白藜蘆醇對慢性青光眼大鼠視神經(jīng)保護作用及對Bcl-2、Bax和Caspase-9表達的影響Δ

齊國武，侯靜梅，岳以英，張 琳，王海燕

(1.蘭州普瑞眼科醫(yī)院屈光手術(shù)科，甘肅 蘭州 730030； 2.蘭州普瑞眼科醫(yī)院視光科，甘肅 蘭州 730030； 3.天津市眼科醫(yī)院屈光手術(shù)科，天津 300020； 4.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院眼科，甘肅 蘭州 730030)

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，是許多植物受到刺激時產(chǎn)生的抗毒素[1]。研究結(jié)果表明，白藜蘆醇有抗氧化、抗炎、抗惡性腫瘤及心血管保護等作用。且白藜蘆醇對神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有神經(jīng)保護作用，包括帕金森病、阿爾茨海默病、神經(jīng)損傷和結(jié)節(jié)性硬化癥[2]。但是，白藜蘆醇介導(dǎo)的神經(jīng)保護的潛在機制仍不十分清楚，白藜蘆醇在青光眼中的作用也不清楚。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)和B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)家族在細胞凋亡的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[3]。Caspase-9被認為是細胞凋亡的主要執(zhí)行Caspase[4-5]。其是線粒體依賴性細胞凋亡途徑中的關(guān)鍵酶。因此，Caspase-9活性是凋亡的主要和可靠的決定因素，Bcl-2也是重要的凋亡抑制因子。本研究擬探討白藜蘆醇對慢性青光眼大鼠視神經(jīng)保護作用及對Bcl-2、Bax和Caspase-9表達的影響，為慢性青光眼的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

白藜蘆醇(美國Sigma公司，批號S80469)；FITC綴合的膜聯(lián)蛋白V細胞凋亡檢測試劑盒、放射免疫沉淀分析緩沖液、雙辛可寧酸試劑盒(BCA)及化學(xué)熒光試劑(碧云天生物技術(shù)研究所，批號D7 133 M、ST1377、ST1425及SC1004-8)；漢密爾頓注射器(瑞士Hamilton公司，批號HK-5523)；甲苯噻嗪、原位交聯(lián)水凝膠(HCCS)、鹽酸左氧氟沙星及多聚甲醛(美國Sigma-Aldrich公司，批號P0503、P6601、K0052及K5641)；鹽酸利多卡因(美國Bausch&Lomb公司，批號L5007)；0.1%Triton X-100溶液、DAPI染色液及Trizol試劑(美國賽默飛世爾科技公司，批號RK20166、RK33157及M6652)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Power SYBR Green試劑盒(寶生物工程大連有限公司，批號B-3044F、B-5062F)；聚偏二氟乙烯膜(美國Bio-Rad公司，批號FFP19)；兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體、兔抗Caspase-9多克隆抗體及兔抗β-肌動蛋白多克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司，批號Sc-67154、Sc-50231、Sc-50245及Sc-70124)；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(美國Abcam公司，批號ab602589)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)；Zeiss Imager M1激光掃描顯微鏡(卡爾·蔡司光學(xué)中國有限公司)；DM6M LIBS光學(xué)顯微鏡(德國徠卡公司)；ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Mini-Protean 3電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad，Hercules，CA)；數(shù)字圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus 6.0版，美國Media Cybernetics公司)；ImageQuant4000 mini型GE超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀(美國通用電氣公司)。

1.2 實驗動物及分組

清潔級SD(Sprague Dawley)大鼠100只，6～8周齡，體重180～210 g，雌雄各半，由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(陜)2019-0001，動物使用許可證號為SYXK(陜)2019-0012，動物質(zhì)量合格證號為NO.00053217。所有動物實驗程序均符合美國國立衛(wèi)生研究院實驗室護理和使用指南。在實驗過程中，大鼠自由進食，并在約23 ℃和60%濕度的空調(diào)室內(nèi)保持12 h的明暗循環(huán)。按照隨機數(shù)字表法分為五組：對照組、模型組、白藜蘆醇低劑量組(20 mg/kg)、白藜蘆醇中劑量組(40 mg/kg)及白藜蘆醇高劑量組(80 mg/kg)[6]，每組20只。

