長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

劉 佳，張 悅，沈志彥，張樹武，薛應(yīng)鈺，梁巧蘭，陶 飛，徐秉良

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070)

美洲南瓜(Cucurbitapepo)為一年生蔓生草本植物，因其含有多種營養(yǎng)成分，具有很高的食用和藥用價值，在中國大部分地區(qū)普遍栽培[1]。甘肅省武威市是美洲南瓜的重要育種研發(fā)和生產(chǎn)基地，也是當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)作物之一[2]。瓜類枯萎病(Fusariumwilt)是瓜類生產(chǎn)上最難防治的土傳性病害之一[3]，該病在大多數(shù)瓜類種植區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病后會造成減產(chǎn)，甚至全田毀滅，且防治困難。因此，枯萎病的危害是瓜類生產(chǎn)上急需解決的重要問題，也成為限制美洲南瓜生產(chǎn)的重要因素之一[4]。

目前，對枯萎病的防治主要以化學(xué)防治為主，然而長期使用化學(xué)農(nóng)藥容易造成農(nóng)藥殘留，易使植株產(chǎn)生抗藥性，此外，還會危害人畜健康，造成環(huán)境污染等[5]。生物防治污染小、適用范圍廣，對環(huán)境干擾小，能夠有效抑制病原菌，這些特點與國家的綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展要求高度一致，近年來得到迅速推廣[6]。有研究表明，復(fù)配芽孢桿菌(解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens+枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis)具有很強的拮抗活性，能夠有效防治撐綠雜交竹枯萎病[7]。伊海靜等[8]研究表明，寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)對草莓枯萎病菌具有很好的抑制效果。潘俊等[9]發(fā)現(xiàn)，熒光假單桿菌(Pseudomonasfluorescence)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的組合對石榴枯萎病有很好防治效果，而單用熒光假單桿菌(Pseudomonasfluorescence)的防治效果相對 較差。

瓜類枯萎病多為土傳病害，對土壤進(jìn)行大面積的藥劑處理在生產(chǎn)中難以實現(xiàn)。因此，采用高效、安全、環(huán)境友好型生物制劑成為研究的熱點。有研究[10]表明：解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Lh-1對西瓜枯萎病具有較好的防治效果。侯圓圓等[11]以綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)G5菌株為生防因子來研究對瓜類枯萎病的防治。朱育菁等[12]研究表明,枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)NH-BS-2000對瓜類枯萎病同樣具有一定的防治效果。

木霉菌(Trichodermaspp.)作為一種具有重要開發(fā)價值的自然資源正逐漸被農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域研究、開發(fā)和利用[13]。谷祖敏等[14]發(fā)現(xiàn)，將綠色木霉(Trichodermaviride)與菇渣和牛糞復(fù)配，不僅可以顯著提高木霉對黃瓜枯萎病的防病效果，而且對黃瓜生長具有促生作用。也有報道指出，添加少量營養(yǎng)元素為增效劑的木霉菌多功能生防菌劑、哈茨木霉菌Ta22(Trichodermaharzianira)和綠色木霉菌T23(Trichodermaviride)對甜瓜、黃瓜、西瓜枯萎病均具有很好的防治效果，防效均達(dá)到66%以上[15]。但是有關(guān)木霉菌對美洲南瓜枯萎病防治的研究報道較少。因此，本試驗對長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用及防治效果進(jìn)行研究，為美洲南瓜枯萎病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病原菌 美洲南瓜枯萎病菌，從甘肅省武威市金蘋果有限責(zé)任公司種質(zhì)資源試驗基地患枯萎病的美洲南瓜中采集，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原學(xué)實驗室分離，并鑒定為尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)。

1.1.2 供試生防菌 具有自主知識產(chǎn)權(quán)的生防長枝木霉T6菌株(Trichodermalongibrachiatum，CGMCC.No.13183)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原學(xué)實驗室分離、保存。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用 將長枝木霉T6菌株和美洲南瓜枯萎病菌活化，分別置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，在菌落最外層取直徑為5 mm的長枝木霉T6菌株菌餅，與美洲南瓜枯萎病菌菌餅對接于PDA培養(yǎng)基中，兩菌餅間隔3.5 cm[16]。以長枝木霉T6菌株純培養(yǎng)、美洲南瓜枯萎病菌純培養(yǎng)菌落作為對照，每組設(shè)立5個重復(fù)。置于 28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，定期觀察兩種菌的生長情況，觀察并記錄其生長半徑。

菌絲生長抑菌率=(美洲南瓜枯萎病菌菌落直徑-木霉處理菌落直徑)/美洲南瓜枯萎病菌菌落直徑×100%

1.2.2 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌拮抗作用方式觀察 在PDA培養(yǎng)基中央放置一塊20 mm×20 mm的無菌蓋玻片，在無菌蓋玻片左右兩側(cè)20 mm處分別接種長枝木霉T6菌株和美洲南瓜枯萎病菌，設(shè)置12個重復(fù)。將接種好的培養(yǎng)皿放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 3 d時，取下蓋玻片，放在載玻片上，用光學(xué)顯微鏡觀察兩種菌菌絲之間的作用方式，并分別用照相機(jī)(Canon 100D)和生物顯微成像分析系統(tǒng)(Nikon E200-2MV-U2)拍照。

