EDTA與EM復(fù)合菌劑聯(lián)合對鉛脅迫下黑麥草種子萌發(fā)、幼苗生長及鉛吸收的影響

周紅艷 陳麗珊 朱 瑛

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 福建福州 350119）

隨著我國工農(nóng)業(yè)化的快速發(fā)展，鉛污染日益嚴(yán)重，對人類生存和健康造成了嚴(yán)重影響，已成為當(dāng)今急需解決的重要環(huán)境問題。

植物修復(fù)技術(shù)已為環(huán)境中重金屬修復(fù)開辟了新的途徑，因其具有原位、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、二次污染小等優(yōu)點而被廣泛采用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，草坪草作為應(yīng)用較廣的綠化植物，具有生長快、適應(yīng)性強(qiáng)、生物量大、抵抗力和固土力強(qiáng)的特點。因而對重金屬污染地區(qū)的污染修復(fù)，較其他物種更易達(dá)到去除效果，且吸收的重金屬更多，處理效率更高[2]。

植物提取修復(fù)技術(shù)主要通過收獲富集重金屬的植物而將重金屬帶出，從而降低環(huán)境中的重金屬含量。但是植物修復(fù)技術(shù)主要受限于植物生物量小、生長速度慢和重金屬有效性低而無法被植物吸收利用等問題[3]。若向土壤中添加人工合成的螯合劑，則可以活化污染土壤中的重金屬，增加土壤溶液中重金屬濃度。大量研究表明，可以通過物理、化學(xué)、微生物等輔助措施克服其修復(fù)過程中的限制因素，從而有效提高植物修復(fù)效率；螯合劑能不同程度地活化土壤中的重金屬并促進(jìn)植物對其超量吸收[4,5]。螯合劑的劑量，使用方式、施用階段等都成為研究的熱點。楊卓通過盆栽試驗研究乙二胺四乙酸（EDTA）對印度芥菜修復(fù)鎘污染土壤的增效作用，研究表明，EDTA 的施入使得芥菜吸收鎘的量明顯增加[6]。白薇揚(yáng)研究生物螯合劑EDDS 與非生物螯合劑EDTA聯(lián)合施用對玉米和油料作物重金屬鉛、銅、鎘的富集程度，表明螯合劑能夠增加植物中重金屬的富集，不同配比的生物螯合劑與非生物螯合劑效果不同[7]。EDTA可以阻止金屬的沉淀，使大量的重金屬進(jìn)入土壤溶液，同時，以金屬螯合物的形式保護(hù)金屬不被土壤重新吸附[8]。Luo C 等研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中添加EDTA 48 小時后，污染土壤中溶解性的銅、鋅、鉛、鎘含量分別比對照增加了102 倍、496 倍、114 倍和5 倍[9]。

降低重金屬對植物毒性和提高植物對重金屬的耐性，從而提高植物生物量是增強(qiáng)植物進(jìn)行重金屬修復(fù)的重要途徑。EM 復(fù)合菌劑是日本琉球大學(xué)比嘉照夫教授研制出來的一種復(fù)合微生物制劑，由光合菌、乳酸菌、酵母菌等 80 多種厭氧性或嫌氧性微生物復(fù)合培養(yǎng)而成，不含任何化學(xué)有害物質(zhì)，不污染環(huán)境。對于EM 復(fù)合菌劑降低動植物內(nèi)重金屬已有較多報道。施用EM 復(fù)合菌劑可以達(dá)到對低濃度重金屬污染土壤進(jìn)行微生物修復(fù)、降低重金屬含量、促進(jìn)植物生長、提高植物抗性的目的[10-14]。梁小迪等采用盆栽試驗方法，研究了耐性細(xì)菌與活化劑（有機(jī)肥、EDTA、黃腐酸、檸檬酸）對黑麥草吸收鎘的影響，耐鎘菌劑與活化劑可提高鎘生物有效性、提高黑麥草對鎘污染土壤的生物修復(fù)效果，具有較好的應(yīng)用推廣前景[15]?？梢?，采用EM 復(fù)合菌劑與非生物螯合劑EDTA共同誘導(dǎo)植物修復(fù)重金屬污染是一個值得探討的問題。

