胸腔積液生物標(biāo)志物對(duì)結(jié)核性和惡性胸腔積液的鑒別價(jià)值

胡 克， 胡衛(wèi)華

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)二科，湖北 武漢 430060）

胸腔積液是一種常見的胸部疾病或并發(fā)癥，可因多種疾病狀態(tài)所致。 病因上，可為原發(fā)胸膜的疾病，也可繼發(fā)于心、肝、腎、肺、縱隔、脾、卵巢、結(jié)締組織病以及血液系統(tǒng)等疾病； 疾病類型包括腫瘤、感染性疾病、器官功能障礙和全身性疾病等，其中心力衰竭、惡性腫瘤、肺炎和結(jié)核所致胸腔積液占所有病例的3/4。 根據(jù)Light 標(biāo)準(zhǔn)，胸腔積液可分為滲出性和漏出性胸腔積液（分別簡(jiǎn)稱為滲出液和漏出液）。漏出液患者多存在全身嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，如充血性心力衰竭、肝硬化、腎病綜合征、心包疾病等；滲出液的病因則更為復(fù)雜，以結(jié)核性胸腔積液（tuberculous pleural effusion，TPE） 和惡性胸腔積液（malignant pleural effusion，MPE）最為常見。 在以淋巴細(xì)胞為主的滲出液中，TPE 和MPE 是2 種最常見的病因，兩者不僅生化及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果近似，而且臨床表現(xiàn)也可相似，但治療與預(yù)后相差巨大，對(duì)此正確鑒別甚為重要。

TPE 與其他病因所致胸腔積液尤其是與MPE的鑒別一直是臨床難點(diǎn)。 診斷MPE 的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍需依靠細(xì)胞學(xué)（在胸腔積液中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞）或組織病理學(xué)（胸膜活檢標(biāo)本發(fā)現(xiàn)相應(yīng)病變），但需要獲取合適標(biāo)本。雖然內(nèi)科胸腔鏡是診斷胸腔積液病因最有價(jià)值的方法，但存在活檢標(biāo)本小、有創(chuàng)性及多種并發(fā)癥等缺點(diǎn)；而對(duì)胸腔積液進(jìn)行分析是研究其病因最簡(jiǎn)單易行的方法。 目前可用于診斷TPE 的主要標(biāo)志物有腺苷脫氨酶 （adenosine deaminase，ADA）、γ-干擾素 （interferon γ，IFN-γ）、白介素-27（interlukine 27，IL-27）、IL-33 等；而診斷 MPE 的標(biāo)志物雖有多種，但常因缺乏足夠敏感性或特異性而使其臨床應(yīng)用受限， 探索可鑒別TPE 和MPE 的胸腔積液新型標(biāo)志物始終是臨床追求的目標(biāo)。

胸腔積液生物標(biāo)志物對(duì)TPE和MPE的鑒別價(jià)值

一、TPE 生物標(biāo)志物

目前公認(rèn)診斷TPE 的“金標(biāo)準(zhǔn)”是在胸腔積液中找到結(jié)核桿菌，或胸膜活檢組織學(xué)可見典型干酪樣結(jié)核性病理改變。不過胸膜結(jié)核是細(xì)菌學(xué)檢出率很低的一種疾病，而這種局限性突顯了胸腔積液中標(biāo)志物對(duì)TPE 診斷的重要性，具有較高診斷價(jià)值的胸腔積液標(biāo)志物包括ADA 以及與之診斷價(jià)值相當(dāng)?shù)?IFN-γ 和 IL-27。

1.ADA：目前臨床上使用最廣泛的是ADA，一種主要的T 淋巴細(xì)胞酶。 最近發(fā)表的包括16 項(xiàng)研究、共4 147 例患者的薈萃分析結(jié)果表明，ADA 對(duì)診斷TPE 的靈敏度為93%，特異度為92%[1]。ADA＞35 U/L 被認(rèn)為存在結(jié)核感染； 老年患者的ADA 水平可能偏低，而細(xì)菌性胸膜炎（尤其是并發(fā)的肺炎旁胸腔積液和膿胸） 以及淋巴瘤所致胸腔積液中ADA 水平可能升高。 檢測(cè)胸腔積液中ADA 的主要同工酶ADA2，可提高診斷TPE 的特異性[2]；不過，由于對(duì)ADA2 的檢測(cè)方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化，因此并未在臨床上廣泛應(yīng)用。

