珍寶丸聯(lián)合電針對急性脊髓損傷大鼠行為學(xué)和BrdU、Nestin、GFAP表達(dá)的影響

賴增嬌，滕秀英，劉國斌

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古通遼 028000；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001；3.內(nèi)蒙古通遼市科爾沁區(qū)第一人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古通遼 028000）

急性脊髓損傷是臨床常見的急重癥,多發(fā)生于交通事故、高處墜落等事故中,可影響肢體功能,甚至可導(dǎo)致癱瘓。調(diào)查［1］顯示,全球急性脊髓損傷的發(fā)病率約為每百萬人中有3.6～195例,且該病的發(fā)生率仍逐漸增長,由此所致的肢體運(yùn)動障礙和死亡人數(shù)也越來越多,已引起高度重視。目前臨床上對此類患者多采用減壓手術(shù)或營養(yǎng)脊髓神經(jīng)、促脊髓神經(jīng)生長等保守治療,有一定療效,但仍存在較大的提升空間。蒙藥珍寶丸具有安神活絡(luò)、清熱涼血等功效,在既往研究中被證實對急性脊髓損傷具有輔助治療作用［2］,可改善患者的康復(fù)效果,且在動物實驗中也證實該藥物可改善急性脊髓損傷大鼠模型的行為學(xué)［3］。電針是基于經(jīng)絡(luò)學(xué)說的一種脈沖電刺激療法,可改善血流、增強(qiáng)損傷的脊髓神經(jīng)的自我修復(fù)功能,還可改善患者的運(yùn)動功能［4］。有研究［5-7］提示,5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）、巢蛋白 （Nestin）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達(dá)是脊髓神經(jīng)細(xì)胞生長、增殖和分化的重要參考指標(biāo),在急性脊髓損傷后上述指標(biāo)表達(dá)均有所升高以促進(jìn)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的生長、增殖和分化,加快損傷組織修復(fù),已被作為急性脊髓損傷的治療靶點應(yīng)用于動物實驗中［8］。為嘗試探討增療效的方案,本研究特嘗試將蒙藥珍寶丸與電針聯(lián)用治療急性脊髓損傷大鼠,并觀察其效果,探討對脊髓損傷組織BrdU、Nestin、GFAP表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 動物 45只成年SD大鼠,雌雄各半,無特定病原體（SPF）級,10周齡,體質(zhì)量180～230 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號SCXK （京）2018-0001。

1.2 藥物與試劑 蒙藥珍寶丸（內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字Z1502410,規(guī)格6 g/丸,批號171205003）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所,批號1706135A）；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記（TUNEL）染色試劑盒（美國Roche公司,批號1710178）；兔抗鼠血管性血友病因子（vWF）、BrdU、Nestin、GFAP單克隆抗體和山羊抗兔vWF、BrdU、Nestin、GFAP多克隆抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)記）（美國Abcam公司,批號1710115002、1711125001、1711017010、1710018007、1710014007、1712017008、1712151002、1711019004）；RNAiso Plus提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司,批號1710145001）；BrdU、Nestin、GFAP、內(nèi)參（βactin）引物委托深圳晶美生物技術(shù)有限公司合成；蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司,批號170812）。

1.3 儀器 G-6805型電針治療儀（北京科苑達(dá)醫(yī)療器械有限公司）；不銹鋼打擊桿（天津州杰技術(shù)發(fā)展有限公司定制）；Magnetion （德國西門子公司）；CH20 BIM型光學(xué)顯微鏡、BX63型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；7500型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）；Allegra X-15R型低溫高度離心機(jī)（美國Beckman公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell型蛋白質(zhì)凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠系統(tǒng)成像分析軟件（美國Alpha公司）。

2 方法

2.1 造模及分組 取45只SD成年大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、丸劑組、電針組、聯(lián)合組。以水合氯醛腹腔注射麻醉,仰臥位固定大鼠于手術(shù)臺上,常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備,沿著T7～T11椎體中線做縱行切口,切開2 cm,逐層切開皮膚和椎旁肌肉,注意避免損傷血管,接著切除T8～T10棘突和椎板,沖洗傷口后壓迫止血。取10 cm不銹鋼打擊桿垂直下降擊打暴露脊髓中心的位置,注意每只大鼠建模時打擊高度需一致,均為10 cm,打擊物質(zhì)量為10 g。建模后出現(xiàn)痙攣性擺尾反射,雙后肢回縮性撲動,遲緩性癱瘓［9］,即為造模成功。與此同時,正常對照組僅暴露脊髓,無擊打操作。

