結(jié)核分枝桿菌耐環(huán)絲氨酸相關(guān)基因研究進(jìn)展

何興，陳玲

耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）指同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼耐藥的結(jié)核病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全球范圍內(nèi)MDR-TB患者數(shù)量約為160 684例，其中廣泛耐藥結(jié)核病（XDR-TB）患者數(shù)量約占8.5%［1］，MDR-TB成為全球范圍內(nèi)結(jié)核病防控工作面臨的主要挑戰(zhàn)。環(huán)絲氨酸是1952年研發(fā)的一種抗生素，具有較強(qiáng)的抗結(jié)核分枝桿菌作用，因而WHO于2011年推薦環(huán)絲氨酸作為治療MDR-TB的二線核心口服抗結(jié)核藥物之一［2-4］。與其他抗結(jié)核藥物相比，環(huán)絲氨酸耐藥率較低，但近年來結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸耐藥增多。有研究者于1993—2007年對(duì)荷蘭131例MDR-TB患者進(jìn)行藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，僅1例患者對(duì)環(huán)絲氨酸耐藥，耐藥率為0.8%［5］；2005年俄羅斯結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸耐藥率為7.4%；1995—2011年中國香港結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸耐藥率為8.6%［6］。在結(jié)核病治療新藥匱乏情況下，2012年5月國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)我國“全球基金耐多藥結(jié)核病項(xiàng)目”開展地區(qū)使用環(huán)絲氨酸［7］。目前，結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸耐藥的具體機(jī)制尚未完全明確，本文綜述了結(jié)核分枝桿菌耐環(huán)絲氨酸相關(guān)基因，旨在為結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸的耐藥機(jī)制研究提供參考。

1 作用機(jī)制

環(huán)絲氨酸具有廣譜抗菌作用，對(duì)多數(shù)革蘭陰性菌及革蘭陽性菌均具有一定抑制作用，對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用并有利于防止結(jié)核分枝桿菌對(duì)丙硫異煙胺產(chǎn)生耐藥［8］。自1999 年以來，伊朗、土耳其、印度等國家采用含環(huán)絲氨酸抗結(jié)核化療方案治療MDR-TB并取得良好效果。伊朗學(xué)者曾報(bào)道，采用含環(huán)絲氨酸抗結(jié)核化療方案治療的MDR-TB患者可達(dá)到治愈效果［9］；土耳其學(xué)者曾報(bào)道，采用含環(huán)絲氨酸抗結(jié)核化療方案治療的MDR-TB患者治愈率為77%［10］；日本學(xué)者曾報(bào)道，采用含環(huán)絲氨酸、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等抗結(jié)核化療方案治療MDR-TB孕婦療效確切［11］；西班牙學(xué)者曾報(bào)道，采用環(huán)絲氨酸、左氧氟沙星治療的17例MDR-TB患者中12例達(dá)到治愈效果，且無復(fù)發(fā)或死亡患者［12］；印度學(xué)者曾報(bào)道，采用含環(huán)絲氨酸抗結(jié)核化療方案治療的39例MDRTB患者中29例治療6個(gè)月后痰菌轉(zhuǎn)陰并維持到治療結(jié)束［13］。

環(huán)絲氨酸抗結(jié)核分枝桿菌的血藥濃度參考范圍為1.5～30.0 mg/L［14］，其對(duì)體外H37Rv菌株的最低抑菌濃度（MIC）為 25.0 mg/L［15］，環(huán)絲氨酸劑量為250.0～500.0 mg/次時(shí)血藥峰濃度可維持在20.0～35.0 mg/L，不僅可發(fā)揮良好的抗結(jié)核分枝桿菌作用，還有利于減少不良反應(yīng)的發(fā)生，因此血藥峰濃度＜15.0 mg/L時(shí)需增加環(huán)絲氨酸劑量，血藥峰濃度＞40.0 mg/L需減少環(huán)絲氨酸劑量［16］。

