不同番茄材料黃化曲葉病毒病抗性評價及抗性基因檢測

劉 放，魏小紅，張小芳，朱雪妹，馮 悅

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070；2.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室,蘭州 730070；3.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室,蘭州 730070)

番茄黃化曲葉病毒病 (Tomato yellow leaf curl virus disease，TYLCVD)是由黃化曲葉病毒( Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV簡稱TY)引起的一種對番茄產(chǎn)生毀滅性危害的一種病害，屬于雙生病毒科(Family Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)[1]的一類具有孿生顆粒形態(tài)的植物DNA病毒[2]。最早在20世紀(jì)50年代后期發(fā)現(xiàn)于阿拉伯半島的西北部等地區(qū)[3]，1964年被命名為黃化曲葉病毒病[4]，煙粉虱(Bemisiatabaci)是其主要的傳播方式[5]。中國首次于2006年在上海發(fā)現(xiàn)黃化曲葉病[6]，近年來，該病毒已在上海、北京、新疆、安徽、浙江、天津、四川、陜西等地區(qū)大范圍爆發(fā)[7]。目前針對對番茄黃化曲葉病毒病的防治主要以控制煙粉虱為主，但由于煙粉虱繁殖能力及其遷飛能力頻率較高，并未取得理想的防治效果，目前抗病品種選育是當(dāng)前防治TYLCV的最好方法之一[8-10]。

植物的防衛(wèi)反應(yīng)是由酶催化產(chǎn)生的一系列復(fù)雜生理生化代謝的結(jié)果[11]，防御酶是植物體內(nèi)抵制病原侵染的有關(guān)物質(zhì)，其活性的變化通常作為衡量植物體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)的重要指標(biāo)[12]。研究表明，其活性的高低與植物的抗病能力之間存在正相關(guān)關(guān)系[13-14]。目前已經(jīng)在一些野生番茄中發(fā)現(xiàn)TYLCV的抗性基因，包括Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4和ty-5、Ty-6等[15]，其中Ty-1、Ty-2和Ty-3在中國番茄種質(zhì)資源中開發(fā)和利用較多[16]。這些抗性基因在育種中已成功應(yīng)用，如瑞士先正達(dá)公司選育的‘拉比’和‘齊達(dá)利’里面都含有Ty-3a基因，法國 Clause 公司選育的‘寶麗’含Ty-3a基因，中國選育的‘浙粉701’含Ty-2基因，‘浙雜502’含有Ty-3a基因[17]。為了更加方便快捷地檢測番茄攜帶抗性基因，針對 TYLCV 主要的抗性基因開發(fā)了一系列的分子標(biāo)記[18]。如Ty-1、Ty-2和Ty-3/Ty-3a基因的 SCAR標(biāo)記，這些分子標(biāo)記在抗感品系間均表現(xiàn)出長度多態(tài)性，能夠區(qū)分純合、雜合品系，成為與 TYLCV 抗性基因緊密連鎖的共顯性標(biāo)記，可以方便、快捷、可靠地檢測大量個體[19]。

本試驗選用17份番茄材料，通過苗期人工接種黃化曲葉病毒，從病情指數(shù)、防御酶活性的變化、抗性基因的檢測三方面研究番茄材料對番茄黃化曲葉病毒病的抗性，為篩選和培育番茄黃化曲葉病毒病抗病番茄材料提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的15份番茄育種材料由甘肅張掖益新泉蔬菜育種公司提供，編號分別為801、802、803、805、806、817、818、819、820、822、841、842、853、857、867?！R達(dá)利’(先正達(dá)種子公司提供)為陽性對照，‘Money Maker’(MM)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所鮮食番茄課題組提供)為陰性對照。用于苗期接種的 TY-DNA 侵染性克隆 pBin-PLUS-1.7A+2β(農(nóng)桿菌)引自浙江大學(xué)周雪平教授實驗室。

