馬鈴薯 StMKK1基因RNAi干擾載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

陳小康,李芳芳,王文斌,單衛(wèi)星,杜 羽

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是全球第四大重要糧食作物，同時(shí)在中國(guó)也是重要的蔬菜作物[1]。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量大，在人類生活中發(fā)揮著非常重要的作用，但是生物和非生物脅迫對(duì)馬鈴薯造成的損失仍然不容忽視。隨著中國(guó)市場(chǎng)對(duì)馬鈴薯的需求不斷增加，馬鈴薯產(chǎn)量的提升、農(nóng)藝性狀的改良以及優(yōu)質(zhì)品種的選育已成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的戰(zhàn)略性目標(biāo)。然而，由于栽培馬鈴薯屬于部分異源四倍體，雜合性高，利用常規(guī)雜交育種手段很難在較短時(shí)間內(nèi)育成優(yōu)良品種，近年來(lái)人們?cè)噲D用基因工程技術(shù)對(duì)馬鈴薯品種進(jìn)行農(nóng)藝性狀改良。目前四倍體和二倍體的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系不斷被優(yōu)化，但是關(guān)于馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化仍然存在基因依賴性問(wèn)題[2-3]，對(duì)馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系的改良和優(yōu)化仍然是基因工程的重要技術(shù)改革。馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的改良和優(yōu)化包括載體的選擇和轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化，載體的選擇取決于基因的功能，一般對(duì)于基因功能的驗(yàn)證包括過(guò)表達(dá)和基因沉默，本研究主要利用RNAi載體進(jìn)行基因沉默，并獲得一種高效的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系。目前，在作物中借助RNAi載體并結(jié)合遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證基因功能的報(bào)道有很多，例如李奇科等[4]構(gòu)建了以PVY的CP為靶標(biāo)的RNAi表達(dá)載體pROKY300，實(shí)現(xiàn)了馬鈴薯Y病毒CP基因在煙草中的沉默；安然等[5]利用RNAi表達(dá)載體pCEI-PFR，通過(guò)沉默馬鈴薯Sgt1-3基因來(lái)減少塊莖糖苷生物堿積累；水稻抗旱基因OsbHLH120RNAi干擾載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化為進(jìn)一步研究OsbHLH120在水稻抗旱過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)[6]。關(guān)于利用RNAi載體在馬鈴薯中的運(yùn)用也有報(bào)道，如沉默馬鈴薯周皮層中StKCS6基因?qū)е履舅ㄙ|(zhì)和蠟化合物的鏈長(zhǎng)減少，同時(shí)增強(qiáng)表皮蒸騰作用；利用RNAi技術(shù)沉默馬鈴薯中的PVS基因，可以減少植物抗毒素的生成從而促進(jìn)致病疫霉菌的侵染；RNAi介導(dǎo)的內(nèi)源性Vlnv基因沉默可穩(wěn)定降低馬鈴薯冷誘導(dǎo)產(chǎn)生的甜味[7-9]。對(duì)馬鈴薯作物而言，目前發(fā)掘?qū)嵱们腋咝У腞NAi沉默系統(tǒng)和改良遺傳轉(zhuǎn)化體系仍然具有重要意義。

RNA沉默(RNA interference，RNAi)是指生物體內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA被特異性降解，導(dǎo)致靶標(biāo)基因被沉默，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象[10]。RNAi技術(shù)在植物體內(nèi)應(yīng)用廣泛，其原理為：將構(gòu)建的RNAi植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物體內(nèi)，形成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物dsRNA(double stranded RNA，dsRNA)，然后dsRNA被植物體內(nèi)的內(nèi)切核酸酶Dicer切割成由正義和反義序列組成的，大小為21～25nt的干擾性小dsRNA(small interfering RNA, siRNA)，由siRNAs中的反義鏈指導(dǎo)形成RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)會(huì)特異性降解與siRNA同源的靶標(biāo)mRNA，從而實(shí)現(xiàn)基因沉默[11]。