1.3 動物模型建立及給藥方法

模型組、白藜蘆醇低、中及高劑量組通過腹腔注射甲苯噻嗪10 mg/kg麻醉大鼠，眼部的局部麻醉通過滴加0.5%的鹽酸利多卡因進行。為了在大鼠的雙眼中誘發(fā)慢性青光眼，將預(yù)先混合的HCCS注入前房。HCCS由硫醇改性的羧甲基透明質(zhì)酸(HyStem)和硫醇反應(yīng)性聚乙二醇二丙烯酸酯(Extralink)組成，在注射前立即以4∶1的比例混合。從角膜周圍區(qū)域向中央向角膜進行前房穿刺，以用31號針頭形成足夠長的隧道切口，然后立即用漢密爾頓注射器通過切口將新鮮混合的HCCS 7 μl注入前房。對照組進行假手術(shù)，與誘導(dǎo)慢性青光眼的手術(shù)類似，只是注射等體積的HCCS的鹽溶液替代品(0.9%氯化鈉溶液)。術(shù)后使用0.5%鹽酸左氧氟沙星預(yù)防感染。14 d后，除對照組外的其他大鼠平均眼壓維持在22 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)為造模成功[6-7]。建模成功后，白藜蘆醇低、中及高劑量組大鼠給予相應(yīng)藥物灌胃(10 ml/kg)，持續(xù)12周，模型組及對照組大鼠給予相應(yīng)體積(10 ml/kg)的0.9%氯化鈉溶液。

1.4 大鼠眼壓的測定

使用WS-98筆式眼壓計測量五組大鼠眼壓，測量前用丁卡因藥水滴雙眼，取其平均值。

1.5 大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡水平檢測

視網(wǎng)膜石蠟切片脫蠟，溫和胰蛋白酶消化后，采用FACSCalibur流式細胞儀以及FITC綴合的膜聯(lián)蛋白V細胞凋亡檢測試劑盒檢測大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡水平。即將切片在4%多聚甲醛中于室溫(25 ℃)固定30 min。用冷的0.1%Triton X-100溶液滲透10 min，然后在潮濕的環(huán)境中與100 μl的TUNEL反應(yīng)混合物(含10 μl酶溶液和90 μl標(biāo)記溶液)一起孵育1 h后，用DAPI染色液固定。熒光圖像用Zeiss Imager M1激光掃描顯微鏡捕獲，并用數(shù)字圖像分析系統(tǒng)進行分析。在每個蓋玻片的6個隨機選擇的區(qū)域中計數(shù)總細胞數(shù)和TUNEL陽性細胞數(shù)，并表示為平均值。分析TUNEL陽性細胞的比例，凋亡率=TUNEL陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6 大鼠視網(wǎng)膜病理結(jié)構(gòu)觀察

大鼠視網(wǎng)膜常規(guī)脫水、脫蠟，HE染色，顯微鏡觀察視網(wǎng)膜病理結(jié)構(gòu)變化。

1.7 大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax、Caspase-9 mRNA水平檢測

使用Trizol試劑從視網(wǎng)膜組織提取總RNA。對于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用隨機引物(10 μmol/L)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA，最終體積為10 μl。逆轉(zhuǎn)錄程序為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，5 min。然后使用Power SYBR Green試劑盒在ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀上進行定量實時PCR；反應(yīng)在10 μl反應(yīng)液中進行，其中包含SYBR預(yù)混液(2X)5 μl、PCR正向引物(10 μmol/L)0.4 μl、PCR反向引物(10 μmol/L)0.4 μl、ROX參考染料Ⅱ(50X)0.2 μl、雙蒸餾水3 μl和樣品互補DNA 1 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃持續(xù)10 min，95 ℃持續(xù)30 s，95 ℃持續(xù)5 s，61 ℃持續(xù)30 s循環(huán)；共計50個循環(huán)，最后延伸在72 ℃下加熱5 min。將ΔCt值標(biāo)準(zhǔn)化為β-肌動蛋白。使用2-ΔΔCt方法獲得相對定量值。每個實驗一式3份進行，并重復(fù)3次。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列為：Bcl-2正向5′-AAGTGG CACCAGCCTCACT-3′，反向5′-CGGCCAAGTTCTTTACCATC-3′；Bax正向5′-CTGTGACTGACTGTGACCTGA-3′，反向5′-TGC TGACTGACACTGTGACTG-3′；Caspase-9正向5′-ACTGGAA CGGTGAAGGTGAC-3′，反向5′-AGAGAAGTGGGGTGGCGC TTTT-3′；β-肌動蛋白正向5′-ACCTGTACGGTGATGAACCT GTGA-3′，反向5′-CTGTGTGACGTAGTCGTTAGGGGTGCCTGTG ACCCATTTA-3′。

