僅可為藥物的研發(fā)提供新的方向，還能在一定程度上解決傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物藥源——藥用植物生長緩慢、資源緊缺等問題。

苦菜（Sonchus oleraceus）和茵陳（Artemisiae scopariae）廣泛分布于全國各地，是藥食兩用的菊科植物。近年來，學(xué)者們對這2種植物的活性成分研究也較為深入，已經(jīng)證實它們均具有抗菌、抗氧化活性[7-8]?？嗖酥械目寡趸钚猿煞种饕S酮[9-10]、多酚[11]和多糖[12]，其提取物對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌都具有較好的抑制作用[13-14]。茵陳的抗氧化活性成分主要為香豆素類化合物[15]、黃酮類化合物[16-17]、綠原酸[18]及揮發(fā)油類化合物[19]，其中綠原酸對多種細菌、霉菌具有抑制作用[20]。目前，針對苦菜、茵陳植物內(nèi)生菌的研究鮮有報道，本研究從苦菜、茵陳中分離獲得內(nèi)生真菌，測定其抗菌、抗氧化活性，并對有活性的菌株進行鑒定，旨在為進一步開發(fā)利用植物內(nèi)生菌資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 新鮮、健康的茵陳和苦菜于2018年10月初采集自山東泰山。

1.1.2 供試菌株 供試菌株有串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、白絹病病菌（Selerotium rolfsii）、層生鐮刀菌（Fusarium proliferatum）等植物病原真菌，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室惠贈。

1.1.3 培養(yǎng)基 內(nèi)生菌分離純化培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基和麥芽汁（ME）培養(yǎng)基。PDA配方：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，瓊脂 20 g，1 L去離子水，pH值自然。ME配方：20 g麥芽提取物，2 g蔗糖，0.2 g蛋白胨，20 g瓊脂，1 L去離子水，pH值自然。內(nèi)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基和ME液體培養(yǎng)基，即分離純化培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離純化 采用組織分離法[21]分離純化苦菜和茵陳中的內(nèi)生菌。將新鮮植物材料用無菌水沖洗干凈并晾干，將根、莖、葉分別用無菌手術(shù)刀片切成小塊，先用75%乙醇消毒3 min、無菌水沖洗3次，再用10%次氯酸鈉浸泡8 min、無菌水沖洗3次，最后用無菌濾紙吸干水分。將組織材料縱切后置于分離純化培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基放4組，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，待組織塊邊緣有菌絲長出后，挑取不同形態(tài)的菌絲接種于新鮮培養(yǎng)基上，反復(fù)分離純化即得內(nèi)生真菌。

1.2.2 抑菌試驗 采用平板對峙法[22]進行抑菌試驗，用直徑為5 mm的無菌打孔器打取供試病原真菌菌餅、內(nèi)生菌菌餅，將其對稱放于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃下培養(yǎng)5 d，分別測量病原菌對峙側(cè)、非對峙側(cè)半徑，并按如下公式計算抑菌率：

抑菌率=（非對峙側(cè)半徑-對峙側(cè)半徑）/（非對峙側(cè)半徑）×100%。

挑取供試病原真菌和內(nèi)生菌生長交界處的菌絲制片，并用顯微鏡觀察其形態(tài)。

1.2.3 發(fā)酵液的制備和萃取 挑取內(nèi)生菌菌絲接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)10 d。將發(fā)酵培養(yǎng)物過濾，除去菌體，濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，于55 ℃條件下減壓濃縮蒸干，即得菌液粗提物。將過濾得到的菌體用適量95%乙醇冷凝回流3次，合并乙醇相，減壓濃縮蒸干，即得菌體粗提物。用體積比為1 ∶ 1的無水乙醇和去離子水溶液溶解粗提物。菌液粗提物和菌體粗提物均置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 內(nèi)生菌1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）清除能力測定 參照Li等的方法[23]測定內(nèi)生菌清除DPPH·的能力。精確稱取0.001 97 g DPPH粉末，用無水乙醇溶解并定容至100 mL（終濃度為0.05 mmol/L），作為母液，于4 ℃下低溫避光保存。向2 mL DPPH母液中加入1 mL菌液粗提物和2 mL無水乙醇（最終提取液濃度為 3 mg/mL），混勻，于25 ℃下水浴30 min，以相同濃度的維生素C溶液為陽性對照，測定517 nm處的吸光度，記作A1處理;另外將1 mL菌體粗提物與 4 mL 無水乙醇混勻，記作A2處理。按如下公式計算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率=[1-（D517 nm（1）-D517 nm（2））/D517 nm（3）]×100%。