在植物中，MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)級(jí)聯(lián)途徑與生物及非生物脅迫響應(yīng)、細(xì)胞分化和發(fā)育以及激素反應(yīng)密切相關(guān)。MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由 MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)逐級(jí)傳遞，在感受刺激后，上游的 MAPKKK 首先被磷酸化并特異激活 MAPKK，MAPKK 被激活后，緊接著磷酸化并激活下游的 MAPK，MAPK 被激活后可以磷酸化下游特定的轉(zhuǎn)錄因子或相關(guān)蛋白，并調(diào)節(jié)各類應(yīng)答基因表達(dá)[12]。目前在植物中對(duì)于 MAPK 的研究報(bào)道較多，例如，AtMEKK1在水楊酸介導(dǎo)的防御反應(yīng)中和活性氧穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]，擬南芥 MKK1蛋白信號(hào)通路調(diào)節(jié)應(yīng)答效應(yīng)子的基因表達(dá)，并在病原體防御中發(fā)揮重要作用[14]。擬南芥mkk2突變體植株對(duì)鹽害的耐受性減弱，反之，過(guò)表達(dá) MKK2的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽害的耐受性增加，表明擬南芥MKK2介導(dǎo)植物對(duì)冷害和鹽害的脅迫響應(yīng)[15]。番茄SlMKK2和SlMKK4正調(diào)控番茄對(duì)灰葡萄孢的免疫反應(yīng)[16]。棉花GhMKK1通過(guò)降低PR基因的表達(dá)水平負(fù)調(diào)控棉花對(duì)青枯菌的抗性[17]。目前關(guān)于MKK1基因在擬南芥、番茄、棉花、水稻、玉米作物中的作用均有報(bào)道[14-19]，但在馬鈴薯中還未報(bào)道，MKK1作為 MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中間核心成員，在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及植物免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著非常重要的作用。本研究通過(guò)克隆AtMKK1在馬鈴薯中的同源基因StMKK1，選定StMKK1保守且特異的靶序列，利用 RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建由 CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的內(nèi)含“正向StMKK1靶標(biāo)片段-pdk intron-反向StMKK1靶標(biāo)片段”結(jié)構(gòu)的 RNAi 植物表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌將其轉(zhuǎn)入馬鈴薯品種 Desiree 中，從而獲得沉默StMKK1基因的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株。以期為馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化和技術(shù)改良提供新的思路和方法，同時(shí)為研究StMKK1在馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

四倍體馬鈴薯栽培品種Desiree來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)，組培苗于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院組培間培養(yǎng)，MS30培養(yǎng)基配方為： 4.43 g·L-1MS(粉末購(gòu)自美國(guó)Phytotech公司)+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂，培養(yǎng)條件為23 ℃ 16 h光照培養(yǎng)，光照度3 000 lx，16 ℃ 8 h黑暗培養(yǎng)。取苗齡大約5～7周生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌苗用于試驗(yàn)。試驗(yàn)所用激素：2, 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和激動(dòng)素(Kinetine)均購(gòu)自Phytotech公司，卡那霉素(Kanamycine)、萬(wàn)古霉素(Vancomycine)和塞胞霉素(Cefotaxime)均購(gòu)自索萊寶公司，萘乙酸(NAA)、6-芐基嘌呤(6-BA)、反式玉米素(trans-Zeatin-riboside)均購(gòu)自Sigma公司。R3B培養(yǎng)基配方為：4.43 g·L-1MS+30 g·L-1蔗糖，pH調(diào)至5.8后用ddH2O定容，最后加入8 g·L-1Agar，121 ℃高壓滅菌30 min，待稍冷卻后加入2.0 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-16-BA；PACM液體培養(yǎng)基配方為：4.43 g·L-1MS+30 g·L-1蔗糖+2.0 g·L-1水解酪蛋白， pH調(diào)至6.5后用ddH2O定容，121 ℃高壓滅菌30 min，待稍冷卻后加入0.5 mg·L-1激動(dòng)素和1 mg·L-12, 4-D；Zcvk固體培養(yǎng)基配方為： 4.43 g·L-1MS+20 g·L-1蔗糖，調(diào)pH至5.8后加入8 g·L-1Agar，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后加入100 mg·L-1卡那霉素、200 mg·L-1的塞胞霉素(Cefotaxime)、200 mg·L-1萬(wàn)古霉素(Vancomycine)以及1.0 mg·L-1的反氏玉米素。500 mL LB培養(yǎng)基配方為： Trptone 5 g，yeast extract 2.5 g，NaCl 5 g，Agar 3.8 g(液體培養(yǎng)基不加瓊脂)，用ddH2O 定容，高壓滅菌后使用。