1.2.3 長枝木霉T6菌株發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌發(fā)的影響 將長枝木霉T6菌株發(fā)酵液與制備好的美洲南瓜枯萎病菌分生孢子懸浮液(濃度為1×105cfu·mL-1)[17]按1∶1的比例混勻，取60 μL滴于PDA平板上，均勻涂布，以無菌水與分生孢子懸浮液混合處理作為空白對照，每組設(shè)置5個重復(fù)，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于6 h、12 h、18 h、24 h統(tǒng)計分生孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)抑制率=(1-孢子萌發(fā)數(shù))/孢子總數(shù)×100%

1.2.4 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病的室內(nèi)防效試驗 在玻璃培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中鋪3層滅菌濾紙，用移液器均勻滴加3 mL無菌水于濾紙上，至濾紙浸濕無多余水，分別用75%酒精2 min和3%次氯酸鈉5～10 min將美洲南瓜(品種為‘光板’)的種子浸泡消毒，無菌水沖洗后均勻擺在鋪好的濾紙上，把培養(yǎng)皿放于 25 ℃、16 h光照、8 h黑暗的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約 7 d。待種子長出1 cm左右長的根后，置于裝有滅菌營養(yǎng)土的盆中種植培養(yǎng)。

待培養(yǎng)至4～5葉苗齡時期后，選取長勢一致的美洲南瓜苗，將植株根部從花盆中挖出，沖洗干凈，用無菌濾紙將水分吸干后用無菌剪刀將植株須根剪掉0.2 cm，造成傷口。利用蘸根法[18]，將植株根部全部浸泡在配置好的美洲南瓜枯萎病菌孢子懸浮液(濃度為1×105cfu·mL-1)中30 min[19]。選取一部分接種病原菌的美洲南瓜苗，培養(yǎng)1 d，灌入配置好的長枝木霉T6菌株孢子懸浮液，以無菌水作為對照，處理后美洲南瓜苗重新種進(jìn)花盆中。培養(yǎng)5 d后，觀察并記錄3組美洲南瓜苗生長及發(fā)病情況。每個處理20株，重復(fù)3次。

發(fā)病率=發(fā)病植株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=∑(各級病株數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值)×100

病情分級標(biāo)準(zhǔn)為[20]：0級，無病癥；1級，子葉萎蔫或部分子葉與真葉輕微萎蔫；2級，1片真葉萎蔫或子葉較重萎蔫；3級，子葉及部分真葉萎蔫；4級，整株輕度萎蔫，部分枯死，但是心葉仍然成活；5級，整株嚴(yán)重萎蔫并枯死。

1.2.5 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜種子胚根發(fā)病的影響 在玻璃培養(yǎng)皿(直徑18 cm)中鋪3層滅菌紗布，用移液器均勻滴加3 mL無菌水于濾紙上，選取大小、長勢一致的美洲南瓜種子均勻擺在濾紙上，把培養(yǎng)皿置于16 h光照、8 h黑暗的25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。待種子長出胚根后用滅菌的接種針將種子的胚根部表皮輕輕扎破，造成微傷口，在傷口處多次噴美洲南瓜枯萎病菌孢子懸浮液(濃度為1×105cfu·mL-1)，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取一部分接種病原菌的種子，培養(yǎng)1 d后，在傷口處多次噴長枝木霉T6菌株孢子懸浮液，同樣繼續(xù)放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對照組同樣刺傷，以無菌水處理，觀察并記錄種子根系的發(fā)病情況。每個處理20粒種子，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2010整理，采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析并做差異顯著性檢驗(Duncan氏新復(fù)極差法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用及方式觀察

在對峙培養(yǎng)中，長枝木霉T6菌株生長速度較快，覆蓋了平板的4/5，表明長枝木霉T6菌株在空間和營養(yǎng)上有明顯的競爭優(yōu)勢。和美洲南瓜枯萎病菌的純培養(yǎng)相比，與長枝木霉T6菌株對峙培養(yǎng)的美洲南瓜枯萎病菌生長活力低下，僅形成較小菌落(圖1)，經(jīng)測量計算得知，長枝木霉T6菌株對南瓜枯萎病菌的抑制率為60.09% (表1)。

長枝木霉T6菌株菌落與美洲南瓜枯萎病菌菌落之間形成明顯的抑菌帶，說明長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌具有明顯抑制作用(圖2-A)；顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)長枝木霉T6菌株菌絲已經(jīng)對美洲南瓜枯萎病菌菌絲發(fā)生纏繞(圖2-B)，表明長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌有重寄生作用。