為此，本研究將探討EM 復(fù)合菌劑與非生物螯合劑EDTA 聯(lián)合施用對鉛脅迫下黑麥草種子萌發(fā)、幼苗生長及鉛吸收的影響。但至今為止，利用EM 復(fù)合菌劑與非生物螯合劑EDTA聯(lián)合施用對鉛污染的黑麥草修復(fù)效應(yīng)方面的研究應(yīng)用國內(nèi)鮮見報道。且目前大部分種子萌發(fā)階段的研究都只是對于種子幼苗生長、發(fā)芽率等的研究，對重金屬吸收情況研究極少，EM 復(fù)合菌劑與非生物螯合劑EDTA 之間是否存在交互作用尚不清楚。為了更好地將生物與非生物措施相配合，因此開展了EM 與EDTA 聯(lián)合修復(fù)鉛的研究，旨在為合理進(jìn)行植物—微生物—化學(xué)聯(lián)合修復(fù)重金屬污染提供技術(shù)支撐和科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 供試材料

由千聚源種業(yè)公司提供黑麥草種子，江西天意生物技術(shù)有限公司提供EM 復(fù)合菌劑，天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司提供EDTA（乙二胺四乙酸二鈉鹽）。

1.2 種子培養(yǎng)與試驗設(shè)計

1.2.1 種子培養(yǎng)

選取直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿，以相應(yīng)大小的二層濾紙作為發(fā)芽床，將配制好的不同濃度EM 溶液和EDTA 溶液倒入培養(yǎng)皿，對照（CK）不加EDTA 和EM，用水替代，保證每個培養(yǎng)皿內(nèi)硝酸鉛濃度為200 μg/mL。每日稱重法加水至恒重，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照、黑暗周期分別為16 h、8 h。每個培養(yǎng)皿放入100 粒種子（試驗前將黑麥草種子用0.5%次氯酸鈉消毒1 h，用無菌水沖洗干凈，濾紙吸干，挑選顆粒飽滿的種子）。

1.2.2 試驗設(shè)計

試驗按2 因素3 水平隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。因素1 為EM 溶液濃度，設(shè)低、中、高3 個水平，分別為EM0（0）、EM1（450 倍）、EM2（150 倍），表3中用E0、E1、E2 表示。因素2 為螯合劑EDTA 溶液濃度，設(shè)低、中、高3 個水平，分別為EDTA0（0）、EDTA1（5 mmol/L）、EDTA2（10 mmol/L）），表3中用A0、A1、A2 表示。共設(shè)9 個處理，每個處理設(shè)置3 個重復(fù)。2 因素水平如表1所示。

表1 因素及其水平

1.3 種子發(fā)芽、幼苗生長統(tǒng)計方法

每天觀察生長情況，第十天統(tǒng)計發(fā)芽率 （胚根長須達(dá)到種子長度一半才能計入）、第三天統(tǒng)計發(fā)芽勢。

發(fā)芽率=（第10 天正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100 %。發(fā)芽勢=（第3 天正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100 %。第10 天測量幼苗的根長、芽長，每個培養(yǎng)皿隨機(jī)選取10 株測定取平均值，地上部鮮重每個處理取地上部分分別稱重。

1.4 鉛含量原子吸收分光光度測定法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用10 μg/mL 硝酸鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為0 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、3.00 μg/mL、4.00 μg/mL、5.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照液體類樣品鉛含量檢測國標(biāo)GB5009.12—2017 第三法火焰原子吸收法，用MIBK 萃取鉛導(dǎo)入火焰原子吸收分光光度計進(jìn)行測定，按濃度與吸光度對應(yīng)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為y=0.0245 x+0.0362 。

1.4.2 樣品測定與儀器條件

第十天每個培養(yǎng)皿吸取0.3 mL 溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同方法進(jìn)行鉛含量檢測。使用TAS-990 F 北京普析火焰原子吸收分光光度計，儀器工作條件如下：燃?xì)饨M成為空氣-乙炔；檢測波長為283.3 nm；燈電流為2 mA；乙炔流量為1 200 mL/min；空氣流量為8 L/min。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗所得數(shù)據(jù)用Excel 2016 進(jìn)行初步處理，用SPSS 軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，P＜0.05 表示差異達(dá)顯著水平，P＜0.01 表示差異達(dá)極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