所用高保真酶Fast pfu DNA polymerase、DNA聚合酶EasyTaqDNA Polymerase、連接酶T4DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶(promega)：EcoRI、KpnⅠ、XbaⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、NotⅠ等?？股兀蝴}酸壯觀霉素、利福平霉素、慶大霉素、卡那霉素。瓊脂糖、hydragreen無(wú)毒核酸染料、DNA loading Buffer、DNA marker Ⅲ(購(gòu)自天根生化科技有限公司)。PCR儀、電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD)、藍(lán)光儀(TGreen Transilluminator Plus)電穿孔儀等。

試驗(yàn)所用農(nóng)桿菌的菌株為GV3101，大腸桿菌DH5α，所用載體為PKANNIBAL和植物表達(dá)載體pART27，均來(lái)自旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方 法

1.2.1 RNAi載體構(gòu)建 根據(jù) National Center for Biotechnology Information(NCBI)和茄科數(shù)據(jù)庫(kù)(https://solgenomics.net/)上公布的StMKK1序列信息，其GeneBank號(hào)為(XM_006353485.2)，利用 Bioedit和DNAMAN 6.0 軟件比對(duì)StMKK1與其他物種的保守區(qū)段，確定特異靶標(biāo)序列，并利用 primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)來(lái)自正向靶標(biāo)序列的特異性引物StMKK1RNAi1EcoRI-F和StMKK1RNAi1KpnⅠ-R以及來(lái)自反向靶標(biāo)序列的特異性引物StMKK1RNAi1XbaⅠ-F和StMKK1RNAi1HindⅢ-R，引物序列見(jiàn)表 1。載體構(gòu)建部分參照李奇科等[4]的方法，以 Desiree 的 cDNA 為模板對(duì)正反向靶標(biāo)序列進(jìn)行克隆。反應(yīng)程序： 95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃變性 20 s，52 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 20 s，循環(huán) 35 次。在瓊脂糖凝膠中檢測(cè)，135 V恒壓30 min 電泳，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD)拍照，利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。以旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已有的通過(guò)NotⅠ酶切位點(diǎn)連接的 PKANNIBAL和 pART27 雙元重組載體 35s-pART27 為基礎(chǔ)，將質(zhì)粒 35s-pART27 進(jìn)行HindⅢ和XbaⅠ雙酶切反應(yīng)，與被HindⅢ 和XbaⅠ 雙酶切的StMKK1的反向靶標(biāo)序列進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α，得到含有反向片段的重組克隆載體，測(cè)序正確后，命名為 35s-StMKK1R-pART27。然后對(duì) 35s-StMKK1R-pART27 進(jìn)行EcoRI和KpnⅠ 雙酶切反應(yīng)，與同樣進(jìn)行EcoRI 和KpnⅠ 雙酶切的StMKK1的正向靶標(biāo)序列進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，最終得到反向重復(fù)序列的重組 RNAi 表達(dá)載體，測(cè)序正確后命名為35s-StMKK1-pART27-RNAi，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 GV3101 的農(nóng)桿菌菌株中。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌的活化：取出-80 ℃冰箱凍存的含有質(zhì)粒的GV3101農(nóng)桿菌菌株，在含有Spec(壯觀霉素)、Gen(慶大霉素)和Rif(利福平霉素)抗性的LB平板上劃線；挑取菌落到2 mL液體LB(含Spec、Gen和Rif)，在水平搖床上200 r/min 28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。待OD達(dá)到0.5后收集菌液，利用離心機(jī)2 500 g離心10 min，加入與原菌液等體積的LB重懸菌體，得到細(xì)菌轉(zhuǎn)化液。