2.IFN-γ：IFN-γ 是由 T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要細(xì)胞因子， 反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ 對(duì)TPE 患者的檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于非結(jié)核患者[3]。 包括 2 883 例患者、共 22 項(xiàng)研究的一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示， IFN-γ 對(duì)TPE 的檢測(cè)靈敏度和特異度分別為89%和97%， 曲線下面積（area under curve，AUC） 為 0.99[4]，但檢測(cè)成本高以及未被廣泛接受的最佳診斷界值是該項(xiàng)檢測(cè)的局限性。 同時(shí)，IFN 釋放試驗(yàn)（interferon release assays，IGRAs）是測(cè)定由特定分枝桿菌抗原刺激T 淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ，但對(duì)TPE 的診斷價(jià)值并不大。 在一項(xiàng)包括14 項(xiàng)研究、932 例TPE 患者的薈萃分析中，胸腔積液IGRAs [結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（TSPOT.TB）或QuantiFeron 試驗(yàn)]的靈敏度和特異度分別僅為72%和78%[5]。

3.IL-27：IL-27 作為 IL-12 家族新成員，近年來引起了研究者的濃厚興趣，尤其是我國(guó)學(xué)者。 IL-27是一種由EB 病毒誘導(dǎo)基因3 和p28 亞基組成的異二聚體細(xì)胞因子[6]，主要由抗原提呈細(xì)胞分泌，通過對(duì)免疫反應(yīng)的雙重促炎和抗炎作用調(diào)節(jié)多種免疫疾病。 我國(guó)學(xué)者認(rèn)為IL-27 可能參與胸腔積液的形成，并在結(jié)核分枝桿菌引發(fā)的免疫反應(yīng)中起重要作用，具有一定的診斷價(jià)值[7]。迄今有3 項(xiàng)關(guān)于檢測(cè)IL-27 對(duì)TPE 診斷價(jià)值的薈萃分析，其中最全面的一項(xiàng)包括7 項(xiàng)研究（大部分來自我國(guó)）、共1 157 例胸腔積液患者。結(jié)果顯示，IL-27 對(duì)TPE 的診斷靈敏度為 93.8%，特異度 91.7%[8]。 但與 IFN-γ 相同的問題是，需要確定IL-27 的最佳診斷界值。

4.IL-33：IL-33 在上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)，細(xì)胞損傷后釋放，在各種感染性和炎性疾病所致?lián)p傷中起重要作用。其生物學(xué)功能包括維持組織穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)由輔助性 T 細(xì)胞 1（helper T cell 1，Th1）和Th2 介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)， 并在慢性炎癥過程中介導(dǎo)纖維化。惡性腫瘤引起上皮細(xì)胞IL-33 表達(dá)下調(diào)， 而在腫瘤間質(zhì)和血清中IL-33 表達(dá)上調(diào)[9]。Al-Aarag 等[10]檢測(cè)117 例原因不明胸腔積液患者胸腔積液中的IL-33， 發(fā)現(xiàn)TPE 組IL-33 濃度明顯高于 MPE 組（P＜0.001），而血清中 IL-33 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 取胸腔積液中IL-33 水平＞19.16 ng/L作為界值，診斷靈敏度為91.7%，特異度為96.4%；以胸腔積液/血清 IL-33 ＞1.4 作為診斷 TPE 的界值，則靈敏度為91.7%，特異度100%。 目前已有多項(xiàng)研究顯示IL-33 在鑒別TPE 與MPE 中的意義，并顯示出高靈敏度和特異度， 但樣本量均較小，診斷界值也不一致，因此目前尚未得到廣泛接受。

5.其他標(biāo)志物： IL-31 是IL-6 細(xì)胞因子家族成員，主要參與機(jī)體炎性反應(yīng)。 Gao 等[11]發(fā)現(xiàn)TPE 患者血漿中 IL-31 水平高于 MPE 患者 （P=0.000 2）；以23.9 pg/mL 為界值， 診斷TPE 的靈敏度和特異度分別為92.9%和85.7%； 聯(lián)合檢測(cè)胸腔積液及血漿結(jié)核特異性IL-31 水平，靈敏度和特異度分別提高到94.0%和95.1%。 因而認(rèn)為IL-31 是一種新的TPE 標(biāo)志物。

一些研究者還探討了IL-2[12]、結(jié)核分枝桿菌合成的外分泌蛋白Ag85A[13]、趨化因子-10 及單核細(xì)胞趨化因子-1[14]等在鑒別TPE 與其他病因所致胸腔積液中的作用，但因研究規(guī)模小、靈敏度和特異度差異大等因素而未被廣泛接受。

