基于HPLC-Q-TOF/MS法的鬼針草血清藥物化學(xué)探究

王宇卿，李淑嬌，莊 果

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校科研中心，河南南陽 473061）

鬼針草Bidens bipinnataL.又名鬼骨針、婆婆針,為菊科鬼針草屬一年生草本植物,全草可作藥用。鬼針草屬的藥材資源非常豐富,全球約有230余種,廣布于亞洲、美洲的亞熱帶地區(qū),在我國有9個種和2個變種,遍布全國各地,極易采集［1］?！侗静菔斑z》 記載鬼針草味苦,性平,無毒,具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、活血散瘀等作用,可用于痰濕瘀阻等癥；《中藥大詞典》 中記載鬼針草味苦,性微寒,歸肝、肺、胃、大腸經(jīng),具有清熱解毒、散瘀消腫的功效；《中華本草》 功效分類為清熱解毒藥、消腫藥,具有清熱解毒、散瘀消腫等功效［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明,鬼針草具有抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗高血脂和血栓形成、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等作用［3-7］,現(xiàn)代臨床可用于治療腹瀉、痢疾、心血管系統(tǒng)疾病、原發(fā)性高血壓等［8-10］。目前,關(guān)于該藥體內(nèi)活性成分方面的研究鮮有報道,本實驗首次聯(lián)合采用HPLC-Q-TOF/MS技術(shù)與中藥血清藥物化學(xué)的相關(guān)理論和研究方法對鬼針草進行研究,旨在探求該中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),為鬼針草的進一步研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 1260高效液相色譜系統(tǒng)、G6530 Q-TOF/MS質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；Milli Q超純水機（美國密理博公司）；XS-105分析天平［梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司］；TGL-16G高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；WH-3微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 鬼針草飲片（批號 161015；產(chǎn)地河南南陽）購于淅川縣度幫中藥材種植專業(yè)合作社,經(jīng)南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校王宇卿副教授鑒定為菊科鬼針草屬一年生草本植物鬼針草Bidens bipinnataL.的地上部分。沒食子酸（Y19M8C36143）、原兒茶酸 （Z30M6L1）、金絲桃苷（Y05J8X39277）、木樨草苷 （Y05D8H49919）、木樨草素（C24M8Q36543）,均購于上海源葉生物科技有限公司；綠原酸 （110753-200413）、蘆丁 （0080-9504）、槲皮素（100081-201509）,均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；超純水自制；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠,體質(zhì)量180～220 g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,合格證號SCXK（湘）2013-0004。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 稱取鬼針草500 g,用10倍量的水進行2次加熱回流提取,每次各2 h,自然冷卻后,傾出水溶液,過濾藥渣,合并2次水提液進行真空減壓濃縮至1.5 g生藥/g浸膏,制得鬼針草樣品,冷藏備用。

2.2 對照品溶液制備 分別精密稱量各對照品置于10 mL量瓶中,加70%甲醇充分溶解后定容,制成適宜濃度的混合對照品溶液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.3 空白血清及含藥血清制備 取雄性SD大鼠12只,禁食12 h （自由飲水）,稱定質(zhì)量,隨機分為2組,每組6只?？瞻捉M灌胃給予蒸餾水,給藥組灌胃給予鬼針草（10 g生藥/kg）水提液,每日早晚各1次,連續(xù)給藥3 d；末次給藥后60 min眼眶靜脈叢取血0.5 mL,室溫放置30 min后,3 000 r/min條件下離心10 min,取上清液血清0.2 mL,加入3倍量乙腈,渦旋混勻30 s,靜置片刻后13 000 r/min離心10 min,取上清,于真空干燥箱濃縮至干后用100 μL 70%乙腈-水復(fù)溶,渦旋,13 000 r/min高速離心10 min,取上清液作為血清供試品。

2.4 分析條件 Poroshell 120 EC-C18色譜柱 （3 mm×150 mm,2.7 μm）；流動相乙腈（A）-0.2% 甲酸（B）,梯度洗脫（0～1 min,5%～15% A；1～7 min,15%～25% A；7～11 min,25%～40% A；11～14 min,40%～50% A；14～15 min,50%～100% A；15～20 min,100% A；20～21 min,100%～5%A）；體積流量0.5 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

G6530A Q-TOF/MS質(zhì)譜儀；AJS ESI源；ESI+、ESI模式；干燥氣體溫度320 ℃；干燥氣體體積流量8 L/min；霧化器壓力40 psi （1 psi=6.895 kPa）；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣體積流量12 L/min；碎裂電壓175 V；毛細管電壓3.5 kV；正負離子采集范圍m/z100～1 700。