提前24 h用手術(shù)刀切2～5 mm馬鈴薯莖段作為外植體，將其轉(zhuǎn)移到R3B培養(yǎng)基中，之后在培養(yǎng)皿中加入2 張無(wú)菌濾紙以及2 mL的液體PACM進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為23 ℃， 16 h光照培養(yǎng)，光照度3 000 lx， 16 ℃ 8 h黑暗培養(yǎng))，然后將外植體轉(zhuǎn)移到細(xì)菌轉(zhuǎn)化液中，浸泡5～10 min后用無(wú)菌濾紙干燥，然后將其放回新的R3B培養(yǎng)基中，用封口膜封口，初步誘導(dǎo)愈傷組織，黑暗培養(yǎng)48 h后，將其轉(zhuǎn)到Zcvk培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織和芽分化。培養(yǎng)半個(gè)月后，更換新的Zcvk培養(yǎng)基，直到獲得轉(zhuǎn)基因植株。當(dāng)誘導(dǎo)出芽后，將其轉(zhuǎn)移到帶有卡那抗性的MS30培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選鑒定。愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%，芽誘導(dǎo)率=形成芽的愈傷數(shù)/形成愈傷的外植體數(shù)×100%，轉(zhuǎn)化率=形成芽的愈傷數(shù)/外植體總數(shù)×100%。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè) 參照Fan等[20]的方法，提取馬鈴薯擬轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA。流程為：取葉片組織0.2 g，在液氮下磨碎至粉末狀，用干凈的藥勺轉(zhuǎn)移粉末到2 mL離心管，加入800 μL提前預(yù)熱的CTAB buffer。混勻后放置65 ℃水浴中保溫30～40 min，并不時(shí)輕輕搖動(dòng)試管。冷卻至室溫后，加入約640 μL Tris-飽和酚(pH 8.0，含體積分?jǐn)?shù)為1%的2-巰基乙醇)，顛倒混勻，室溫靜置10 min。加入160 μL氯仿，充分混勻后置于冰上5 min，然后12 000 g 4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管(約1 mL)，緊接著加入640 μL的異丙醇，混勻，在-20 ℃沉淀 1 h以上，然后室溫12 000 g離心15 min，回收DNA沉淀。用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇清洗DNA，室溫12 000 g離心5 min，棄去上清液，再次離心10 s，用槍頭移去殘留液后，置超凈工作臺(tái)中干燥約2 min，將DNA溶于20 μL ddH2O。取1 μL DNA作為模板進(jìn)行PCR 檢測(cè)，并以特異引物StMKK1RNAi1KpnⅠ-R：5′-GGGGTACCTAGC- TCAGTAAGTGTTGCCAATG-3′和pKAN-F：5′-CAATCCCACTATC CTTCGCA-3′進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物由北京奧科公司合成。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次。所用體系為： 0.5 μg·μL-1DNA 模板1 μL，10×EasyTaqbuffer 2.5 μL，引物各0.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL， EasyTaqDNA polymerase 0.2 μL ，用ddH2O定容至總體積25 μL。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為302 bp左右，以未轉(zhuǎn)化Desiree植株為陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物使用10 g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株qRT-PCR檢測(cè) 植物總RNA提取完全參照Plant RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)(貨號(hào)R6827-01)進(jìn)行，完全按照TaKara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT regent kit，貨號(hào)RR047A)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。完全參照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(貨號(hào)為No.04913914001)說(shuō)明書(shū)，以25 μL體系在Life Technologies公司生產(chǎn)的Q5實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)和檢測(cè)。使用特異引物StMKK1-transgeneqpcr-F：5′-TTGCTAATCAATCACA-GAGGTG-3′和StMKK1-transgeneqpcr-R：5′-TGTCGCTTTTGTAATCATAGGC-3′。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 35s- StMKK1-pART27-RNAi載體的獲得