二、MPE生物標(biāo)志物

對(duì)MPE 的確診主要依靠細(xì)胞學(xué)及病理學(xué)。 胸腔積液中細(xì)胞檢出率受腫瘤類型等多種因素的影響，通常MPE 細(xì)胞學(xué)陰性率可達(dá)40%，而在間皮瘤和鱗狀細(xì)胞癌則高達(dá)70%～85%[15-16]。為提高對(duì)MPE的診斷，以可溶性蛋白為基礎(chǔ)、免疫細(xì)胞化學(xué)法及主要基于核酸檢測(cè)的腫瘤分子標(biāo)志物已逐步應(yīng)用于臨床。

1.乳酸脫氫酶 （lactic dehydrogenase，LDH）：LDH 廣泛存在于人體組織內(nèi)， 當(dāng)組織受損時(shí)，LDH可釋放入血。 MPE 中 LDH 水平可顯著升高，當(dāng)LDH≥1 000 U/L，且胸腔積液 LDH/血清LDH＞1.0時(shí)，應(yīng)高度懷疑MPE。

2.癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）與糖鏈抗原（carbohydrate antigen，CA）：最早且使用最廣泛的標(biāo)志物是CEA 和CA15-3，但兩者的診斷特異性并不高，且診斷界值較高；臨床上為排除由其他原因所引起的異常，只在這些指標(biāo)高于參考范圍上限的數(shù)倍時(shí)才考慮腫瘤可能。最近一項(xiàng)研究評(píng)價(jià)了1 575 例非化膿性滲出性胸腔積液患者胸腔積液中CEA 和CA15-3 水平的診斷準(zhǔn)確性，以特異度100%為界值， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，41%患者 CEA＞45 ng/mL，40%患者 CA15-3＞77 U/L，60%患者為兩者之一[17]。CA12-5、CA19-9、細(xì)胞角蛋白 19 片段抗原 21-1（cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA 21-1）（細(xì)胞角蛋白19 的一個(gè)片段）是另外3 種可溶性蛋白質(zhì)標(biāo)志物。 2008 年Liang 等[18]就腫瘤標(biāo)志物對(duì)MPE 的診斷準(zhǔn)確率進(jìn)行薈萃分析， 發(fā)現(xiàn)CA12-5、CA15-3、CA19-9 和 CYFRA21-1 的 靈 敏 度 分 別 為0.48、0.51、0.25 和 0.55， 特異度分別為 0.85、0.96、0.96 和 0.91； 提示檢測(cè) CA12-5 和 CA19-9 水平對(duì)MPE 的診斷價(jià)值有限， 而 CA15-3 和 CYFRA21-1的診斷效果更佳。2015 年 Nguyen 等[19]對(duì) 49 項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物在MPE 中的診斷價(jià)值進(jìn)行薈萃分析， 認(rèn)為CYFRA、CA12-5 靈敏度更高 （分別為 0.625、0.575），但特異度均不高。上述兩項(xiàng)薈萃分析均認(rèn)為聯(lián)合檢測(cè)2 種或2 種以上腫瘤標(biāo)志物可提高對(duì)MPE 的診斷價(jià)值。 2017 年Yang 等[20]對(duì)聯(lián)合檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物在MPE 中的診斷準(zhǔn)確性進(jìn)行薈萃分析， 認(rèn)為對(duì)于未確診胸腔積液患者，聯(lián)合檢測(cè)CEA + CA15-3 陽(yáng)性與CEA + CA19-9 陽(yáng)性宜高度懷疑胸腔惡性腫瘤，但檢測(cè)敏感性較低。

3.神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）：NSE 是糖酵解烯醇酶 γ-亞基， 由神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞以及神經(jīng)源性腫瘤分泌，NSE 被認(rèn)為是小細(xì)胞肺癌的生物標(biāo)志。Saba 等[21]探討了聯(lián)合檢測(cè)NSE 和CA15-3 對(duì)MPE 的診斷價(jià)值， 結(jié)果顯示檢測(cè)血清 NSE 的靈敏度為 75.0%， 特異度為69.4%；胸腔積液中NSE 的靈敏度為75.0%，特異度為73.5%；聯(lián)合檢測(cè)血清與胸腔積液中NSE、CA15-3 的靈敏度最高為93.2%， 最低47.7%。 胸腔積液NSE 的診斷準(zhǔn)確率為74.2%，診斷效價(jià)最高。 在一項(xiàng)包括49 種腫瘤標(biāo)志物對(duì)MPE 診斷價(jià)值的薈萃分析中，NSE 對(duì)MPE 的診斷靈敏度和特異度分別為0.613 和 0.884[21]。 雖然NSE 對(duì)于小細(xì)胞肺癌的診斷具有一定意義，但確診依然以組織病理學(xué)結(jié)果為主。