式中：D517nm（1）為提取液或維生素C溶液的吸光度;D517nm（2）為背景溶液（提取液或維生素C溶液）不加DPPH時的吸光度;D517 nm（3）為空白對照（蒸餾水代替提取液或維生素C溶液）的吸光度。每個樣品設(shè)3次重復(fù)，取平均值。

1.2.5 菌株的鑒定 采用平板培養(yǎng)法、顯微鏡鏡檢法對具有活性的內(nèi)生真菌進行形態(tài)學(xué)鑒定。通過內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）測序?qū)赀M行分子生物學(xué)鑒定。將平皿中培養(yǎng)好的內(nèi)生真菌直接交給睿博興科（青島）測序部進行PCR測序。將測定的ITS序列與GenBank中已知的核酸序列進行BLAST比對分析，從中獲得與菌株ITS同源的序列，用MEGA 70軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌對病原真菌的拮抗作用

從苦菜中共分離獲得21株內(nèi)生真菌，其中從根部、莖部分別分離獲得14、7株;從茵陳中共分離獲得13株內(nèi)生真菌，其中從根部、莖部分別分離獲得8、5株。使用平板對峙法測定內(nèi)生真菌對病原真菌的拮抗能力，結(jié)果顯示，分離自苦菜根部的 KC-G-2-3-2對白絹病病菌、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌等4種植物病原菌都具有良好的抑菌效果，抑菌率分別為50%、40%、41%、65%（圖1）;分離自茵陳莖部的YC-J-4-2對串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌等3種植物病原菌具有良好的抑菌效果，抑菌率分別為56%、46%、63%，但對白絹病菌無抑菌作用（圖2）。

由圖1、圖2還可以看出，在內(nèi)生菌菌株 KC-G-2-3-2、YC-J-4-2的作用下，4種植物病原真菌菌絲的正常生長均受到了抑制，表現(xiàn)為無法向外生長延伸，被抑制的地方產(chǎn)生明顯的分界線，對該位置的菌絲進行顯微觀察，未發(fā)現(xiàn)病原真菌菌絲有畸形現(xiàn)象，表明內(nèi)生真菌主要是通過與病原真菌競爭生存空間和營養(yǎng)物質(zhì)來抑制其生長。

2.2 待測樣品的制備

將“2.1”節(jié)中得到的具有抑菌活性的內(nèi)生菌分別用PDB培養(yǎng)基、ME液體培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)，10 d 后共得到4份待測樣品， 將KC-G-2-3-2

的PDB發(fā)酵液記作A樣品，ME發(fā)酵液記作B樣品;YC-J-4-2的PDB發(fā)酵液記作C樣品，ME發(fā)酵液記作D樣品。4份樣品過濾后，分別萃取過濾液和菌體，將其進一步分為菌液提取物、菌體提取物，共8份樣品，每份樣品的質(zhì)量見表1。

2.3 抗氧化活性的測定結(jié)果

由表2可知，在3 mg/mL的質(zhì)量濃度下，測試樣品對DPPH·表現(xiàn)出了不同程度的清除作用，其中YC-J-4-2的PDB培養(yǎng)基發(fā)酵液的菌液粗提物對DPPH·的清除率超過了90.0%，菌體粗提物對DPPH·的清除率超過了80.0%，顯示出較強的抗氧化活性，其余樣品對DPPH·的清除率均在500%以上。

2.4 內(nèi)生菌的鑒定結(jié)果

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 KC-G-2-3-2菌株的菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果見圖3。KC-G-2-3-2菌株生長迅速，初期菌落為白色，呈致密、絨毛狀，隨后菌落中央產(chǎn)生綠色孢子，中央變成綠色。分生孢子產(chǎn)生后，單生或簇生，呈圓形、綠色，初步鑒定屬于木霉屬（Trichoderma sp.）。

YC-J-4-2菌株的菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果見圖4。YC-J-4-2菌株在生長初期呈乳白色，氣生菌絲發(fā)達致密，呈羽毛狀，后期逐漸轉(zhuǎn)為灰色。在顯微鏡下只觀察到菌絲，未見有分生孢子產(chǎn)生，可能與培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件有關(guān)，需要進一步用分子手段對其進行鑒定。