利用StMKK1的正反向靶標(biāo)序列的特異性引物分別擴(kuò)增得到大小為302 bp的正向干擾片段和反向干擾片段(圖1-A)，將載體重組質(zhì)粒35s-pART27進(jìn)行XbaⅠ和HindⅢ雙酶切反應(yīng)，與空質(zhì)粒相比，酶切后的質(zhì)粒條帶更大，證明載體已被線性化(圖1-B)，酶切后的35s-pART27與反向干擾片段連接并轉(zhuǎn)化，菌落PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，得到300 bp左右的目標(biāo)條帶，測(cè)序驗(yàn)證后，獲得含有反向干擾片段的重組克隆載體，命名為35s-StMKK1R-pART27(圖1-C)，然后用EcoRI和KpnⅠ分別酶切正向干擾片段和35s-StMKK1R-pART27載體(圖1-D)并連接，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示在瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)300 bp左右大小的條帶(圖1-E)，提取重組表達(dá)載體送北京奧科公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果完全正確，得到含有反向重復(fù)序列的重組RNAi植物表達(dá)載體35s-StMKK1-pART27-RNAi。并創(chuàng)建35s-StMKK1-pART27-RNAi載體的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖(圖2)。

2.2 建立基于根癌農(nóng)桿菌侵染馬鈴薯莖段的遺傳轉(zhuǎn)化體系

以馬鈴薯莖段作為外植體，在含有35s-StMKK1-pART27-RNAi質(zhì)粒的細(xì)菌轉(zhuǎn)化液中，浸泡5～10 min(圖3-A)，完成侵染后用無(wú)菌濾紙進(jìn)行外植體干燥，將其放回R3B培養(yǎng)基中用封口膜封口，黑暗培養(yǎng)48 h后，將其轉(zhuǎn)移到Zcvk培養(yǎng)基中(圖3-B)培養(yǎng)，每半月更換Zcvk培養(yǎng)基，直到獲得轉(zhuǎn)基因植株(圖3-C～圖3-F)。當(dāng)誘導(dǎo)出芽后，將其轉(zhuǎn)到帶有卡那抗性的MS30培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選鑒定，經(jīng)統(tǒng)計(jì)共切了90個(gè)莖段外植體，誘導(dǎo)出愈傷約為72個(gè)，分化不定芽約為53個(gè)，所用體系的愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)80%，芽分化率可達(dá)74%。

2.3 馬鈴薯 StMKK1轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

2.3.1 馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè) 隨機(jī)挑選經(jīng)過(guò)卡那抗生素篩選的17株馬鈴薯轉(zhuǎn)化植株提取基因組DNA，以此為模板用pKAN-F和StMKK1RNAi1KpnⅠ-R引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，以未轉(zhuǎn)化的Desiree植株作為對(duì)照，結(jié)果顯示有16株轉(zhuǎn)基因苗擴(kuò)增出302 bp左右的目標(biāo)條帶，對(duì)照Desiree沒(méi)有擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。初步證明StMKK1靶序列已整合到馬鈴薯的基因組中(圖4)。

A.目的基因的擴(kuò)增，1～2. StMKK1正向和反向干擾序列擴(kuò)增片段；B. 35s-pART27重組質(zhì)粒的HindⅢ和XbaⅠ酶切檢測(cè)，1. 重組質(zhì)粒35s-pART27，2～3.35s-pART27質(zhì)粒被HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后的條帶；C.連接反向干擾片段載體的菌落PCR檢測(cè)，1～5. 挑選的5個(gè)候選菌落；D.重組35s- StMKK1R-pART27質(zhì)粒的EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切檢測(cè)，1.重組 StMKK1反向片段質(zhì)粒35s- StMKK1R-pART27，2～3.35s- StMKK1R-pART27質(zhì)粒被EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后的條帶；E.連接正向干擾片段的菌落PCR檢測(cè)，1～8.挑選的8個(gè)候選菌落； M.DNA marker Ⅲ