1.2 方 法

1.2.1 番茄苗的培養(yǎng) 將以上17份番茄材料種子用10%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，于2019年4月9日播種于50孔的育苗穴盤中，置于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)育苗基地培養(yǎng)，當(dāng)番茄幼苗長出1～2片真葉時，將其定植于花盆中。

1.2.2 pBin-PLUS-1.7A+2β的培養(yǎng) 準(zhǔn)備含 Kan(50 mg/L)和 Rif(50 mg/L)的固體 LB 培養(yǎng)基和液體LB培養(yǎng)基，取含 pBin-PLUS-1.7A+2β的農(nóng)桿菌菌液，在固體LB培養(yǎng)基上涂板，靜置于28 ℃培養(yǎng)箱，倒置暗培養(yǎng)，待長出單菌落，挑取之于LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min 28 ℃培養(yǎng)，過夜搖菌。當(dāng)菌液 600 nm波長處的吸光值達(dá)0.6～0.8時，可用于注射接種。

1.2.3 接種病毒 接種前一天給幼苗澆足水,使葉片細(xì)胞吸水飽脹,便于注射侵染。接種時采用葉片人工注射接種。將容量為1 mL的注射器去除針頭，吸取菌液，番茄葉背壓力注射至可觀察到菌液滲入，每株 0.2 mL左右，每個番茄材料幼苗各接種20株。接種后20、30、40 d調(diào)查發(fā)病情況并取番茄葉組織，進(jìn)行苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性測定，試驗設(shè)3次重復(fù)。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 番茄材料病情調(diào)查與分析 病情分級參照 Lapidot等[20]的抗性分級方法:0級，植株正常生長；1級，新葉輕微卷曲，發(fā)皺，其他正常；2級，葉片一定程度上黃化,發(fā)皺；3級，葉片大面積黃化卷曲，植株矮化；4級，植株嚴(yán)重矮化，葉片卷曲黃化嚴(yán)重，植株停止生長。根據(jù)通用的番茄病毒病群體分級標(biāo)準(zhǔn)[21]，分為免疫(I，不表現(xiàn)癥狀，病情指數(shù)為 0)、高抗(HR，0 < 病情指數(shù)≤2)、抗病(R，2 < 病情指數(shù)≤15)、中抗(MR，15 < 病情指數(shù)≤30)、感病(S，30 < 病情指數(shù)≤100)。病情指數(shù)計算參照以下公式：

病情指數(shù)(DI)=∑(發(fā)病株數(shù)×發(fā)病級數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級數(shù))×100%

病株率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù) ×100%

1.3.2 防御酶活性的測定 POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法；PPO 活性測定及PAL活性測定參照李翠丹等[22]的方法。

1.3.3 抗性基因的檢測 于2019年5月15日，分別取17份番茄材料的新鮮組織，用液氮速凍，用試劑盒方法提取葉片的總DNA，試劑盒購自天根生物公司。用于番茄抗病基因檢測的引物一共有3對，參考蔣振等[15]、Garcia等[23]、Ji 等[24]，分別為Ty-1、Ty-2、Ty-3，由北京奧克鼎盛生物公司合成，引物序列及擴增長度見表1。PCR體系為20μL ,其中模板DNA 1μL、Master Mix10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、ddH2O 7 μL。PCR擴增反應(yīng)程序：94 ℃變性3 min后開始循環(huán)，94 ℃變性30 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)結(jié)束后，72 ℃繼續(xù)延伸 5 min。PCR產(chǎn)物于 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳 25 min(150V)，最后用Goldview染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表1 抗性基因名稱、基因型及所需引物統(tǒng)計Table 1 Resistance gene name,genotype and required primer statistics

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)設(shè)定3個重復(fù)，采用 Microsoft Excel(2016 版) 計算試驗數(shù)據(jù)并作圖，用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并運用 Duncan’s 檢驗法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情調(diào)查及分析

