象草ITS2序列的克隆與比較分析

蔡升 楊平 續(xù)晨 蔡小寧

摘要? ? 從象草葉片提取了DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了一段長(zhǎng)度為283bp的ITS2序列。不同物種間ITS2序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，象草與玉米的親緣關(guān)系最近，屬于單子葉植物類群。與GenBank中其他來(lái)源的ITS2序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)多條ITS2序列之間存在少量堿基的差異。針對(duì)這種情況，提出可以采用“基準(zhǔn)”ITS2序列作為解決辦法。

關(guān)鍵詞? ? 象草;“基準(zhǔn)”ITS2序列;克隆

中圖分類號(hào)? ? Q943.2? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）21-0220-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Cloning? and? Comparative? Analysis? of? ITS2? Sequence? of? Pennisetum? purpureum

CAI Sheng 1，2? ? YANG Ping 1? ? XU Chen 1? ? CAI Xiao-ning 1 *

（1 College of Food Science， Nanjing Xiaozhuang University， Nanjing Jiangsu 211171; 2 College of Agriculture， Nanjing Agricultural University， Nanjing Jiangsu 210095）

Abstract? ? DNA was extracted from Pennisetum purpureum leaves and amplified by PCR， and an ITS2 sequence with length of 283bp was obtained. Phylogenetic analysis of ITS2 sequences among different species showed that Pennisetum purpureum and corn had the closest genetic relationship and belonged to the monocotyledonous group. Compared with ITS2 sequences from other sources in GenBank， it was found that there were a few base differences among multiple ITS2 sequences. In view of this situation， it was proposed that the "benchmark" ITS2 sequence could be used as a solution.

Keywords? ? Pennisetum purpureum; "benchmark" ITS2 sequence; cloning

象草（Pennisetum purpureum）是一種新型的高產(chǎn)高蛋白牧草，具有適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖快、產(chǎn)量高、質(zhì)量好、利用周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，柔軟多汁，適口性好，牛、羊、鵝等畜禽均喜食，幼嫩時(shí)期也是豬、魚的優(yōu)良飼料。除四季給家禽提供青飼料外，也可調(diào)制成干草或青貯料備用[1-5]。此外，還可以制備成氣體、固體和液體等能源產(chǎn)品，以替代化石能源能減少溫室氣體的增長(zhǎng)、減少碳的排放并消除煙霧，使環(huán)境和相關(guān)能源問題得以解決[6]。研究結(jié)果表明，象草用于重金屬鎘污染的土壤的修復(fù)也有很好的效果，修復(fù)效率甚至超過了鎘超富集植物三葉鬼針草[7]。

有研究發(fā)現(xiàn)，植物基因組DNA上有一段稱為核糖體基因DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）的序列，可以作為物種分類鑒定的條形碼，Chen等[8]研究了超過4 000種植物的樣品后發(fā)現(xiàn)，ITS2序列的物種鑒別成功率大于92.7%。目前有關(guān)象草的ITS2序列鮮有報(bào)道，在本試驗(yàn)中，擬提取其基因組DNA，克隆其ITS2序列，并進(jìn)行序列的比較分析，提供相應(yīng)信息，為今后的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

象草葉片。

1.2? ? 試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 引物序列。上游引物序列為ATGCGATACTTG-GTGTGAAT，下游引物序列為GACGCTTCTCCAGAC-TACAAT。

1.2.2? ? ITS2序列的克隆與測(cè)序。首先從象草葉片提取基因組DNA，然后用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定后，將PCR產(chǎn)物送南京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3? ? 序列分析。登錄NCBI網(wǎng)站獲取所需要的ITS2序列，用Lasergene 7.1的子軟件SeqMan分析各種生態(tài)型象草ITS2序列的變異，用Clustalx 1.83和MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 象草ITS2序列的獲得

用1.2所述的引物以象草葉片DNA為模板進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，得到了一段長(zhǎng)度為283 bp的序列，包含部分5.8S序列、完全的ITS2序列和部分26S序列，具體序列已經(jīng)提交GenBank，序列ID（Accession number）號(hào)碼為MT649904。