CaMV35S.35s啟動(dòng)子；Noster.終止子；PDK Intron.丙酮酸磷酸雙激酶內(nèi)含子；MCS.多克隆酶切位點(diǎn)；StMKK1F.StMKK1的正向干擾片段；StMKK1R.StMKK1的反向干擾片段

2.3.2 馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測(cè) 將PCR鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的株系提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后以此為模板，對(duì)外源基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。以馬鈴薯的Stactin-7like基因(XM_006350963)作為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)馬鈴薯轉(zhuǎn)化植株葉片中StMKK1基因的表達(dá)量，結(jié)果表明：與未轉(zhuǎn)化的Desiree相比，StMKK1基因在轉(zhuǎn)基因植株(RNAi-2-RNAi12)中的表達(dá)量均顯著下降(其中RNAi-9植株除外)，降幅達(dá)到92%以上，與未轉(zhuǎn)化Desiree相比，RNAi-9植株中StMKK1基因的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異，充分證明轉(zhuǎn)基因植株中StMKK1基因的表達(dá)基本都受到一定程度的干擾(圖5)。

A.馬鈴薯莖段剛接種；B.外植體轉(zhuǎn)移到Zcvk培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織；C.轉(zhuǎn)移到Zcvk培養(yǎng)基誘導(dǎo)出不定芽；D.將芽轉(zhuǎn)移到MS30培養(yǎng)基誘根；E.生根；F.植株再生

M.DNA markerⅢ；CK.Desiree；1～20.轉(zhuǎn)基因植株的PCR擴(kuò)增條帶

3 討 論

RNAi主要過(guò)程是dsRNA被內(nèi)切核酸酶切割成21～25 nt的干擾性小RNA(siRNA)，同時(shí)由siRNA介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶mRNA分子。一般所用RNAi載體的基本構(gòu)成就是在強(qiáng)組成型啟動(dòng)子下游插入反向重復(fù)片段的重組雙元載體，是導(dǎo)致RNA沉默的基本結(jié)構(gòu)，所建成的35s-StMKK1-pART27-RNAi就是采用在基因組中產(chǎn)生反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)沉默StMKK1基因的目的。本研究利用pKANNIBAL載體兩個(gè)多克隆位點(diǎn)間的間隔序列構(gòu)建尾尾相連而導(dǎo)致基因產(chǎn)生自我互補(bǔ)的hpRNA(分子dSRNA)結(jié)構(gòu)。RNAi沉默載體中反向重復(fù)序列結(jié)構(gòu)中的間隔序列可以是任一段核酸，據(jù)相關(guān)試驗(yàn)證明[21]，間隔序列為內(nèi)含子的反向重復(fù)序列，具有良好的穩(wěn)定性，更有利于dsRNA的產(chǎn)生和RNA沉默的誘導(dǎo)。

StMKK1在野生型Desiree和8個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平

近些年來(lái)，隨著CRISPR-Cas9定點(diǎn)基因編輯技術(shù)在植物中的應(yīng)用，由于其可以進(jìn)行基因敲除(單個(gè)基因敲除，多基因敲除以及大片段缺失)以及精確的堿基編輯，轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制，逐漸成為人們使用的熱門(mén)技術(shù)[22]。在擬南芥、小麥、高粱、煙草、水稻、玉米、苔蘚植物以及地錢(qián)等植物中實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)基因組編輯的成功應(yīng)用[23]。但是在馬鈴薯上應(yīng)用的報(bào)道較少，一方面可能是由于馬鈴薯是四倍體，基因組信息復(fù)雜，數(shù)據(jù)庫(kù)信息不完整可能容易脫靶，另外一方面就是馬鈴薯CRISPR-Cas9體系仍然需要改進(jìn)和優(yōu)化，使其具有廣譜性。目前很多學(xué)者在馬鈴薯上進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化仍然使用RNAi干擾技術(shù)。本研究利用RNAi干擾技術(shù)對(duì)StMKK1基因在馬鈴薯中進(jìn)行沉默，獲得了高達(dá)92%以上的沉默效率，故所使用的RNAi載體具有高程度的干擾效率。