從表2可以看出，隨著時間的推移，除免疫和高抗材料外，其他材料的病株率和病情指數(shù)均呈上升趨勢，第20天到第30天上升趨勢最快并在第40天時達(dá)到峰值；接種第20天時，805、817、819、820、841、842表現(xiàn)為高抗，853、857、867表現(xiàn)免疫，證明在感病初期對番茄黃花曲葉病毒病是有一定抗性的；接種第30天時，感病材料病株率和病情指數(shù)上升明顯，801、802、806、822、陰性對照MM發(fā)病率和病情指數(shù)均較高，與其他材料有顯著性差異(P<0.01 ,P<0.05)；接種第40天時，大部分感病材料病株率和病情指數(shù)有緩慢上升并趨于平穩(wěn)，感病情況較第30天時變化不大,證明在第40天時已經(jīng)充分發(fā)病。801、802、 803、806、822、陰性對照材料MM病株率和病情指數(shù)達(dá)到峰值，發(fā)病最為嚴(yán)重，與其他材料有顯著性差(P<0.01,P<0.05)，是較為典型的感病品種。

表2 不同時期番茄材料病情調(diào)查結(jié)果Table 2 Investigation result of tomato materials in different periods

2.2 番茄幼苗葉片內(nèi)防御酶活性與抗病性的關(guān)系

2.2.1 PAL活性與抗病性的關(guān)系 由圖1可以看出，801、805、817、818、820、842隨著時間的推移，酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢并在第30天時達(dá)到峰值；陽性對照材料齊達(dá)利、802、803、806、819、822、841、853、857、867隨著時間的推移，酶活性則呈現(xiàn)逐步降低的趨勢并在第20天時達(dá)到峰值,說明這些番茄材料在發(fā)病初期就啟動了防御酶系統(tǒng)；陰性對照材料MM酶活性隨著時間的推移則呈現(xiàn)逐步上升的趨勢并在第40天時達(dá)到峰值；陽性對照材料‘齊達(dá)利’的酶活性同其他材料相比有顯著性差異(P<0.05)。

圖1 不同番茄材料苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性Fig.1 Phenylalaninase (PAL) activity of different tomato materials

2.2.2 PPO活性與抗病性的關(guān)系 由圖2可以看出，801、803、817、822、841、842隨著時間的推移，酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢并在30 d時達(dá)到峰值；陽性對照材料齊達(dá)利、陰性對照材料MM、802、805、806、818、819、820、853、857、867、857、867隨著時間的推移，酶活性則呈現(xiàn)逐步降低的趨勢并在20 d時達(dá)到峰值；陽性對照材料齊達(dá)利、857、867的酶活性同其他材料相比有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.3 POD活性與抗病性的關(guān)系 由圖3可以看出，17份番茄材料隨著時間的推移，酶活性呈現(xiàn)逐步降低的趨勢并在20 d時達(dá)到峰值，陽性對照材料齊達(dá)利的酶活性同其他材料相比有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 不同番茄材料多酚氧化酶(PPO)活性Fig.2 Polyphenol oxidase (PPO) activity of different tomato materials

圖3 不同番茄材料過氧化物酶(POD)活性Fig.3 Peroxidase (POD) activity of different tomato materials

2.3 番茄材料抗性基因的檢測

由圖4可知，對17份番茄材料進(jìn)行PCR擴增，818、820、853、857、867和‘齊達(dá)利’擴增出約750 bp的條帶，均為純合顯性材料Ty-1/Ty-1。801、802、803、805、806、817、819、822、841、842擴增出約630 bp的條帶，均為純合隱性材料Ty-1/Ty-1。MM不含Ty-1基因；801、802、803、805、806、817、818、819、820、841、842、853、857、867和‘齊達(dá)利’擴增出約850 bp的條帶，均為純合隱性材料Ty-2/Ty-2。822和MM不含Ty-2基因；853、857、867擴增出約450 bp的條帶，均為純合抗病材料Ty-3/Ty-3。 801、802、803、805、806、817、818、819、820、841、842擴增出約320 bp的條帶，均為純合隱性材料Ty-3/Ty-3。陽性對照材料‘齊達(dá)利’為雜合抗病材料Ty-3/Ty-3，陰性對照材料MM不含Ty-3基因。