表2 不同指標(biāo)方差分析F 值

從表2可以看出，EM 復(fù)合菌劑與螯合劑EDTA 單因子及二因子（EM×EDTA）互作對黑麥草（芽長、根長、鮮重）和發(fā)芽勢、發(fā)芽率、鉛含量影響達(dá)顯著（P＜0.05）和極顯著水平（P＜0.01）（除EM×EDTA 對發(fā)芽勢影響差異不顯著外）。EM×EDTA 處理組合產(chǎn)生互作效應(yīng)，下面進(jìn)行單因素及二因子互作效應(yīng)分析。

2.1 不同EM 與EDTA 處理濃度對鉛脅迫下黑麥草芽長、根長、鮮重、發(fā)芽勢、發(fā)芽率和鉛含量影響的單因素效應(yīng)

由圖1至圖6可以看出，不同濃度EM 處理對黑麥草芽長、根長、鮮重、發(fā)芽勢、發(fā)芽率的影響均以稀釋150 倍處理最大，且3 種濃度EM 處理水平均呈EM1 （150 倍）＞EM2（450 倍）＞EM0（0，CK）的變化趨勢，鉛含量表現(xiàn)趨勢相反。其中EM1 （150 倍）處理與EM2（450 倍）、EM0（0，CK）處理間差異分別達(dá)極顯著水平P＜0.01。EM1（150 倍）處理與EM0 對照相比，芽長、根長、鮮重、發(fā)芽率增幅分別達(dá)18.7%、34.5%、44.4%、31.7%，鉛含量下降了16 %。說明使用EM 菌劑促進(jìn)了黑麥草種子的萌發(fā)與生長，同時使得鉛濃度下降，有利于環(huán)境中鉛的修復(fù)。

不同濃度EDTA 處理對黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響可以從芽長、根長、鮮重、發(fā)芽勢、發(fā)芽率上反映出來，方差分析結(jié)果表明處理間差異達(dá)顯著P＜0.05或極顯著水平P＜0.01?？傮w表現(xiàn)呈EDTA2（10 mmol/L）＜EDTA1（5 mmol/L）＜EDTA0（0，CK）的變化趨勢，鉛含量變化趨勢與之相反。EDTA 濃度越高對黑麥草的生長及發(fā)芽率抑制越大。這與其活化鉛的程度密切相關(guān)。當(dāng)EDTA 濃度為5 mmol/L 時，與對照相比，芽長、根長、鮮重、發(fā)芽率抑制分別達(dá)63.3%、63.8%、74.0%、40.5%，當(dāng)EDTA 濃度為10 mmol/L 時，芽長、根長、鮮重、發(fā)芽率抑制分別達(dá)82 %、92 %、92.7%、63.5%。鉛含量比對照分別增加了3.39 倍、6.82 倍。當(dāng)EDTA 濃度為10 mmol/L 時，根長、鮮重極顯著下降，其中根長只有0.27 cm，與對照3.37 cm相比較下降了11.5 倍，鮮重下降了12.8 倍，表現(xiàn)出明顯的鉛危害。因為根是植物體絡(luò)合重金屬重要的部位，也是最易受重金屬毒害的部位。根據(jù)前人的研究，植物的根系和地上生物量的積累有利于吸收重金屬，根長的變化可作為植物受重金毒性影響的一個重要指標(biāo)[17]?？梢娫贓DTA 濃度為10 mmol/L 時抑制過大。在本試驗條件下，EDTA 濃度在5 mmol/L 時，相對有利于鉛的吸收，從而達(dá)到更好的修復(fù)效果。

2.2 EM 與EDTA 互作對鉛脅迫下黑麥草芽長、根長、鮮重、發(fā)芽勢、發(fā)芽率以及鉛含量的影響

從表3數(shù)據(jù)可以看出，在同一E（EM）水平下，不同濃度A(EDTA)處理間達(dá)極顯著水平（P＜0.01），其濃度越高，對黑麥草的生長及發(fā)芽率抑制越大，重金屬活化程度也越高。雖然A2（10 mmol/L）水平重金屬活化達(dá)到最大，但是根長、鮮重等與對照相比抑制都達(dá)到了十幾倍。A1（5 mmol/L）水平與A2（10 mmol/L）水平相比，在相同EM 水平下重金屬濃度活化程度雖然下降1 倍多，但是芽長、根長、鮮重、發(fā)芽率指標(biāo)均在2～5 倍之間增長，植物根系與地上生物量是吸收重金屬的重要部位，所以EDTA濃度應(yīng)適當(dāng)控制在相對合理的濃度，否則不利于植物生長，影響重金屬的吸收。