關(guān)于馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系的報(bào)道有很多，如在Desiree中穩(wěn)定表達(dá)StMYB44，通過(guò)抑制StPHO1的表達(dá)來(lái)負(fù)調(diào)控馬鈴薯中的Pi轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。在馬鈴薯中過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化PiSIF3可以顯著促進(jìn)致病疫霉的侵染[25]。辛翠花等[26]以Desiree的葉片和莖段為外植體，獲得了具有抗晚疫病功能的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株。使用artificial microRNA技術(shù)在馬鈴薯中沉默CBP80/ABH1基因，提高馬鈴薯的抗旱性[27]。但是關(guān)于馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系，不同的實(shí)驗(yàn)室體系有差異，其轉(zhuǎn)化條件也不一樣。即使同一材料的遺傳轉(zhuǎn)化方法也是有差異的，一般認(rèn)為馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化效率受植物的基因型、農(nóng)桿菌菌株類型、外植體類型、激素配比、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌菌液濃度等因素的影響。辛翠花等[26]研究發(fā)現(xiàn)，以馬鈴薯葉片作為外植體，愈傷誘導(dǎo)率為60%，芽分化率為50%，遺傳轉(zhuǎn)化效率為30%，明顯低于本研究以莖段作為外植體所獲得的80%愈傷誘導(dǎo)率和74%的芽分化率以及59%的遺傳轉(zhuǎn)化效率。而裴瑞芳等[28]以馬鈴薯試管薯作為侵染材料，同樣獲得馬鈴薯的轉(zhuǎn)化植株，證實(shí)馬鈴薯的多個(gè)組織均可以被用作侵染材料從而獲得轉(zhuǎn)化植株。安然等[5]以馬鈴薯品種‘莊薯3號(hào)’和Favorita 組培苗作為侵染材料，以莖段作為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，所用激素與本研究大致相同，獲得了60.23%的芽分化率，而本研究以四倍體栽培種Desiree組培苗作為侵染材料，獲得了74%的芽分化率，但獲得轉(zhuǎn)化植株從宏觀角度顯示馬鈴薯品種不同轉(zhuǎn)化效率也是不一致的。本研究利用常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，以莖段作為外植體，農(nóng)桿菌的侵染濃度為OD=0.5，侵染時(shí)間為7 min，PACM培養(yǎng)基用來(lái)輔助侵染和預(yù)培養(yǎng)，利用R3B培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，Zcvk培養(yǎng)基誘導(dǎo)芽分化。轉(zhuǎn)化周期為90 d左右，經(jīng)統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出愈傷約為72個(gè)，分化不定芽約為53個(gè)，所用體系的愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)80%，芽分化率可達(dá)74%，轉(zhuǎn)化率可達(dá)59%。所以本研究所用的馬鈴薯轉(zhuǎn)化體系效率是較高的。

本研究轉(zhuǎn)化了一個(gè)馬鈴薯絲裂原活化蛋白激酶StMKK1，關(guān)于MKK蛋白在生物和非生物脅迫中的研究有很多，MAPKK可以被上游的促絲裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶激酶(MAPKKK)磷酸化其保守區(qū)域中絲/蘇氨酸殘基從而激活MAPKK，同時(shí)也可以磷酸化下游MAPK第七和第八亞結(jié)構(gòu)域之間的絲/蘇氨酸和酪氨酸殘基從而激活MAPK[29]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和植物免疫調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得StMKK1的轉(zhuǎn)基因植株，為后期解析其調(diào)控植物免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究以Desiree莖段作為外植體，構(gòu)建融合StMKK1基因反向重復(fù)序列的RNAi表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌侵染的遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得了馬鈴薯絲裂原活化蛋白激酶StMKK1沉默的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株中，StMKK1基因表達(dá)量的降幅大于92%。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究StMKK1基因在馬鈴薯響應(yīng)脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用奠定基礎(chǔ)。