華法林的基因多態(tài)性研究和臨床應用進展Δ

王威麗，宋滄桑，張 陽，宋文彬，毛盼盼

(1.昆明市第一人民醫(yī)院藥學部，云南 昆明 650000; 2.大理大學藥學院，云南 大理 671000)

華法林是香豆素類抗凝血藥的主要代表藥品[1]。因具有充足的循證醫(yī)學證據(jù)、確切的治療效果以及低廉的價格，華法林已被廣泛應用于臨床抗凝治療中。前期的研究結果表明，華法林不但能有效地降低心房顫動患者腦卒中發(fā)生率，而且使心肌梗死所導致的死亡風險降低約24%[2]。然而，由于華法林狹窄的治療范圍、較高的出血風險以及藥物反應的個體差異，至今該藥的使用仍然困擾著許多臨床醫(yī)師。近年來，隨著醫(yī)學的不斷進步以及藥物基因組學的日益完善，基礎醫(yī)學對于藥物代謝的探索一步步走向精準化，越來越多的藥物代謝機制可通過基因組學進行解釋。臨床研究結果已證實，華法林相關蛋白多態(tài)性與其個體間維持劑量的差異、療效以及不良反應關系密切。采用藥物基因組學來解釋華法林抗凝作用的有效性及安全性是目前臨床研究的新興領域[3]。因此，本文詳細地綜述了華法林相關基因多態(tài)性以及臨床應用等方面，為今后華法林的個體化抗凝治療提供理論基礎。

1 華法林的作用機制與藥動學

血栓的形成是一種漸進的過程，需多種凝血因子的共同參與。體內含谷氨酸殘基的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白C、S、Z均需通過γ-谷氨?；然?gamma glutamyl carboxylase，GGCX)進行γ-羧化，使得無活性的凝血因子被激活[4]。氫醌型維生素K(reduced vitamine K,VitKH2)是GGCX必不可少的輔助因子。在羧化的過程中，VitKH2可被氧化成環(huán)氧型維生素K(oxidized vitamine K，VitKO)，但在維生素K環(huán)氧化物還原酶復合物(vitamin K epoxide reductase complex，VKORC)以及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的催化作用下，VitKO又可被還原為VitKH2[5]?？鼓幦A法林可競爭性地與VKORC結合，阻礙VitKO的還原，使得凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白C、S、Z只能在沒有活性的前體階段停留，從而發(fā)揮其較強的抗凝活性，見圖1[6]。但是，這一過程并不能影響已經(jīng)活化的凝血因子，所以華法林并不具有體外抗凝作用[7]。

圖1 華法林的作用機制Fig 1 Mechanism of Warfarin

華法林是一種消旋體混合物，由R-華法林和S-華法林2種光學同分異構體構成，S-華法林的藥理活性強于R-華法林(約3～5倍)，其中85%以上的S-華法林主要經(jīng)CYP2C9代謝[8]。據(jù)報道，華法林的生物利用度較高，口服給藥后24 h可在血漿中被檢測出來，72～96 h達到血藥濃度的峰值。其在血液循環(huán)的過程中與血漿蛋白結合率高達98%～99%[9]。該藥的消除半衰期(t1/2β)為44～60 h，因此，口服3 d后其抗凝療效才能發(fā)揮至最佳[10]。但值得注意的是，患者服用華法林后，凝血因子Ⅶ由于半衰期較短在體內消除很快，因此，早期(24～48 h)測定的國際標準化比值(international normalized ratio，INR)并不能真實地反應患者的抗栓情況，而是反應體內凝血因子Ⅶ含量的主要表達[11]。另外，Schindler等[12]經(jīng)研究也發(fā)現(xiàn)，華法林可通過胎盤屏障，胎兒血漿中的華法林濃度與母體較為接近，但從母乳中并沒有發(fā)現(xiàn)活性華法林的存在。因此，妊娠期婦女禁止服用華法林，但哺乳期婦女服用該藥則相對安全。

2 華法林的基因多態(tài)性

2.1 CYP2C9基因多態(tài)性

CYP2C9是華法林在肝代謝中最重要的酶之一，編碼該酶的CYP2C9基因具有高度的多態(tài)性，其多態(tài)性主要取決于編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)[13]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了58種可改變代謝酶結構、影響代謝酶活性，最終導致華法林代謝能力發(fā)生改變的SNP，分別以CYP2C9*1—CYP2C9*58進行命名，其中研究最廣泛的2種等位基因是CYP2C9*2和CYP2C9*3[14]。據(jù)報道，若上述2種等位基因發(fā)生突變，則會增加整個治療過程中的出血風險，特別是剛開始使用華法林治療時的前3～6個月，其出血風險約為野生型的1.18倍，若長期使用華法林治療，患者的出血風險還會持續(xù)增加[15]。越來越多的證明強調，CYP2C9*1是最常見的野生型等位基因，酶代謝活性正常；攜帶突變型CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因患者的酶活性明顯低于攜帶CYP2C9*1的個體，即與正常代謝者相比，攜帶突變型等位基因的人群對華法林更加敏感，過度抗凝和出血的風險更高，達到同等抗凝水平時所需華法林的劑量更低[16-17]。CYP2C9*2等位基因在亞洲人群中幾乎很少出現(xiàn)，但在高加索人群中，其突變的頻率較高，可達12%；亞洲人群主要發(fā)現(xiàn)的是CYP2C9*3突變體，突變頻率約為1%～4%[18]。