表3 相同EM 水平下，不同EDTA 濃度處理對鉛脅迫下黑麥草芽長、根長、鮮重、發(fā)芽勢、發(fā)芽率和鉛含量的影響

對于同一A（EDTA）水平下，不同E（EM濃度）處理對鉛脅迫下黑麥草芽長、根長、鮮重、發(fā)芽勢、發(fā)芽率的影響（見表3）總體呈E1＞E2＞E0 的變化趨勢，而鉛含量呈相反的變化趨勢。說明EM 濃度150 倍的條件下，對黑麥草芽長、根長、鮮重、發(fā)芽勢、發(fā)芽率的影響差異最大。EM 與EDTA 聯(lián)合使用與單獨使用EDTA 相比，都能夠促進(jìn)黑麥草生長和種子萌發(fā)。兩種制劑綜合作用，使得重金屬濃度下降，從而減輕了重金屬對黑麥草的毒害作用，有利于重金屬污染的修復(fù)。

3 結(jié)論

綜上所述，使用EM 復(fù)合菌劑可明顯促進(jìn)黑麥草種子的萌發(fā)與幼苗生長，從而更好吸收溶液中的鉛，150 倍濃度的EM 有利于環(huán)境中鉛的吸收。EDTA 濃度越高重金屬活化程度越高，但是對黑麥草的生長及發(fā)芽率抑制也越大。根系與地上生物量作為吸收重金屬的重要部位應(yīng)考慮其生長受抑制程度，在本試驗條件下，EDTA 濃度5 mmol/L 為相對合理的濃度，濃度不宜超過10 mmol/L，否則可能對植物生長和重金屬修復(fù)帶來不利影響。EM 與EDTA 產(chǎn)生明顯的交互作用，兩者的合理配合使用，能緩解重金屬對黑麥草的毒害作用，有利于重金屬污染的修復(fù)。綜合考慮，以噴施150 倍EM 菌劑及5mmol/L 的EDTA 混合劑處理效果最佳。

黑麥草的苗期生長與其生理響應(yīng)息息相關(guān)，進(jìn)一步分析植物體內(nèi)重金屬的變化可以更加清楚了解重金屬的動態(tài)變化及產(chǎn)生的生理機(jī)制。但是本研究在苗期階段受到重金屬脅迫部分處理樣品量不足，后續(xù)應(yīng)通過盆栽及田間種植等進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 討論

在本實驗中，EM 菌劑可以促進(jìn)黑麥草的生長和種子的萌發(fā)，溶液中鉛濃度下降，說明使用EM 復(fù)合菌劑可以達(dá)到鉛污染的微生物修復(fù)目的，這可能與黑麥草地下部和地上生物量的增加有關(guān)。植物生物量低，特別在種子萌發(fā)期生長緩慢，對鉛的耐受性有限。通過植物促生菌可促進(jìn)植物生長，提高植物耐受性，從而達(dá)到重金屬污染修復(fù)的目的，這與前人的觀點一致[18,19]。

作為一種被廣泛應(yīng)用的重金屬植物—微生物—化學(xué)聯(lián)合修復(fù)方法，黑麥草對重金屬的富集能力有限。而EDTA可以在不同程度活化重金屬的同時誘導(dǎo)植物對重金屬的超量吸收[20]。不過濃度過高也可能抑制植物生長，對重金屬污染修復(fù)產(chǎn)生不利[21]。因此，本實驗中對黑麥草生長中同時使用增強(qiáng)重金屬耐性的EM 復(fù)合菌，試驗可行且具有一定的創(chuàng)新性，為進(jìn)一步進(jìn)行盆栽及大規(guī)模試驗提供理論支撐。但是，雖然誘導(dǎo)植物提取重金屬的研究在實踐應(yīng)用中擁有很好的潛力，且生態(tài)風(fēng)險相對更小，但仍應(yīng)充分考慮到EDTA對重金屬的植物修復(fù)受各種因素的影響，如植物品種、環(huán)境中重金屬污染狀況和其本身特性，以及EDTA的過量使用可能造成的二次污染等。與此同時，對于能促進(jìn)黑麥草對重金屬鉛吸收的微生物，應(yīng)加強(qiáng)EM 復(fù)合菌群中更多功能菌的篩選和功能特點的深入研究，從而建立一條有效的植物—微生物—化學(xué)修復(fù)重金屬污染途徑。