1.8 大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax及Caspase-9蛋白水平檢測

收集視網(wǎng)膜并徹底勻漿。使用放射免疫沉淀分析緩沖液從勻漿中提取總蛋白含量。使用雙辛可寧酸試劑盒(BCA試劑盒)測量蛋白質(zhì)濃度。在Mini-Protean 3電泳系統(tǒng)中用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)樣品，然后在Mini Trans-Blot電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將其電印跡到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h后，將膜與兔多克隆抗Bcl-2、Bax(1∶200稀釋度)，兔多克隆抗Caspase-9(1∶200稀釋度)，小鼠單克隆抗β-肌動蛋白(1∶1 000稀釋)一抗在4 ℃下過夜孵育。然后將膜用吐溫的Tris緩沖鹽水洗滌，并與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔(1∶2 000稀釋)二抗在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)熒光試劑在ImageQuant4000 mini型GE超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀中觀察膜上的蛋白條帶。通過數(shù)字圖像分析系統(tǒng)對圖像進行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 五組大鼠眼壓、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率水平比較

與對照組比較，模型組大鼠眼壓、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，白藜蘆醇低、中及高劑量組大鼠眼壓、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且隨著白藜蘆醇劑量的增加，眼壓、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率水平逐漸降低，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 五組大鼠眼壓、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率水平比較Tab 1 Comparison of intraocular pressure and apoptosis rates of retinal ganglion cell among five groups

2.2 五組大鼠視網(wǎng)膜病理結(jié)構(gòu)改變情況

五組大鼠視網(wǎng)膜病理結(jié)構(gòu)改變情況見圖1。由圖1可見，對照組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠的高眼壓導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)死亡，核固縮(箭頭所示)，且有大量炎癥細胞浸潤；白藜蘆醇低、中及高劑量組大鼠視神經(jīng)纖維排列無規(guī)律，纖維間質(zhì)少見水腫與空泡，伴隨少量炎癥細胞浸潤(箭頭所示)。

A.對照組；B.模型組；C.白藜蘆醇低劑量組；D.白藜蘆醇中 劑量組；E.白藜蘆醇高劑量組A.control group; B.model group; C.low dose group of resveratrol; D.medium dose group of resveratrol; E.high dose group of resveratrol圖1 五組大鼠視網(wǎng)膜病理結(jié)構(gòu)改變情況(HE染色，400倍)Fig 1 Changes of pathological structure of rat retina in five group (HE staining, 400 times)

2.3 五組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax及Caspase-9 mRNA水平比較

與對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2 mRNA水平明顯降低，Bax、Caspase-9 mRNA水平明顯升高；與模型組比較，白藜蘆醇低、中及高劑量組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2 mRNA水平明顯升高，Bax、Caspase-9 mRNA水平明顯降低，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且隨著白藜蘆醇劑量的增加，視網(wǎng)膜Bcl-2 mRNA水平逐漸升高，Bax、Caspase-9 mRNA水平逐漸降低，組間比較的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.4 五組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax及Caspase-9蛋白水平比較

與對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白水平明顯降低，Bax、Caspase-9蛋白水平明顯升高；與模型組比較，白藜蘆醇低、中及高劑量組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白水平明顯升高，Bax、Caspase-9蛋白水平明顯降低，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且隨著白藜蘆醇劑量的增加，視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白水平逐漸升高，Bax、Caspase-9蛋白水平逐漸降低，組間比較的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表2 五組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax及Caspase-9 mRNA 水平比較Tab 2 Comparison of mRNA lelves of Bcl-2, Bax and Caspase-9 in rats retina among five groups

表3 五組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax及Caspase-9蛋白水平 比較Tab 3 Comparison of protein levels of Bcl-2, Bax and Caspase-9 in rats retina among five groups

A.對照組；B.模型組；C.白藜蘆醇低劑量組；D.白藜蘆醇 中劑量組；E.白藜蘆醇高劑量組A.control group; B.model group; C.low dose group of resveratrol; D.medium dose group of resveratrol; E.high dose group of resveratrol圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白水平條帶圖Fig 2 Histogram of protein levels of Bcl-2, Bax and Caspase-9 in rats retina in each group