2.2 VKORC1基因多態(tài)性

1974年首次發(fā)現(xiàn)的維生素K環(huán)氧化物還原酶(vitamin K epoxide reductase，VKOR)，是維生素K代謝循環(huán)中的限速酶，也是華法林發(fā)揮抗凝作用的靶點酶，該酶的活性將直接影響華法林的抗栓水平[19]。2004年，VKOR編碼的基因VKORC1被進一步證實，該基因上存在多個SNP位點，包括VKORCl-1639(G>A)、VKORCl-1173(C>T)和VKORCl-3730(G>A)等，其中VKORCl-1639(G>A)是影響華法林劑量的核心位點[20]。研究結果發(fā)現(xiàn)，攜帶GG、GA基因型的患者所需華法林的維持劑量分別是攜帶AA基因型患者的1.7、2.4倍[21]。也就是說，與攜帶突變純合基因型(AA)的患者相比，VKORC1-1639 GA和GG型攜帶者INR達標時間相對要長，且INR達到目標范圍時所需華法林的總量也較高。由此說明，患者所需華法林的維持劑量與其攜帶G等位基因成正相關[22]。且該等位基因在不同種族間分布頻率有所不同，亞洲人群的突變頻率比較高，VKORCl-1639 AA、GA和GG基因型頻率分別為80.4%、18.3%和1.3%，而VKORCl-1639 AA(16.3%)、GA(48.9%)、GG(36.7%)基因型在高加索人群中也很常見[23]。

2.3 CYP4F2基因多態(tài)性

CYP4F2是一種維生素K環(huán)氧化物酶，參與維生素K的肝臟代謝，是影響華法林藥效學的另一種重要遺傳因素[24]。有研究報道，CYP4F2通過羥基化維生素K的苯基基團，使還原型維生素K生成減少，從而抑制凝血因子(Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ)的合成，發(fā)揮抗凝作用[25]。若CYP4F2基因位點19p13.12發(fā)生突變，將會削弱體內維生素K氧化酶活性，導致還原型維生素K濃度相對增加，進而影響患者對華法林劑量的需求[26]。一項回顧性研究結果表明，攜帶CC基因型的患者每日處方中華法林劑量顯著低于攜帶CT/TT基因型的患者(TT型>CT型>CC型)[27]。也就是說，攜帶CYP4F2突變基因的人群需增加華法林的使用劑量才能達到相同的抗凝效果。隨后，熊筱偉等[28]進一步研究發(fā)現(xiàn)，在初始采用華法林治療的7 d內，與攜帶CT/TT基因型的患者相比，CYP4F2 CC基因型攜帶者所需華法林的維持劑量更低，進入INR目標范圍所需時間更短，且受到其他因素的影響更小?？偠灾?，攜帶CC基因型的患者對華法林的抗栓治療具有較高的敏感性。

2.4 GGCX基因多態(tài)性

GGCX為維生素K依賴性羧化酶，常表達在粗面內質網(wǎng)及高爾基體上，通過羧化維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ上的γ-谷氨酸殘基，促進功能性凝血因子的激活，從而產(chǎn)生凝血作用。臨床研究結果表明，華法林可直接抑制還原型維生素K的再生，阻止凝血因子的生物合成，進而發(fā)揮抗凝療效[29]。迄今為止，已知的SNP位點中，GGCX rs12714145(3261G>A)、rs11676382(12970C>G)和rs69964(974G>A)可能與華法林的穩(wěn)定劑量相關[30]。黃盛文等[31]的研究結果發(fā)現(xiàn)，攜帶GGCX(rs12714145)GG基因型的群體所需華法林劑量顯著低于AA基因型的攜帶者。但在另一項研究中，其結果卻與之相反[32]。此外，仍有報道表明，與攜帶CC基因型的患者相比，具有GGCX(rs11676382)G等位基因(GG/GC)的患者所需華法林的日處方量更低；同時，GGCX基因rs12714145和rs69964 2個多態(tài)性位點可能并不是影響華法林維持劑量的重要性決定因素[33]?？偠灾?，目前GGCX基因多態(tài)性的作用對我國人群的影響尚缺乏統(tǒng)一的觀點。這可能是由于缺乏重視度，研究較少所造成的，需精心設計大規(guī)模的前瞻性臨床試驗，進一步證實其中的關聯(lián)。

