柳州地區(qū)新生兒B族鏈球菌對抗菌藥物的耐藥性、血清型與分子遺傳背景特征分析Δ

傅錦堅，陳繼昌，肖 萍

(1.柳州市婦幼保健院檢驗科，廣西 柳州 545001； 2.柳州市婦幼保健院新生兒科，廣西 柳州 545001; 3.柳州市婦幼保健院藥學部， 廣西 柳州 545001)

B族鏈球菌(Group BStreptococcus，GBS)是引起新生兒敗血癥和腦膜炎的主要病原體[1-3]。據估計，10%～30%的妊娠期婦女直腸陰道定植有GBS，而母體攜帶GBS是新生兒感染的主要來源[4]。在沒有任何干預的情況下，GBS定植的母親娩出的新生兒中有1%～2%可有嚴重性的感染，如敗血癥或腦膜炎等[4]。新生兒GBS疾病是分娩期間由母親-新生兒的垂直傳播或由醫(yī)護人員的水平傳播引起的[5]。在0～6日齡新生兒中發(fā)生的感染被稱為早發(fā)型，在7～90日齡新生兒中發(fā)生的感染被稱為晚發(fā)型；膿毒癥和肺炎常見于早發(fā)型，而腦膜炎和菌血癥在晚發(fā)型中更常見[6]。研究者已開發(fā)多種技術去更好地理解GBS的種群結構，其中多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是標準的分型方法[7-8]。循證醫(yī)學證據顯示，分離自不同國家不同人群的GBS菌株的MLST結果表明，只有少數(shù)的克隆復合體(clonal complex，CC)，包括CC1、CC10、CC17、CC19和CC23與GBS的定植或侵襲性感染有關[9]。在上述CC中，CC17是一種高毒力克隆，主要與新生兒的侵襲性疾病有關；CC19可引起新生兒或成人的侵襲性疾病[10]。最近的研究結果表明，母體或新生兒定植的菌株中，CC1、CC19和CC23的分離比例非常高[10]。研究結果表明，CC17是莢膜型別(CT)Ⅲ的同質克隆復合體，不同的CC表達的莢膜型別不一致[8-10]。多糖莢膜是GBS最重要的毒力因子，基于表面多糖結構的差異，研究者已將其分為10種CT(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ—Ⅸ)，被稱為10種血清型[8-10]。由于西部地區(qū)研究新生兒GBS定植的調查報道較少，因此，本研究旨在分析柳州地區(qū)新生兒定植的GBS菌株對抗菌藥物的敏感性、血清分型和分子特征。

1 資料與方法

1.1 研究人群和樣本收集

本研究對日常監(jiān)測樣本進行采樣。凡是2015年1月至2020年4月在柳州市婦幼保健院出生的新生兒，在母親采集樣本進行GBS分析的情況下，對娩出的新生兒出生后立即用無菌取樣器涂抹耳朵、口腔和臍帶后放置運送培養(yǎng)基送檢。上述樣本監(jiān)測和采集的過程，獲得柳州市婦幼保健院倫理委員會的批準(批件號為20170010)。

1.2 GBS的分離鑒定

取出采樣拭子，將其接種于GBS鑒定顯色平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)中，5%CO2、37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，挑選粉色、紫色、紅色等可疑陽性菌落進行革蘭染色、形態(tài)學和過氧化氫酶等鑒定，再進行CAMP試驗，觀察溶血模式，確定分離株為GBS。

1.3 藥物敏感試驗和耐藥基因檢測

使用K-B紙片擴散法進行藥物敏感試驗，折點和抗菌藥物紙片的選擇基于美國臨床與實驗室標準化委員會提出的標準執(zhí)行。對以下抗菌藥物進行藥物敏感試驗，包括青霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、克林霉素、紅霉素、氯霉素、利奈唑胺和萬古霉素。多重耐藥的判定標準為菌株對≥3種不同型別的抗菌藥物產生耐藥。此外，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)方法用于檢測四環(huán)素耐藥基因(tetM、tetO、tetL、tetK、tetT和tetS)、大環(huán)內酯類耐藥基因(ermA、ermB、ermTR和mefA/E)和林可酰胺類耐藥基因(linB)[11]。

1.4 GBS的分子特征分析

采用MLST方法對GBS的7個管家基因進行測序后，將測序結果通過MLST的數(shù)據庫(http://eburst.mlst.net)查詢得出序列分型(sequence type，ST)和等位基因。使用網站自帶程序eBURST確定特定ST的CC，單ST指未能聚集成CC的ST。使用PCR方法對GBS攜帶的10種血清型別進行鑒定，并對GBS的毒力基因，如黏附相關基因(scpB)、入侵相關基因(hlyB)和alp表面定位蛋白抗原基因(alphaC、rib、epsilon、alp2/3和alp4)進行分型分析，所有的鑒定參照相關文獻[11]中方法進行處理。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 新生兒GBS定植的臨床特征