3 討論

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠眼壓、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率升高；與模型組比較，白藜蘆醇低、中及高劑量組大鼠眼壓、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率降低；且隨著白藜蘆醇劑量的增加，眼壓、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率水平逐漸降低。這說明，白藜蘆醇能降低慢性青光眼大鼠眼內(nèi)壓及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率水平，對青光眼具有神經(jīng)保護作用。青光眼是嚴(yán)重的不可逆視力障礙和失明的主要原因[8]。青光眼的共同特征是眼內(nèi)壓升高，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞逐漸死亡。目前通過外科手術(shù)和藥物降低眼壓的治療方法不能完全防止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的進行性退化[9]。因此，預(yù)防視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞死亡和疾病進展緩慢的新策略的開發(fā)已成為青光眼治療的主要目標(biāo)。白藜蘆醇可以作為沉默信息因子(SIRT1)的激活劑，可模擬熱量限制(CR)抗衰老反應(yīng)，參與有機生物平均生命期的調(diào)控[10]。CR是SIRT1的強誘導(dǎo)劑，能增加SIRT1在腦、心、腸、腎、肌肉和脂肪等器官組織中的表達，CR能夠引起延緩衰老和延長壽命的生理變化。此外，白藜蘆醇具有免疫抑制、抗增殖的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能夠通過調(diào)節(jié)體外核因子κB信號傳導(dǎo)來抑制小膠質(zhì)細胞中神經(jīng)毒性介質(zhì)的釋放[11]。白藜蘆醇還可通過維持Akt磷酸化來直接抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡，進而抑制神經(jīng)毒性介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的產(chǎn)生[12]。病理學(xué)結(jié)果顯示，模型組大鼠的高眼壓導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)死亡，核固縮，且有大量炎癥細胞浸潤；白藜蘆醇低、中及高劑量組大鼠視神經(jīng)纖維排列無規(guī)律，纖維間質(zhì)少見水腫與空泡，伴隨少量炎癥細胞浸潤。上述結(jié)果印證了白藜蘆醇對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞具有保護作用。

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡與半胱氨酸蛋白酶密切相關(guān)，半胱氨酸蛋白酶是激活凋亡途徑的關(guān)鍵酶，半胱氨酸蛋白酶充當(dāng)“引發(fā)劑”或“效應(yīng)子”。起始Caspase：Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10，裂解并激活效應(yīng)Caspase；效應(yīng)Caspase：Caspase-3，Caspase-6和Caspase-7，其依次水解靶蛋白并引發(fā)凋亡[13]。研究結(jié)果表明，半胱氨酸蛋白酶參與視神經(jīng)病變、青光眼和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞死亡[14]。慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜中顯示較高水平的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9,視網(wǎng)膜缺血/再灌注激活Caspase-2和Caspase-9，玻璃體內(nèi)注射海因酸酯裂解的Caspase-3，其效應(yīng)子Caspase-9活性增加[15]。蛋白Bcl-2可以通過Caspase-9和Caspase-3依賴性途徑調(diào)節(jié)細胞凋亡。具有Bcl-2同源性(BH)3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族成員在受到死亡信號刺激后被激活，然后該蛋白激活其他Bcl-2家族成員。例如，Bax和Bcl-2同源拮抗劑/殺手(Bak)以誘導(dǎo)線粒體通透性并釋放細胞色素c和其他蛋白質(zhì)，從而激活Caspase-9；然后，Caspase-9催化Caspase-3的活化，最終導(dǎo)致細胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜Bax、Caspase-9 mRNA和蛋白水平明顯升高，Bcl-2 mRNA和蛋白水平明顯降低；與模型組比較，白藜蘆醇低、中及高劑量組大鼠視網(wǎng)膜Bax、Caspase-9 mRNA和蛋白水平明顯降低，Bcl-2 mRNA和蛋白水平明顯升高；且白藜蘆醇各組間呈劑量依賴性。這說明白藜蘆醇能明顯抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞Bax、Caspase-9 mRNA和蛋白的表達，促進Bcl-2 mRNA和蛋白的表達，進而抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。

綜上所述，白藜蘆醇能降低慢性青光眼大鼠眼壓，對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞具有保護作用；其機制與白藜蘆醇能明顯抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞Bax、Caspase-9 mRNA和蛋白的表達，促進Bcl-2 mRNA和蛋白的表達水平，進而抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡有關(guān)。