2.4.2 分子水平的鑒定結(jié)果 經(jīng)測序可知，KC-G-2-3-2菌株ITS 序列長581 bp（GenBank登錄號：MN823637）。對該序列進行BLAST比對分析，結(jié)果顯示，它與短木霉（Trichoderma breve）的同源性最高，相似度為100%;選出相關(guān)性較高的屬內(nèi)相關(guān)菌株的ITS序列，用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，它與Trichoderma breve聚為1族（圖5），確定KC-G-2-3-2為木霉屬菌株，命名為Trichoderma breve KC-G-2-3-2。

經(jīng)測序可知，YC-J-4-2菌株ITS序列長 544 bp（GenBank登錄號：MN823638）。對該序列進行BLAST比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它與間座殼菌（Diaporthe goulteri）的同源性最高，相似度為100%;選出相關(guān)性較高的屬內(nèi)相關(guān)菌株的ITS序列，用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，它與Diaporthe goulteri聚為1族（圖6），確定YC-J-4-2為間座殼屬菌株，命名為Diaporthe goulteri YC-J-4-2。

3 結(jié)論與討論

化學(xué)農(nóng)藥的濫用不僅會對人類生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生惡劣影響，還會導(dǎo)致病蟲害抗性等問題，因而亟需開發(fā)出高效、低毒、無污染的新型農(nóng)藥。生物農(nóng)藥具有選擇性強、藥效高、對環(huán)境較友好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，這些特性不僅滿足了當代人的需求，更滿足了可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略目標，因此，生物農(nóng)藥具有十分廣闊的發(fā)展前景，有望成為最具發(fā)展?jié)摿Φ霓r(nóng)藥品種[24-25]。本試驗以藥食兩用植物苦菜、茵陳為材料，分離篩選出2株對串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌具有良好抑制作用的植物內(nèi)生菌KC-G-2-3-2、YC-J-4-2，其中KC-G-2-3-2還對白絹病菌有良好的抑制作用。這2株植物內(nèi)生真菌均有潛力作為生防菌開發(fā)為生物農(nóng)藥。

抗氧化活性是備受醫(yī)學(xué)界關(guān)注的生物學(xué)活性之一。越來越多的研究結(jié)果顯示，抗氧化是預(yù)防衰老的重要途徑，消除過多的氧化自由基對于預(yù)防許多由自由基引起的相關(guān)疾病是非常重要的?？寡趸瘎τ诜乐伟┌Y、心臟病、腦卒中、阿爾茨海默癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及白內(nèi)障等慢性疾病都具有一定的效果[26]。本試驗分離得到2株植物內(nèi)生真菌 KC-G-2-3-2、YC-J-4-2，用不同液體培養(yǎng)基發(fā)酵后，其發(fā)酵過濾液、菌體萃取液的抗氧化活性檢測結(jié)果顯示，2株內(nèi)生菌均具有良好的DPPH·清除能力，清除率均在50%以上。特別是YC-J-4-2的PDB培養(yǎng)基發(fā)酵液的菌液提取物，對DPPH·的清除率超過90%，菌體提取物對DPPH·的清除率超過80%，顯示出較強的抗氧化活性。

通過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)水平的鑒定，確定 KC-G-2-3-2為木霉屬菌株，YC-J-4-2為間座殼屬菌株，這2個屬均為常見的植物內(nèi)生菌屬，近年來關(guān)于這2個菌屬菌株的抗菌、抗氧化研究也較多。如Hu等從荔枝內(nèi)生菌綠木霉（Trichoderma virens）中分離得到一系列倍半萜類化合物，這些化合物均具有抑制植物病原真菌的活性[27];Ikram等研究發(fā)現(xiàn)，牛茄子內(nèi)生菌婁地青霉（Penicillium roqueforti）、里氏木霉（Trichoderma reesei）的發(fā)酵萃取物具有抑制植物病原細菌和抗氧化活性[28];Guo等從植物內(nèi)生菌間座殼屬某菌株中獲得了1個新化合物diaporone A，該化合物抑芽孢桿菌的活性中等，細胞毒活性弱[29];da Rosa等采用超臨界流體萃取技術(shù)從植物內(nèi)生菌Diaporthe schini中獲得了具有抗氧化活性的提取物，該提取物對DPPH·的清除率可達9662%[30]。本試驗從苦菜、茵陳中所得菌株，既具有拮抗植物病原真菌活性，又具有抗氧化活性，具有較高的潛在應(yīng)用價值，結(jié)果可為這2種植物內(nèi)生菌的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

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