4.鱗狀上皮細(xì)胞癌 （squamous cell carcinoma，SCC） 抗原：SCC 抗原是腫瘤相關(guān)抗原 TA-4 的亞型，是一種糖蛋白，存在于子宮、宮頸、肺、頭頸等SCC 的細(xì)胞漿中，特別在非角化癌細(xì)胞中的含量更豐富，在臨床上常被用于肺鱗癌、宮頸癌、食管癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌的診斷。 近年來單獨(dú)檢測(cè)SCC 抗原的研究較少，通常與其他多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)來診斷MPE。 Gu 等[22]探討了聯(lián)合檢測(cè)MPE 患者血清及胸腔積液中多種腫瘤標(biāo)志物的水平，結(jié)果顯示血清中SCC 抗原的界值為0.85 ng/mL，胸腔積液中SCC 抗原的界值為1.35 ng/mL， 血清SCC 抗原/胸腔積液 SCC 抗原為 0.9， 胸腔積液 CEA/血清CEA 的特異度和靈敏度最高， 分別為97.14%和61.05%。 國(guó)內(nèi)甘潔民等[23]檢測(cè)88 例肺部惡性疾病、132 例肺部良性疾病患者和128 名健康對(duì)照者血清SCC 抗原， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺部良、惡性疾病組血清SCC 抗原水平均有不同程度升高，以肺鱗癌組最高（陽(yáng)性率76%），其次為肺炎組。SCC 抗原在肺炎、腎功能不全、皮膚病等疾病均可升高，因此特異性并不強(qiáng)，在將SCC 抗原用于SCC 的輔助診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷時(shí)要注意排除上述疾病或與之相鑒別。

5.細(xì)胞因子：當(dāng)機(jī)體胸膜發(fā)生病變后可導(dǎo)致細(xì)胞因子發(fā)生變化[24]，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 及內(nèi)皮抑素被認(rèn)為是腫瘤血管生成過程中最重要的調(diào)控因子。VEGF 通過刺激腫瘤血管生成、激活宿主血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)惡性增殖等功能參與腫瘤生長(zhǎng)的全過程； 而內(nèi)皮抑素則可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，破壞腫瘤血管結(jié)構(gòu)，抑制腫瘤生長(zhǎng)。VEGF 及內(nèi)皮抑素在MPE 患者胸腔積液中含量較高，是具有重要診斷價(jià)值的標(biāo)志物。 與非MPE 相比，MPE 患者胸腔積液中VEGF 水平較良性胸腔積液患者升高1.93 ng/mL[25]。 內(nèi)皮抑素診斷MPE 的靈敏度和特異度分別為51.92%和 85.94%，AUC 為 0.747。 聯(lián)合應(yīng)用內(nèi)皮抑素和CEA 可提高M(jìn)PE 的診斷能力[26]。

6.DNA 倍體： 脫落細(xì)胞學(xué)是臨床上常用的鑒別胸腔積液良惡性的診斷方法， 但陽(yáng)性率較低，而DNA 倍體診斷MPE 的準(zhǔn)確率高于脫落細(xì)胞學(xué)。 國(guó)外已于20 世紀(jì)70 年代得出 “DNA 異倍體是惡性腫瘤高度特異性標(biāo)志”這一結(jié)論。近年來研究顯示，DNA 倍體聯(lián)合多種腫瘤標(biāo)志物可提高診斷準(zhǔn)確性。 MPE 中微小 RNA-21（miR-21）和 miR-24 的表達(dá)明顯高于良性胸腔積液，DNA 倍體聯(lián)合miR-21及DNA 倍體聯(lián)合miR-24 均能顯著提高M(jìn)PE 診斷特異度和靈敏度[27]。 國(guó)內(nèi)有研究使用圖像分析儀診斷MPE 的DNA 倍體具有較高的靈敏度和特異度，DNA 倍體聯(lián)合CEA 和血清蛋白鐵也可提高診斷價(jià)值[28]。