2.5 鬼針草及其血清中成分分析 取3批鬼針草水煎液,以及6批鬼針草血清樣品在相同的色譜和質(zhì)譜條件下進行HPLC-Q-TOF/MS分析,建立其指紋圖譜,比較分析確定入血成分。然后參照有關(guān)文獻、對照品對照及其一級、二級質(zhì)譜信息初步鑒定鬼針草的入血成分。

3 結(jié)果

在鬼針草含藥血清樣本中共檢測出11種移行成分,見圖1。通過HPLC-Q-TOF/MS檢測,并經(jīng)過與對照品、文獻相關(guān)數(shù)據(jù)對比,初步鑒定出11種移行成分,其中有機酸類5種、黃酮類5種及聚炔類1種,各化合物相關(guān)質(zhì)譜信息見表1。

圖1 各樣品總離子流圖

表1 鬼針草血中11種移行成分

3.1 有機酸類化合物結(jié)構(gòu)解析 共鑒定出有機酸類化合物5個,分別為化合物1～5。化合物1,保留時間2.412 min,在負離子模式下,一級全掃描質(zhì)譜分析中其準分子離子為m/z169.014 6,進一步進行二級全掃描質(zhì)譜分析,其主要的碎片離子m/z151.003 0、125.023 6分別為準分子離子失去H2O和CO2后的碎片；在正離子模式下,其準分子離子為m/z171.029 1,主要碎片離子m/z127.039 5為準分子離子失去CO2后的碎片,然后與文獻及對照品對照,鑒定為沒食子酸［11］?；衔?,保留時間2.503 min,在負離子模式下,一級全掃描質(zhì)譜分析中其準分子離子為m/z153.019 6,進一步進行二級全掃描質(zhì)譜分析,其主要的碎片離子有m/z109.029 4 ［M-H-CO2］-、108.021 1 ［M-HCHO2］-；在正離子模式下,其準分子離子為 m/z155.034 1,主要碎片離子m/z111.044 6為準分子離子失去CO2后的碎片,然后與文獻及對照品對照,鑒定為原兒茶酸［12］?；衔?,保留時間3.657 min,在負離子模式下,一級全掃描質(zhì)譜分析中其準分子離子為 m/z353.087 4,進一步進行二級全掃描質(zhì)譜分析,其主要的碎片離子有m/z179.034 4 ［M-H-C7H10O5］-、135.044 6 ［MH-C7H10O5-CO2］-；在正離子模式下,其準分子離子為m/z355.102 6,主要碎片離子m/z181.050 1為準分子離子失去C7H10O5后的碎片,然后與文獻及對照品對照,鑒定為綠原酸［13］?；衔?～5在ESI+模式下均得到m/z517［M+H］+且根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)計算得分子式均為C25H24O12,峰4碎片離子m/z353.087 6 ［M-H-C9H8O4］-、191.055 8［M-H-C18H16O8］-、179.034 3 ［M-H-C16H18O9］-、355.103 1 ［M+H-C9H7O3］+,峰5碎片離子m/z353.087 5 ［M-HC9H8O4］-、191.055 4 ［M-H-C18H16O8］-、179.034 1 ［MH-C16H18O9］-、355.102 7 ［M+H-C9H7O3］+、163.039 5［M+H-C16H17O9］+,結(jié)合文獻［14-17］推測峰4為3,4-二咖啡?；鼘幩?峰5為3,5-二咖啡?；鼘幩?其保留時間分別為6.156、6.223 min。