2.2? ? 不同物種間ITS2序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將所獲得的象草ITS2序列和其他一些物種的ITS2序列用Clustalx 1.83和MEGA 6軟件鄰接法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，明顯可以分為3個(gè)聚類，象草（Pennisetum purpureum，MT649904）、荸薺（Eleocharis dulcis，AF190604）、姜（Zingiber officinale，LS999889）、美人蕉（Canna indica，F(xiàn)J939544）、玉米（Zea mays，AF-019817）、小麥（Triticum aestivum，AJ301799）、水稻（Or-yza sativa，AF169230）聚為一類，此類幾個(gè)物種均為單子葉植物，其中與玉米關(guān)系最為密切;陸地棉（Gossy-pium hirsutum，KF454241）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，LC089989）、紅景天（Rhodiola rosea，KF454616）、大豆（Glycine max，MG237487）、圓葉葡萄（Vitis rotundifolia，MG200158）、水燭（Typha angustifolia，KF454377）、蒲公英（Taraxacum mongolicum，EF114672）、馬齒莧（Portu-laca oleracea，AB823847）聚為一類，此類中除了水燭為單子葉植物外，其他均為雙子葉植物;胡椒（Piper nigrum，LC461757）、銀杏（Ginkgo biloba，Y16892）、馬尾松（Pinus massoniana，JF829706）、云南紅豆杉（Taxus wallichiana，MF785718）聚為一類，此類除了胡椒屬于被子植物外，其余均為裸子植物。

2.3? ? 象草不同生態(tài)型ITS2序列的比較分析

將獲得的象草ITS2序列與從GenBank搜尋到的18個(gè)其他生態(tài)型象草的ITS2序列用Lasergene的子軟件SeqMan進(jìn)行堿基變異分析，發(fā)現(xiàn)ITS2區(qū)域的堿基位置能一一對(duì)應(yīng)。不同研究者提交的19個(gè)ITS2序列如果被當(dāng)成同一次實(shí)驗(yàn)的多個(gè)克隆的測(cè)序結(jié)果，可以拼接成一個(gè)“基準(zhǔn)”ITS2序列，與“基準(zhǔn)”ITS2序列比較，各個(gè)ITS2序列在對(duì)應(yīng)位置的堿基不變或者變異成其他的堿基。

本文以MT649904序列為參照，則“基準(zhǔn)”ITS2序列相對(duì)應(yīng)的位置在第52堿基到第268堿基之間。由表1可知，MT649904、JX156340、JX156338、JX156339、KR350689、AF345232、AY628128、KJ776736這8個(gè)序列的ITS2區(qū)域內(nèi)的序列與“基準(zhǔn)”ITS2序列相比較，沒有發(fā)生任何變化;其他11個(gè)序列的ITS2區(qū)域內(nèi)的序列與“基準(zhǔn)”ITS2序列相比較，出現(xiàn)1～5個(gè)堿基的變異，其中以FJ626356的變異最多，有5個(gè)位置的堿基發(fā)生了變異。多個(gè)來(lái)源的序列一起比較堿基發(fā)生變異的位置，則分別為第86、94、99、110、130、136、137、181、204、214、246堿基。發(fā)生變異最多的為第204堿基的位置，有5個(gè)序列發(fā)生了變異;其次為第181和第246堿基的位置，有4個(gè)序列發(fā)生了變異。

3? ? 結(jié)論與討論

從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，象草的分類地位處于單子葉植物類別，與玉米關(guān)系密切，暗示了其為C4植物，具有高光合效率的特點(diǎn)。各個(gè)物種ITS2序列的聚類特點(diǎn)與分類地位基本吻合，表明用ITS2序列進(jìn)行物種分類鑒定具有較高的正確性。

隨著GenBank中的ITS2序列數(shù)據(jù)的不斷增加，對(duì)一些物種而言，已經(jīng)積累了很多的序列信息，但是經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)物種的多條ITS2序列往往不完全一樣，出現(xiàn)這種情況的原因可能是測(cè)序錯(cuò)誤，也可能不同生態(tài)型發(fā)生了少量變異。以ITS2序列為參照，進(jìn)行物種鑒別和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析時(shí)，如果隨機(jī)選擇其中一條序列，大多數(shù)情況下問題不大，但有時(shí)可能出現(xiàn)偏差，因而更穩(wěn)妥的辦法是選擇一條能夠代表該物種的ITS2序列。采用“基準(zhǔn)”ITS2序列，顯然是一個(gè)解決辦法。今后建立的ITS2序列數(shù)據(jù)庫(kù)，當(dāng)一個(gè)物種的ITS2序列信息積累到足夠數(shù)量時(shí)，可以專門增列一條“基準(zhǔn)”ITS2序列。如果要依靠手工獲取“基準(zhǔn)”ITS2序列，可以采用Lasergene的子軟件SeqMan或其他軟件，從GenBank獲得一個(gè)物種的多條ITS2序列則往往要逐條搜索和下載，今后需要加強(qiáng)生物信息學(xué)軟件的研制，以進(jìn)一步提高效率。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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基金項(xiàng)目? ?國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31400567）。

作者簡(jiǎn)介? ?蔡升（1993—），女，江蘇南京人，在讀博士研究生。研究方向：作物遺傳育種與種質(zhì)資源評(píng)價(jià)利用。

通信作者

收稿日期? ?2020-06-27