a. Ty-1PCR擴增產(chǎn)物; b. Ty-2 PCR 擴增產(chǎn)物; c. Ty-3/ Ty-3a PCR擴增產(chǎn)物；1-17.分別為番茄材料801、802、803、805、806、817、818、819、820、822、841、842、853、857、867、陽性對照‘齊達(dá)利’及陰性對照MM；M.marker

3 討 論

近幾年，番茄黃化曲葉病毒病逐漸成為影響番茄產(chǎn)量的限制因素。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，在抗黃化曲葉病毒病抗性基因及其相關(guān)抗病機理方面取得的研究成果，為抗病育種方面提供了扎實的理論基礎(chǔ)[25]。

如何對番茄材料進(jìn)行客觀的抗性評價對選育新品種至關(guān)重要。本研究選用農(nóng)桿菌接種黃化曲葉病毒，對不同的番茄材料進(jìn)行病情指數(shù)調(diào)查、防御酶活性測定及抗性基因的檢測。結(jié)果表明，隨著時間的推移，除853、857、867對番茄黃化曲葉病毒毒病表現(xiàn)為免疫外，其他材料均不同程度的發(fā)病且病情指數(shù)呈上升趨勢,與鄭積榮等[19]研究結(jié)論一致。對黃化曲葉病毒病表現(xiàn)為免疫的853、857、867均在接種后的初期防御酶活性達(dá)到峰值，說明可能是由于早期防御反應(yīng)出現(xiàn)較早，酶促反應(yīng)速度快，催化誘導(dǎo)形成的酚類物質(zhì)積累早，而其他感病材料不同程度感病且峰值出現(xiàn)較晚，這與馬艷玲等[26]在黃瓜枯萎病抗性研究中得出的結(jié)論相同。而防御酶的啟動作為植物抗病的一個表現(xiàn)，在實際栽培中可根據(jù)發(fā)病高峰期到來的時間，合理安排施用化學(xué)藥物進(jìn)行防治。TYLCV 屬于雙生病毒，是一種重組極度頻繁的植物病毒[27]，導(dǎo)致了該病毒極易發(fā)生變異，不同番茄材料所含抗性基因不同，其表現(xiàn)的抗性水平也不同[28-31]。本試驗結(jié)果表明，只要含有抗性基因的材料，都表現(xiàn)出不同程度的抗性，而不含任何抗性基因的陰性對照材料MM發(fā)病率和病情指數(shù)則高于其他材料；對番茄黃化曲葉病毒病表現(xiàn)為免疫的853、857、867均含有純合的Ty-1、Ty-3基因，且Ty-1和Ty-3作為一對等位基因，被認(rèn)為是抗黃化曲葉病毒病的主效基因[32]。目前，中國育種工作者育成一些抗 TYLCV 的番茄品種。這些抗病品種一般也是基于Ty-1和Ty-3抗性基因[33]。因此在 TYLCV 為害嚴(yán)重的地區(qū)應(yīng)盡量選擇含純合Ty-1和Ty-3基因的品種進(jìn)行栽培。

4 結(jié) 論

本研究從表型、生理、分子水平分析17份番茄材料在不同抗病時期的抗病表現(xiàn)并對其所含的抗性基因進(jìn)行鑒定，篩選出3個免疫材料(853、857和867)和2個高抗材料(817和842)，3個免疫材料均含有純合Ty-1、Ty-3基因且防御酶活性較其他材料高，峰值出現(xiàn)較早。番茄黃化曲葉病毒變異快，不同地區(qū)病毒種類有差異，在育種過程中還需培育多抗基因聚合品種，提高番茄對黃化曲葉病毒病的抗性，是番茄抗病育種中的一個重要研究目標(biāo)。