新生兒平均住院時間為(7.18±11.89)d。共檢出50株GBS，其中，男性新生兒檢出28株(占56.0%)；初產分娩新生兒檢出26株(占52.0%)；順產新生兒檢出19株(占18.0%)；發(fā)生肺炎、窒息的新生兒分別檢出16、4株(分別占32.0%、8.0%)，見表1。

表1 新生兒GBS定植的臨床特征Tab 1 Clinical characteristics of neonatal GBS colonization

2.2 新生兒GBS菌株的血清型與耐藥、毒力基因之間的關系

50例GBS菌株中，80.0%的菌株呈現(xiàn)多重耐藥性；所有GBS菌株均對青霉素、頭孢曲松、利奈唑胺和萬古霉素敏感，均對紅霉素和克林霉素耐藥；60.0%的菌株同時攜帶紅霉素和四環(huán)素的耐藥基因，主要的耐藥基因為ermA和tetM；GBS菌株的血清型主要為Ⅰa型(21株，占42.0%)、Ⅲ型(21株，占42.0%)和Ⅰb型(8株，占16.0%)；所有的菌株均攜帶毒力基因scpB和hlyB。不同血清型攜帶的基因不一致，例如，血清型Ⅰa型菌株中，攜帶耐藥基因tetT的菌株數(shù)所占比例最高(8株，占38.1%)(P=0.005)；血清型Ⅲ型菌株中，攜帶alp表面定位蛋白抗原基因rib的菌株數(shù)所占比例最高(14株，占66.7%)(P<0.001)；血清型Ⅰa型菌株中攜帶alphaC的菌株數(shù)所占比例遠高于血清型Ⅰb型和Ⅲ型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。新生兒GBS菌株的血清型與耐藥、毒力基因之間的關系見表2。

2.3 新生兒GBS菌株克隆型、血清型和耐藥基因、毒力基因的特征

50株GBS菌株中，最常見的基因序列類型為ST12型(15株，占30.0%)、ST19型(10株，占20.0%)、ST17型(9株，占18.0%)和ST23型(5株，占10.0%)。ST17型和ST19型主要與血清型Ⅲ型有關，對四環(huán)素、紅霉素和克林霉素耐藥，攜帶有耐藥基因tetM和ermA，毒力基因rib；ST12型和ST23型主要與血清型Ⅰa型有關，攜帶有耐藥基因tetM和ermA，毒力基因alphaC和epsilon。新生兒GBS菌株克隆型、血清型和耐藥基因、毒力基因的特征見表3。

表2 新生兒GBS菌株的血清型與耐藥、毒力基因之間的關系Tab 2 Correlation between drug resistance, virulence gene and serotypes of neonatal GBS strains

3 討論

青霉素是推薦用于預防和治療GBS疾病的一線藥物。本研究中，所有GBS分離株均對青霉素敏感，這表明青霉素仍是預防用藥的首選，與最新的薈萃分析結果相似[12]。指南推薦，若對青霉素過敏，建議使用紅霉素和克林霉素作為替代藥物。但本研究結果顯示，所有的50株GBS菌株均對紅霉素和克林霉素耐藥,與以往的研究結果相似[13]。此外，最新的薈萃分析結果亦表明，亞洲國家分離的GBS菌株對紅霉素和克林霉素的耐藥率高于非亞洲國家[12]。上述研究結果表明，使用抗菌藥物對新生兒進行預防性用藥時，需要在藥物敏感試驗結果的指導下進行，尤其是對于青霉素過敏的新生兒。本研究中，80.0%的GBS菌株呈現(xiàn)多重耐藥性，主要對紅霉素、克林霉素和四環(huán)素耐藥。與本研究結果類似的一篇來自中國新生兒侵襲性GBS菌株研究結果顯示，79.9%的菌株呈現(xiàn)多重耐藥性，主要對紅霉素、克林霉素和四環(huán)素耐藥[14]。上述結果凸顯了臨床實驗室持續(xù)監(jiān)測GBS菌株對抗菌藥物耐藥性的重要性。

表3 新生兒GBS菌株克隆型、血清型和耐藥基因、毒力基因的特征Tab 3 Characteristics of clonotype, serotype, drug resistance gene and virulence gene of neonatal GBS isolates

較少有研究報道GBS菌株的耐藥機制。erm基因是主要的大環(huán)內酯類耐藥基因，通過甲基化修飾核糖體并抑制紅霉素結合，達到對紅霉素耐藥的目的，而mef基因編碼充當藥物外排泵的膜蛋白，將抗菌藥物往外排。本研究中，8株GBS菌株同時攜帶ermB、ermA和(或)mefA/E，表明GBS對紅霉素的耐藥性主要通過上述2種機制介導。鏈球菌中四環(huán)素的耐藥性主要是由tetM、tetO或tetT基因編碼的核糖體保護蛋白介導的，由tetK或tetL基因編碼介導的外排機制相對罕見[15]。本研究結果與之類似，有70.0%的菌株至少攜帶1種上述耐藥基因。最為重要的是，60.0%的菌株同時攜帶紅霉素和四環(huán)素耐藥基因，主要的耐藥基因為ermA和tetM。上述耐藥基因的存在可能是耐藥基因水平轉移的結果，未來的研究必須更多地關注GBS菌株對抗菌藥物耐藥的遺傳機制。