A.長枝木霉T6菌株與美洲南瓜枯萎病菌的平板對峙；B.美洲南瓜枯萎病菌純培養(yǎng)

表1 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用Table 1 Inhibition of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on Fusarium oxysporum

2.2 長枝木霉T6菌株發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌發(fā)的影響

由表2可知，長枝木霉T6菌株發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用。當(dāng)長枝木霉T6菌株發(fā)酵液處理24 h后，分生孢子萌發(fā)率僅為31.00%，與對照相比，萌發(fā)率下降63.10%(P<0.05)。

表2 長枝木霉T6菌株發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌發(fā)的影響Table 2 Conidia germination of Fusarium oxysporum under treatment of fermentation broth of Trichoderma longibrachiatum T6 strain

2.3 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病的室內(nèi)防效

如圖3-A所示，無菌水處理的美洲南瓜苗生長健康，莖稈有力，葉片舒展肥大；接種病原菌的美洲南瓜苗全部萎蔫倒伏，莖基部變黃萎縮，葉片皺縮變褐(圖3-B)；接種病原菌后用長枝木霉T6菌株處理的美洲南瓜苗發(fā)病情況得到改善，葉片漸漸舒展(圖3-C)。

長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病的室內(nèi)防效結(jié)果表明，長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病發(fā)病率具有明顯的抑制作用，接種病原菌的美洲南瓜苗的發(fā)病率高達(dá)72.06%，經(jīng)過長枝木霉T6菌株處理的美洲南瓜苗，發(fā)病率降至 28.36%，比對照組下降60.6%；接種病原菌的美洲南瓜苗病情指數(shù)高達(dá)69.33，處理組的病情指數(shù)低至21.45；通過試驗得知，長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病具有一定的防治效果，防效達(dá)到69.06%(表3)。

A.病原菌與生防菌間出現(xiàn)明顯抑菌帶；B.長枝木霉T6菌株菌絲纏繞在美洲南瓜枯萎病菌上生長(a為長枝木霉T6菌株菌絲；b為美洲南瓜枯萎病菌菌絲)

2.4 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜種子催芽的影響

美洲南瓜種子未接種病菌時，種子根部和莖基部顏色白，較粗壯，根長且健康(圖4-A)；接菌后，種子根部和莖基部變黃、萎縮，且生長緩慢甚至停止生長(圖4-B)；接菌后又經(jīng)過長枝木霉T6菌株處理的種子根部和莖基部變白，變粗壯，恢復(fù)生長活力(圖4-C)。

A.健康美洲南瓜種子；B.接種病原菌的美洲南瓜種子； C.發(fā)病后經(jīng)長枝木霉T6菌株處理的美洲南瓜種子

3 結(jié)論與討論

李琳等[21]從胡麻種植土壤中分離出一種SF1生防菌，其對尖孢鐮孢菌胡麻?；驼婢囊志蔬_(dá)58.99%。劉彩云等[22]研究表明，生防菌LB-1發(fā)酵液葉面噴施盆栽苗和浸蘸處理離體葉段，對煙草白粉病的防效和抑制率分別為 44.90%和53.11%。本研究表明，生防菌長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑菌率可達(dá) 60.09%，對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子的萌發(fā)率抑制率達(dá)到31.00%。侯仙等[23]采用菌液灌根的方法測定生防菌NJZ12-2對棉花黃萎病的室內(nèi)盆栽防治效果為52.41%～52.81%，本研究同樣采用蘸根法測定長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病的室內(nèi)盆栽防效，防效達(dá)到69.06%，表明長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病有較好的防治效果。

據(jù)報道，拮抗木霉菌的生防機(jī)制包括重寄生作用、抗生作用、競爭作用、誘導(dǎo)抗病性、促生作用和協(xié)同拮抗作用[24]。郎劍鋒等[25]研究表明，哈茨木霉對小麥紋枯病的生防機(jī)制表現(xiàn)為營養(yǎng)競爭、抗生和重寄生作用。本研究亦得到一致的結(jié)論，長枝木霉T6菌株生長速度快，快速占領(lǐng)空間，奪取病原菌的營養(yǎng)，阻礙病原菌的生長，顯微觀察發(fā)現(xiàn)，長枝木霉T6木霉的菌絲纏繞在美洲南瓜枯萎病菌的菌絲上，吸取菌絲內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，分解病原菌，表現(xiàn)為重寄生作用。

本研究結(jié)果表明，長枝木霉T6菌株通過競爭空間，養(yǎng)分及菌絲纏繞美洲南瓜枯萎病菌菌絲，達(dá)到對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用，同時長枝木霉T6菌株發(fā)酵液對該病菌的分生孢子萌發(fā)亦具有明顯的抑制作用；室內(nèi)盆栽試驗證實長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病的防效達(dá)到 69.06%。該研究結(jié)果為美洲南瓜枯萎病菌的生防制劑篩選提供一定的理論基礎(chǔ)。