7.胸膜間皮瘤相關(guān)生物標(biāo)志物：間皮瘤是指起源于間皮細(xì)胞的一類疾病，可發(fā)生于胸膜、腹膜和心包等組織，胸膜間皮瘤由于胸腔積液中細(xì)胞學(xué)檢查陽(yáng)性率較低，因此常難以作出診斷。 目前尚沒有可接受、能準(zhǔn)確鑒別原發(fā)性胸膜腫瘤的可溶性生物標(biāo)志物。 研究中的生物標(biāo)志物包括間皮素、骨橋蛋白和腓骨蛋白-3，但只有間皮素獲得美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)在臨床應(yīng)用，胸腔積液中可溶性間皮素較血清中間皮素更敏感。血清骨橋蛋白及腓骨蛋白-3 對(duì)間皮瘤的診斷價(jià)值不大。

良、惡性間皮瘤的治療及預(yù)后相差較大，因此正確區(qū)分兩者的意義巨大。 有關(guān)鑒別良、惡性間皮細(xì)胞增生的文獻(xiàn)非常豐富，目前認(rèn)為可標(biāo)志良性反應(yīng)性間皮瘤的有肌間線蛋白、上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）、單克隆抗體（克隆號(hào)E29）、p53、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1 （glucose transporter 1，GLUT-1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-2 信使 RNA 結(jié)合前蛋白-3 （insulin-like growth-factor 2 messenger ribonucleic acid-binding protein 3, IMP-3）等。然而，這些標(biāo)志物在良、惡性間皮瘤中的表達(dá)有太多重疊，且差異極大。目前可用來鑒別惡性間皮瘤與反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生的新標(biāo)志物有乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）相關(guān)蛋白-1（BRCA1-associated protein，BAP-1）和 p16/周期蛋白依賴性激酶抑制因子 2A （cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）2 種； 如果以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)到細(xì)胞核BAP-1 存在缺失，提示惡性胸膜間皮瘤，主要是上皮樣亞型（在肉瘤和纖維瘤變異體中非常少見）。 上皮樣惡性間皮瘤BAP-1 蛋白缺失率在 55%～80%之間[29-30]。 如果無 BAP-1 缺失，或者懷疑是肉瘤樣間皮瘤，則應(yīng)進(jìn)行熒光原位雜交來檢測(cè)p16 純合缺失； 已發(fā)現(xiàn)高達(dá)80%胸膜間皮瘤存在54 個(gè)p16 缺失 （肉瘤樣亞型90%、上皮樣亞型70%和雙相亞型70%）， 而在良性反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生中既無BAP-1 缺失，也無p16 缺失[30]。

未來生物標(biāo)志物

目前正在研究旨在發(fā)現(xiàn)血液、胸腔積液或胸膜組織中新的生物標(biāo)志物，涉及基因組學(xué)（DNA）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（所有RNA 類型）、蛋白質(zhì)組學(xué)（蛋白質(zhì)）和代謝組學(xué)（小分子或代謝物），并利用高通量方法探討潛在生物標(biāo)志物。 在轉(zhuǎn)錄后水平，一些在胸膜組織或體液中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的微RNA 已被作為胸膜間皮瘤的潛在標(biāo)志物[31]。 在蛋白質(zhì)組學(xué)方面，以生物芯片檢測(cè)與癌癥相關(guān)的蛋白生物標(biāo)志物以及這些標(biāo)志物在MPE 與TPE、肺腺癌與胸膜間皮瘤之間的差別[32]。 最后，通過高分辨磁共振光譜研究不同胸腔積液代謝譜，分析其間的代謝產(chǎn)物如乳酸、氨基酸或脂類， 這或許也有助于鑒別良性胸腔積液與MPE[33]。

綜上所述，胸腔積液是臨床常見疾病，病因復(fù)雜，正確的病因診斷對(duì)疾病治療和預(yù)后起決定性作用。 胸腔積液標(biāo)志物中 ADA、IFN-γ、IL-27 在診斷TPE 上的靈敏度和特異度均達(dá)到90%，具有較高的臨床價(jià)值。 其他具有一定診斷意義的標(biāo)志物包括IL-33、IL-31、IL-2、結(jié)核分枝桿菌合成的外分泌蛋白Ag85A 等。 雖然有研究顯示 IL-33 及 IL-31 的診斷靈敏度和特異度較高，但因?qū)嶒?yàn)證據(jù)不足及差異性較大未被廣泛接受。 對(duì)于MPE，目前診斷仍依賴于細(xì)胞學(xué)及組織病理學(xué)，多種生物標(biāo)志物的靈敏度及特異度均有限， 應(yīng)用最廣的是CEA、CA12-5 以及CA15-3，聯(lián)合檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物可顯著提高診斷價(jià)值。 診斷由間皮瘤導(dǎo)致的胸腔積液仍較困難，對(duì)多種標(biāo)志物包括蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等的研究尚在進(jìn)行中。