2.2 治療 丸劑組予以蒙藥珍寶丸治療,取蒙藥珍寶丸以開水浸泡,制作懸液,劑量0.54 g/kg,溶于1 mL/100 g大鼠體質(zhì)量的溫開水中灌胃,于術(shù)后23 h予以治療,此后每間隔24 h給藥1次,共1周；電針組予以電針干預(yù),選取大椎穴（位于第7頸椎和第1胸椎間背部正中）、命門穴（位于第2腰椎棘突下）,大椎穴向下斜刺、命門穴向上斜刺,分別接入陽極、陰極,持續(xù)脈沖電流刺激,于術(shù)后23 h予以治療,針刺30 min,留針30 min,此后每間隔24 h治療1次,共1周；聯(lián)合組予以蒙藥珍寶丸聯(lián)合電針治療,具體方法分別同丸劑組、電針組。

2.3 治療前后行為學(xué) 分別于治療前（確認(rèn)建模成功后,正常對照組同一時刻）、治療后采用后肢運(yùn)動功能評分（Basso Beattie Bresnahan,BBB）量表評價［10］,評分范圍為0～21分,0分表示后肢完全無活動,21分表示后肢活動完全正常,運(yùn)動功能評分量表評分越高認(rèn)為行為學(xué)越佳,每只大鼠均評價3次,每2次時間間隔至少5 min,求平均值。

2.4 治療后損傷脊髓組織病理變化和脊髓細(xì)胞凋亡率 采用HE染色法觀察損傷脊髓組織病理變化,采用TUNEL法檢測脊髓細(xì)胞凋亡率。常規(guī)腹腔麻醉,取T11～T13段損傷部位的脊髓組織,留取樣本,保存于-80 ℃的超低溫冰箱中。取1 mg組織固定、沖洗、脫水,二甲苯透明處理后石蠟包埋,制作石蠟切片,層厚4 μm,嚴(yán)格按照HE染色法試劑盒操作,最后以中性樹膠封固,于光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。將無明顯神經(jīng)細(xì)胞損傷劃為0級,將有散在、輕微神經(jīng)細(xì)胞損傷劃為1級,將有片狀神經(jīng)細(xì)胞損傷劃為2級,將有嚴(yán)重神經(jīng)細(xì)胞損傷劃為3級。同法取組織制作石蠟切片,嚴(yán)格按照TUNEL檢測試劑盒操作,于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取5個不重復(fù)的視野計算陽性染色細(xì)胞率,即為脊髓細(xì)胞凋亡率。

2.5 治療后損傷區(qū)域血管生成 采用免疫熒光染色法檢測。取待檢測組織,脫水包埋,液氮速凍,切片后平鋪于防脫載玻片上。室溫下干燥,于搖床上振搖清洗3次,5 min/次,透膜后采用PBS清洗3次,5 min/次。加入2 mol/L鹽酸溶液,孵育30 min、37 ℃。加入0.1 mmol/L硼酸鈉溶液,中和反應(yīng)10 min,采用PBS清洗3次,5 min/次。以10%濃度小牛血清蛋白封閉,加入一抗（兔抗鼠vWF單克隆抗體）,濕盒孵育,4 ℃過夜,PBS清洗后加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔vWF多克隆抗體）,濕盒孵育,37 ℃、1 h,PBS清洗。吹干,封片,4 ℃避光,干燥后以熒光顯微鏡采集圖像,統(tǒng)計vWF陽性血管數(shù)目。

2.6 損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達(dá) 采用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR檢測。同法取組織,采用RNAiso Plus提取總RNA,配置反應(yīng)體系,共10 μL,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-actin為內(nèi)參,取待檢測基因的上下游引物配置反應(yīng)體系,共25 μL,實施PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃ （5 s）、60 ℃ （30 s）,共40個循環(huán),最后55 ℃ （90 s）。對擴(kuò)增產(chǎn)物實施凝膠電泳驗證,并繪制溶解曲線,采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)采用Western blot法檢測。取組織,液氮冷凍,加入經(jīng)過預(yù)冷處理的裂解液,冰上快速勻漿并裂解1 h。將產(chǎn)物離心分析,并進(jìn)行蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、標(biāo)記處理。加入一抗（1 ∶1 000）,濕盒孵育,4 ℃過夜,PBS沖洗3次,5 min/次；加入二抗（1 ∶5 000）,室溫孵育1 h,PBS沖洗3次,5 min/次。計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以（）表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,配對t檢驗檢測本組內(nèi)治療前后資料。檢驗標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 治療前后各組行為學(xué) 40只建模大鼠中共有33只建模成功,7只死亡,推測由于脊髓損傷過重所致,建模成功率為82.50% （33/40）,將建模成功大鼠隨機(jī)分為模型組（8只）、丸劑組（8只）、電針組（9只）、聯(lián)合組（8只）。治療前模型組BBB評分低于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組、聯(lián)合組均與模型組相近（P＞0.05）,治療后模型組BBB評分較治療前下降（P＜0.01）,丸劑組、電針組、聯(lián)合組BBB評分均較治療前升高（P＜0.01）；治療后組間BBS評分比較,模型組低于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組、聯(lián)合組均高于模型組（P＜0.01）,聯(lián)合組高于丸劑組、電針組（P＜0.01）。見圖1。