圖2 黃酮類化合物特征碎裂途徑

3.2 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)解析 共鑒定出黃酮類化合物5個,分別為化合物6～8、10～11,此類化合物的特征碎裂途徑見圖2?；衔?,保留時間為6.816 min,在負離子模式下,一級全掃描質(zhì)譜分析中其準分子離子為m/z609.145 7,進一步進行二級全掃描質(zhì)譜分析,其主要的碎片離子有m/z463.087 8 ［M-H-C6H10O4］-、301.034 4 ［MH-C13H22O9］-、193.013 4 ［M-H-C13H22O9-B］-、107.013 50,4A-；在正離子模式下,一級全掃描質(zhì)譜分析中其準分子離子為m/z611.160 6,進一步進行二級全掃描質(zhì)譜分析,其主要的碎片離子為m/z303.050 7 ［M+H-C12H20O9］+,結(jié)合文獻［18-19］推測為蘆丁?；衔?,保留時間7.655 min,在負離子模式下,進行一級全掃描質(zhì)譜掃描,與空白血清比較,灌胃給藥后的大鼠血清樣品中檢測到金絲桃苷原形的準分子離子峰m/z463.087 6,然后進行二級質(zhì)譜掃描,其主要的碎片離子有m/z301.034 9、257.045 2、107.013 3,這些碎片為準分子離子峰分別失去C6H12O6、C6H12O6+CO2、0,4B-形成的；在正離子模式下發(fā)現(xiàn)其準分子離子峰m/z465.103 1及碎片離子m/z303.050 3 ［M+H-C6H12O6］+,然后通過與文獻及對照品對照,鑒定為金絲桃苷［20］?；衔?,保留時間7.853 min,在負離子模式下進行一級全掃描質(zhì)譜掃描,與空白血清比較,灌胃給藥后的大鼠血清樣品中檢測到木樨草苷原形的準分子離子峰m/z447.092 5,然后進行二級質(zhì)譜掃描,其主要的碎片離子有m/z285.039 7 ［M-H-C6H12O6］-、267.029 1 ［M-H-H2O］-、217.049 8 ［M-H-C3O2］-；在正離子模式下發(fā)現(xiàn)其準分子離子峰m/z449.108 2及碎片離子m/z287.055 4 ［M+H-C6H12O6］+,然后通過與文獻及對照品對照,鑒定為木樨草苷［21］。化合物10,保留時間13.934 min,在負離子模式下進行一級全掃描質(zhì)譜掃描,與空白血清比較,灌胃給藥后的大鼠血清樣品中檢測到木樨草素原形的準分子離子峰m/z285.040 1,然后進行二級質(zhì)譜掃描,其主要的碎片離子m/z267.029 1、241.050 3、217.049 8為準分子離子分別失去H2O、CO2、C3O2后形成的；在正離子模式下發(fā)現(xiàn)其準分子離子峰m/z287.055 3,碎片離子m/z269.045 2為準分子離子失去一分子H2O后形成的,然后通過與文獻及對照品對照,鑒定為木樨草素［23］?；衔?1,保留時間14.127 min,在負離子模式下進行一級全掃描質(zhì)譜掃描,與空白血清比較,灌胃給藥后的大鼠血清樣品中檢測到槲皮素原形的準分子離子峰m/z301.035 1,然后進行二級質(zhì)譜掃描,其主要的碎片離子m/z257.045 4 ［M-H-CO2］-、193.013 3 ［M-H-B］-為準分子離子分別失去CO2、B環(huán)后形成的；在正離子模式下發(fā)現(xiàn)其準分子離子峰m/z303.050 3,碎片離子m/z275.055 3、259.060 8為準分子離子峰分別失去CO和CO2后形成的,然后通過與文獻及對照品對照,鑒定為槲皮素［23］。

3.3 聚炔類化合物結(jié)構(gòu)解析 化合物9,保留時間8.982 min,在負離子模式下,檢測到其主要碎片有m/z423.129 6 ［M+HCOO］-、377.124 1 ［M-H］-,在正離子模式下,檢測到其主要碎片有379.139 6 ［M+H］+、401.121 5［M+Na］+、217.087 1 ［M+H-C6H12O6］+、181.071 2［M+H-C13H12O3］+,然后結(jié)合文獻及鬼針聚炔苷的精確分子量,初步推測為鬼針聚炔苷［22］。

4 討論

本實驗首次運用HPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合中藥血清藥物化學(xué)的相關(guān)理論和研究方法對鬼針草的體內(nèi)活性成分進行研究,初步分析了鬼針草的入血成分。本實驗分別采用水浴法、高氯酸法、甲醇沉淀法和乙腈沉淀法對血清樣品進行處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈沉淀法得到的樣品色譜圖信息量較大,干擾少,最終確定采用乙腈沉淀法對血清樣品進行處理。

本研究通過對比鬼針草水煎液、含藥血清、空白血清以及對照品等指紋圖譜,利用Qualitative Analysis等軟件進行分析,根據(jù)質(zhì)譜信息、保留時間、精確相對分子量及與文獻和對照品對比,共鑒定出11種原型入血成分。鬼針草中入血成分主要是黃酮類、聚炔類、有機酸類等。這些成分都具有抗菌、抗炎、降血脂、降血壓、清除自由基等作用［8,24-25］。這進一步證實了上述入血成分可能為鬼針草在體內(nèi)發(fā)揮藥效的有效組分群,以期為其后續(xù)研究開發(fā)提供驗依據(jù),也為闡明鬼針草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。