結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁是一種網(wǎng)狀復(fù)雜結(jié)構(gòu)，主要由肽聚糖、霉菌酸、阿拉伯半乳聚糖等物質(zhì)通過共價(jià)鍵連接而成，D-丙氨酸是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中肽聚糖的重要成分［17］，丙氨酸消旋酶（Alr）是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁合成過程中必不可少的成分［5］，且Alr以磷酸毗哆醛（PLP）為輔酶催化L-丙氨酸和D-丙氨酸的轉(zhuǎn)化；此外，在丙氨酸合成代謝途徑中，丙氨酸連接酶催化二分子D-丙氨酸合成D-丙氨酸二聚體（ddl），因此丙氨酸連接酶在丙氨酸合成代謝中發(fā)揮著重要作用。環(huán)絲氨酸為D-丙氨酸結(jié)構(gòu)類似物，主要通過抑制丙氨酸合成代謝途徑中alr基因編碼的Alr、ddlA基因編碼的丙氨酸連接酶而減少肽聚糖的產(chǎn)生，繼而抑制結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁形成并減弱其耐酸能力，達(dá)到抗結(jié)核分枝桿菌的目的［18-19］。

2 耐藥機(jī)制

目前已知的結(jié)核分枝桿菌耐環(huán)絲氨酸基因包括ald基因（Rv2780）、alr基因（Rv3423C）、cycA基因（Rv1704C）、ddlA基因（Rv2981C，ddl）等。

2.1 ald基因 ald基因ID為888493，全長1 116 bp，編碼L-丙氨酸脫氫酶并參與丙氨酸代謝。研究發(fā)現(xiàn)，ald基因缺失的結(jié)核分枝桿菌無法將L-丙氨酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸并導(dǎo)致L-丙氨酸含量增加，而L-丙氨酸是環(huán)絲氨酸競爭性抑制物質(zhì)前體，L-丙氨酸含量增加可能會(huì)導(dǎo)致Alr、丙氨酸連接酶持續(xù)活動(dòng)而降低環(huán)絲氨酸的競爭性抑制作用，最終造成結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生大量肽聚糖并對(duì)環(huán)絲氨酸產(chǎn)生耐藥性［19-20］。藥敏試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，ald基因缺失與結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸耐藥有關(guān)，而補(bǔ)充ald基因后部分結(jié)核分枝桿菌會(huì)保存對(duì)環(huán)絲氨酸的敏感性［19-20］。

2.2 alr基因 alr基因ID為887634，全長1 227 bp，編碼Alr并參與丙氨酸代謝途徑中L-丙氨酸向D-丙氨酸的轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，alr基因啟動(dòng)子突變的結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸的耐藥性較高（MIC＞60 μg/ml）［19］；D-丙氨酸消旋酶（alrA）過度表達(dá)可導(dǎo)致牛型分枝桿菌卡介苗對(duì)環(huán)絲氨酸產(chǎn)生耐藥［21］，同時(shí)超量產(chǎn)生的突變體alrA啟動(dòng)子出現(xiàn)G-T置換可導(dǎo)致B-半乳糖苷酶基因表達(dá)［22］。DESIGARDINS等［23］研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的alrA基因突變的結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸的耐藥性增加。此外，還有研究證實(shí)結(jié)核分枝桿菌alrA非同義突變與環(huán)絲氨酸耐藥表型有關(guān)［24-25］，有學(xué)者在24株耐環(huán)絲氨酸結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)1株alrA同義突變，1株非同義突變，涉及的突變位點(diǎn)及氨基酸改變?yōu)?61位絲氨酸-天冬酰胺，而對(duì)環(huán)絲氨酸敏感的結(jié)核分枝桿菌337位發(fā)生GGT-GGC，為甘氨酸同義突變［26］（見表1）。