圖1 治療前后各組行為學(xué)Fig.1 Behavior of each group before and after treatment

3.2 治療后各組損傷脊髓組織病理變化和脊髓細(xì)胞凋亡率 正常對照組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常,灰質(zhì)未見彌漫性水腫；模型組可見脊髓灰質(zhì)有大量、較大空泡形成,脊髓組織的正常結(jié)構(gòu)被破壞,白質(zhì)中可見神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量增生,受損的脊髓白質(zhì)區(qū)域內(nèi)可見嚴(yán)重微囊性病變,且神經(jīng)元細(xì)胞可見嚴(yán)重的崩解、核碎裂表現(xiàn),大量炎性細(xì)胞浸潤；丸劑組和電針組可見脊髓灰質(zhì)有部分、大空泡形成,白質(zhì)可見神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生,受損的脊髓白質(zhì)區(qū)域內(nèi)可見微囊性病變,且部分神經(jīng)元細(xì)胞可見崩解、核碎裂表現(xiàn),部分炎性細(xì)胞浸潤；聯(lián)合組可見脊髓灰質(zhì)少量、大空泡形成,白質(zhì)可見較少神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生,受損的脊髓白質(zhì)區(qū)域內(nèi)可見較少微囊性病變,較少神經(jīng)元細(xì)胞可見崩解、核碎裂表現(xiàn),少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖2 各組損傷脊髓組織病理變化（HE，×40）Fig.2 Pathological changes of spinal cord injury tissue in each group （HE，×40）

治療后模型組損傷脊髓組織分級高于正常對照組（P＜0.05）,丸劑組、電針組和聯(lián)合組均低于模型組（P＜0.05）,且聯(lián)合組低于丸劑組、電針組（P＜0.05）。見表2。治療后模型組損傷脊髓細(xì)胞凋亡率高于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯(lián)合組損傷脊髓細(xì)胞凋亡率均低于模型組（P＜0.01）,且聯(lián)合組損傷脊髓細(xì)胞凋亡率低于丸劑組、電針組 （P＜0.01）。見圖3。

3.3 治療后損傷區(qū)域血管生成 治療后模型組vWF陽性血管數(shù)目多于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯(lián)合組vWF陽性血管數(shù)目均多于模型組（P＜0.01）,且聯(lián)合組vWF陽性血管數(shù)目多于丸劑組、電針組（P＜0.01）。見圖4～5。

表2 各組損傷脊髓組織病理分級（）Tab.2 Pathological grade of spinal cord injury tissue in each group （）

表2 各組損傷脊髓組織病理分級（）Tab.2 Pathological grade of spinal cord injury tissue in each group （）

注：與正常對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05；與丸劑組比較,&P＜0.05；與電針組比較,￥P＜0.05。

圖3 各組治療后損傷脊髓細(xì)胞凋亡率Fig.3 Post-treatment apoptosis rates of spinal cord injury tissue cells in each group

3.4 治療后各組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、GFAPmRNA表達(dá) 治療后模型組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達(dá)均高于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯(lián)合組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達(dá)均高于模型組（P＜0.01）,且聯(lián)合組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達(dá)均高于丸劑組、電針組（P＜0.01）。見圖6。

圖4 vWF陽性血管數(shù)目（免疫熒光染色，×100）Fig.4 Number of vWF positive blood vessel （immunofluorescence staining，×100）

圖5 各組治療后vWF陽性血管數(shù)目Fig.5 Post-treatment number of vWF positive vessels in each group

3.5 治療后各組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá) 治療后模型組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)均高于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯(lián)合組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)均高于模型組（P＜0.01）,且聯(lián)合組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)均高于丸劑組、電針組 （P＜0.01）。見圖7～8。