已有研究報道，可通過研究開發(fā)針對GBS血清型的疫苗對GBS疾病進行預防。疫苗的研發(fā)取決于人群監(jiān)測中GBS血清型分布的準確數(shù)據。本項針對新生兒群體的研究數(shù)據顯示，42.0%的血清型集中在Ⅰa型，另外42.0%的血清型集中在Ⅲ型，16.0%血清型為Ⅰb型，與廣州市新生兒GBS菌株的分子特征相似[16]。目前正在進行的臨床試驗為三價(Ⅰa型、Ⅰb型和Ⅲ型)GBS疫苗[11]，在不久的將來，按照現(xiàn)在的監(jiān)測數(shù)據，若能在我國投放使用，將能很好地覆蓋新生兒人群。但也有研究結果顯示，在不同的國家，流行的主要血清型別不一致，如在韓國主要流行的血清型為Ⅲ型和Ⅴ型[17]。上述研究結果顯示，不同的國家，由于地理位置、種族、人群不一致，GBS的血清型分布亦存在時間、空間和人群的差異性[18-21]。未來仍需繼續(xù)對妊娠期、圍產期婦女和新生兒定植和感染的GBS菌株進行持續(xù)性監(jiān)測，以方便獲取GBS的遺傳背景和血清學信息，用于下一步疫苗的研制。

本研究從50株GBS定植菌株中分離鑒定出11種ST，其中最常見的ST為ST12、ST19、ST17和ST23，占全部菌株的78.0%。本研究共鑒定出6種CC，分別為CC10、CC12、CC17、CC19、CC23和CC103，其也是全球最常見的CC。已有研究結果認為，ST19/Ⅲ與定植有關，而ST17/Ⅲ主要與侵襲性感染有關[11]。在致病菌株中，最常見的CC是CC17，其對應的血清型為Ⅲ型。據報道，由于其高致病性和毒力，CC17最常引起新生兒腦膜炎，尤其是免疫系統(tǒng)尚未成熟的嬰幼兒。在新生兒侵襲性感染的發(fā)生和發(fā)展過程中，CC17菌株通過特殊的毒力機制增強了GBS的致病性和侵襲性，這是>80%的患兒發(fā)生腦膜炎的主要原因[10]。CC17定植是新生兒GBS感染的主要危險因素[16]。荷蘭的一項研究結果發(fā)現(xiàn)，1987—2011年，GBS感染發(fā)生率升高的主要原因是CC17的流行率升高[22]。本研究中發(fā)現(xiàn)9株ST17菌株，屬于定植菌株而非感染菌株。CC17和CC19是GBS血清型Ⅲ型最常見的重要基因譜系，因此，Ⅲ型可能是導致嬰兒GBS定植的最常見血清型。此前的研究結果顯示，盡管進行了產前抗菌藥物預防性用藥，血清型Ⅲ型的ST17和ST19克隆在產后8周仍可檢測出來[23]，可以部分解釋為何產前進行了抗菌藥物預防性用藥，仍有部分菌株可引起新生兒的侵襲性感染。

此外，本研究結果顯示，在GBS菌株中存在著特定的血清型-遺傳背景-毒力基因-耐藥基因的組合，如ST17-Ⅲ型-ermA-rib，ST19-Ⅲ型-linB-tetM-rib-epsilon和ST12-Ⅰa型/Ⅰb型-ermA-linB-alphaC等。值得注意的是，本研究中發(fā)現(xiàn)，GBS毒力基因rib和alphaC存在于特定的克隆和血清型菌株中，如alphaC僅存在于ST12菌株中，而所有ST12菌株的血清型均為Ⅰ型(Ⅰa型和Ⅰb型)。rib僅存在CC17和CC19中，這2個克隆均屬于血清型Ⅲ型。上述研究結果提示，在調查GBS的分子特征時，需要綜合考慮GBS的特定蛋白，以便發(fā)現(xiàn)新的流行病學趨勢，并在以后的疫苗研發(fā)中加以考慮和應用。

綜上所述，本研究運用多種方法鑒定了新生兒定植性GBS菌株的耐藥表型、耐藥基因型、血清型、毒力基因和遺傳背景分析，并發(fā)現(xiàn)GBS的遺傳背景具有一定的特異性，凸顯了在以后的研究中仍需對日常監(jiān)測發(fā)現(xiàn)的GBS菌株加以鑒定分析，以期發(fā)現(xiàn)新的流行病學趨勢，并在日后研發(fā)多價GBS疫苗中加以考慮和應用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，從新生兒群體中分離的GBS菌株呈現(xiàn)多重耐藥性，凸顯了日后持續(xù)監(jiān)測GBS耐藥性的重要性。