2.3 cycA基因 cycA基因ID為888812，全長1 671 bp，編碼D-絲氨酸、D-丙氨酸等運(yùn)載通透蛋白并參與環(huán)絲氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收［27］。BAISA等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在甘油培養(yǎng)基和微量葡萄糖中大腸埃希菌cycA基因突變株CFT073和K-12對(duì)環(huán)絲氨酸的耐藥性增加。目前研究已證實(shí)耐環(huán)絲氨酸大腸埃希菌變異株存在cycA基因單一位點(diǎn)突變［29］，早期曾有文獻(xiàn)報(bào)道cycA基因點(diǎn)突變可導(dǎo)致大腸埃希菌對(duì)環(huán)絲氨酸的耐藥性增加［30-31］，而在牛型分枝桿菌卡介苗中發(fā)現(xiàn)cycA基因非同義突變（Gly122Ser）可以解釋部分環(huán)絲氨酸固有耐藥現(xiàn)象［27］；FéHERT等［29］對(duì)20株耐環(huán)絲氨酸大腸埃希菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其cycA基因突變位點(diǎn)均不相同。此外，還有研究在24株耐環(huán)絲氨酸結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)3株cycA基因同義突變，3株cycA基因非同義突變，其中非同義突變包括第188位CCTGCT〔（脯氨酸-丙氨酸〕、第318位CGA-CTA〔精氨酸-亮氨酸〕及第508位GCA-TCA（丙氨酸-絲氨酸），但并未發(fā)現(xiàn)突變熱點(diǎn)區(qū)域；在對(duì)環(huán)絲氨酸敏感的結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)cycA基因第406位TCG-TCA（絲氨酸）及第521位CGTCGC（精氨酸），均為同義突變［26］（見表1）。

2.4 ddlA基因 ddlA基因ID為888415，全長1 122 bp，編碼丙氨酸連接酶并催化二分子D-丙氨酸合成ddl、參與丙氨酸代謝。20世紀(jì)70年代，有學(xué)者對(duì)耐環(huán)絲氨酸結(jié)核分枝桿菌突變體進(jìn)行分離發(fā)現(xiàn)，ddlA基因?qū)Νh(huán)絲氨酸的抗結(jié)核分枝桿菌作用影響極小，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)ddlA基因、alr基因同時(shí)過度表達(dá)可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸的耐藥性增加［32］。有研究在24株耐環(huán)絲氨酸結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)1株ddlA基因同義突變，為第92位CGT-CGC突變（精氨酸）（見表1）［26］。

表1 已知的環(huán)絲氨酸耐藥基因突變類型、氨基酸改變及MICTable 1 Known drug resistance related gene mutation types to cycloserine，changes of amino acids and the MIC

3 小結(jié)與展望

綜上所述，環(huán)絲氨酸作為二線核心抗結(jié)核口服藥物，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制，治療耐藥結(jié)核病的前景廣闊，但其耐藥現(xiàn)象不容忽視，應(yīng)深入研究其耐藥機(jī)制以減少耐藥的發(fā)生。近年來隨著對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制的研究深入，發(fā)現(xiàn)恥垢分枝桿菌中Alr及丙氨酸連接酶過表達(dá)會(huì)產(chǎn)生對(duì)環(huán)絲氨酸的耐藥性，且Alr對(duì)環(huán)絲氨酸耐藥性的影響程度較丙氨酸連接酶高［33］，而alr基因、ddlA基因突變與結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸耐藥有關(guān)［21，34-35］；此外，卡介苗絲氨酸運(yùn)載體突變也可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸產(chǎn)生耐藥性［27，33］。

目前，基因突變可以解釋部分結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸耐藥，其中ald基因、alr基因、cycA基因、ddlA基因突變導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸耐藥已達(dá)成一定共識(shí)，但各研究中所涉及的突變位點(diǎn)均不相同，因此還可能存在其他突變位點(diǎn)、耐藥靶酶等，因此，結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸耐藥的具體機(jī)制等仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。