2.5 載脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)基因多態(tài)性

APOE是血漿脂蛋白的重要組成部分，可將在小腸內吸收的維生素K轉運至肝臟中再經(jīng)受體介導內吞作用進行清除。位于19號染色體上的APOE存在著E2、E3、E4 3種常見的等位基因，分別由E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4和E4/E4 6種表型構成。其中，亞洲人群的APOE基因型多為E3/E3(野生型)[34]。研究結果表明，攜帶E4等位基因患者的脂蛋白在肝臟中的吸收速度相對較快，繼而促進了維生素K對凝血因子的羧化反應，需適當提高華法林的維持劑量才能更好發(fā)揮其抗栓水平。但與VKORC1和CYP2C9基因相比，APOE基因多態(tài)性對華法林劑量的影響相對較小[35]。李佳佳等[36]也在后續(xù)的研究中進一步證實了這一觀點。由此可見，該基因多態(tài)性并非影響華法林藥效學的主要原因。

2.6 其他基因多態(tài)性

近年來，內質網(wǎng)伴侶蛋白基因(calumenin gene，CALU)以及環(huán)氧化物水解酶1基因(epoxide hydrolase 1，EPHXl)對華法林藥效學的影響同樣受到了科學家的廣泛關注。藥物遺傳學研究結果表明，CALU在維生素K循環(huán)途徑中對VKOR1和GGCX具有抑制作用，進而影響了華法林的抗栓效果。在眾多的SNP位點中，CALU rs339097(C>T)、CALU rs2307040(G>A)和CALU rs2290228(C>T)與華法林的治療劑量間存在顯著的相關性。若CALU基因發(fā)生突變，將會降低抑制GGCX活性的能力，導致患者對華法林劑量的需求發(fā)生改變[37]。但另一項研究結果發(fā)現(xiàn)，EPHXl可能是VKORC1的亞單位，在VitKO向VitKH2的轉化過程中發(fā)揮著至關重要的作用[38]。綜上所述，CALU與EPHXl基因多態(tài)性在華法林的臨床實踐中存在一定的指導意義。

3 華法林基因多態(tài)性的臨床應用

過去的20年，藥物基因組學在遺傳領域取得了飛躍的進步。大量研究結果已經(jīng)證實，華法林相關基因多態(tài)性是影響其治療劑量的主要因素之一。2007年8月，美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)修改了華法林的藥品說明書，添加了藥物遺傳學信息，以反映CYP2C9/VKORC1基因多態(tài)性對劑量要求的潛在影響，推薦攜帶CYP2C9*2/*3或VKORC1-1639 G>A等位基因的患者可采用較低的起始劑量。然而，上述更新并沒有提供任何具體的遺傳學相關的推薦劑量，引起了許多醫(yī)師的熱議與爭論。因此，2010年1月FDA進一步修訂了標簽，添加了根據(jù)基因分型選擇華法林初始劑量的簡明劑量推薦表(見表1)，也再次強調了基因多態(tài)性對于華法林劑量影響的重要性[39]。

表1 FDA建議的基因多態(tài)性與華法林初始劑量對照表(mg/d)Tab 1 Comparison of FDA-recommended gene polymorphism with initial dose of Warfarin(mg/d)

目前，國內外對于華法林穩(wěn)定劑量預測模型的研究較多，比較經(jīng)典的有國際華法林遺傳藥理學協(xié)會(international warfarin pharmacogenetics consortium，IWPC)構建的適用于美國人群和歐洲人群的模型[40]以及Huang等[41]構建的適用于我國人群的模型。IWPC提出的華法林預測模型研究，共納入了來自四大洲多個種族的4 043例患者，是迄今為止有關華法林預測模型樣本量最大的研究。但由于國內外人種、體質、地區(qū)等均存在較大差異，故能否適合于我國人群尚不可知。為此，國內許多學者進行了探索。劉俊等[42]對比分析了IWPC預測模型，認為IWPC對我國漢族人群華法林穩(wěn)定劑量的預測效果有限。隨后，Huang等[41]提出了適合我國人群的預測模型，表明該模型可準確預測出>60%的漢族患者華法林穩(wěn)定劑量。近期，又有學者對比了IWPC[40]和Huang等[41]幾種預測模型，發(fā)現(xiàn)IWPC預測模型對我國患者人群有較好的預測作用，對提高華法林抗凝治療的安全性和有效性具有潛在的臨床意義[43]?？傊侥壳盀橹?，我國對于華法林穩(wěn)定劑量的預測模型尚缺乏統(tǒng)一觀點，因此，期待未來國內學者可以提出最適合我國人群的華法林預測模型，為患者帶來福音。

4 展望

使用藥物基因組學來優(yōu)化抗凝治療的有效性及安全性越來越引起人們的關注。將臨床信息與藥物遺傳學結合到抗凝治療過程中成為了目前研究的新方向。華法林相關基因檢測可縮短達到穩(wěn)定INR范圍所需的時間，避免出血或腦卒中復發(fā)等不良事件的發(fā)生，為臨床實踐提供進一步合理化用藥參考。盡管目前是否推行華法林基因檢測以指導給藥還存在爭議，但隨著抗栓治療不斷朝著個體化醫(yī)學的方向發(fā)展，華法林基因檢測必然會成為未來臨床上的治療趨勢。相信不久的將來，真正量身定制式抗凝治療方案會得以實現(xiàn)，在臨床實踐中更安全、有效地發(fā)揮其療效。