4 討論

急性脊髓損傷后,局部神經(jīng)細(xì)胞會出現(xiàn)某些病理性變化,如新血管生成、干細(xì)胞被激發(fā)并向損傷部位遷移等,可以為損傷組織的修復(fù)創(chuàng)造有利條件。但是在此過程中,由于某些因素出現(xiàn)拮抗作用,影響損傷脊髓組織的自我修復(fù),如興奮性氨基酸的毒性作用、自由基大量產(chǎn)生、損傷所致的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)等［11-12］。Wan等［13］研究指出,急性脊髓損傷后常規(guī)的治療措施難以達(dá)到理想的效果,患者往往需要較長時間的恢復(fù)過程,且肢體功能受損嚴(yán)重,給患者的生活質(zhì)量造成極大的影響。故而該領(lǐng)域工作者需積極探討新的治療方案促進(jìn)急性脊髓損傷患者脊髓功能快速恢復(fù),改善療效。

圖6 各組治療后損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達(dá)Fig.6 Post-treatment expressions of BrdU， Nestinand GFAPmRNA in spinal cord injury tissue of each group

圖7 Western blot檢測各組治療后損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)Fig.7 Detection of post-treatment expressions of BrdU，Nestin and GFAP proteins in spinal cord injury tissue of each group by Western blot

圖8 各組治療后損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)Fig.8 Post-treatment expressions of BrdU，Nestin and GFAP proteins in spinal cord injury tissue of each group

神經(jīng)行為學(xué)功能障礙是急性脊髓損傷的共同特性,已成為臨床醫(yī)師關(guān)注的重點問題。本研究中模型組BBB評分顯著下降,遠(yuǎn)不如正常對照組,而丸劑組、電針組和聯(lián)合組治療后BBB評分均升高且均高于模型組,聯(lián)合組BBB評分明顯高于丸劑組和電針組,提示蒙藥珍寶丸、電針治療急性脊髓損傷均可改善急性脊髓損傷大鼠的神經(jīng)行為學(xué)功能,且蒙藥珍寶丸聯(lián)合電針的效果更佳。根據(jù)蒙醫(yī)理論,急性脊髓損傷屬于白脈病,可出現(xiàn)水腫、血液循環(huán)障礙和神經(jīng)損傷等表現(xiàn),從而損傷白脈,需針對病因?qū)嵤┲委?。蒙藥珍寶丸具有清熱除濕、舒筋活絡(luò)、安神寧心等功效,對白脈病療效理想。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),蒙藥珍寶丸不僅有助于增強(qiáng)受損的脊髓神經(jīng)細(xì)胞的自我修復(fù)功能,改善局部微循環(huán),還可清除氧自由基、控制炎癥反應(yīng),最終達(dá)到加快急性脊髓損傷恢復(fù)的目的［14-15］。電針刺激大椎穴和命門穴可舒筋活絡(luò)、疏通血脈,濡養(yǎng)經(jīng)脈氣血,在外力損傷督脈所致的氣血逆亂、瘀阻經(jīng)絡(luò)病癥中療效確切。陳溫慈等［16］研究表明,電針刺激急性脊髓損傷大鼠的大椎穴和命門穴可溫煦氣血,濡養(yǎng)肢體筋脈,疏利關(guān)節(jié),益氣活血。因此將蒙藥珍寶丸與電針刺激大椎穴和命門穴聯(lián)用治療急性脊髓損傷可獲得理想的效果。本研究中病理學(xué)觀察、分級和脊髓細(xì)胞凋亡率對比結(jié)果也顯示丸劑組、電針組和聯(lián)合組均較模型組顯著改善,提示蒙藥珍寶丸聯(lián)合電針治療急性脊髓損傷效果良好,可減輕病理學(xué)改變程度,減少脊髓細(xì)胞凋亡,提示該方案具有較高的臨床應(yīng)用價值。

急性脊髓損傷后新血管生成是快速恢復(fù)的有利條件,而其中與相關(guān)信號通路的調(diào)控關(guān)系緊密,可增加vWF表達(dá),促進(jìn)新血管生成。BrdU屬于一種胸腺脫氧核苷類似物,在細(xì)胞增殖周期S期可整合進(jìn)入細(xì)胞核的脫氧核糖核苷酸中,可反映細(xì)胞增殖狀態(tài),其表達(dá)越高意味著細(xì)胞增殖越快,從而為新血管的生成提供條件［17］。Nestin屬于一種中間絲類型蛋白,主要在神經(jīng)上皮干細(xì)胞特異性表達(dá),可促進(jìn)神經(jīng)元分化,增強(qiáng)損傷的脊髓神經(jīng)細(xì)胞的自我修復(fù)作用,在急性脊髓損傷患者治療中可將其作為靶點,上調(diào)其表達(dá)以改善脊髓功能。GFAP可與肌動蛋白、細(xì)胞膜相結(jié)合,增強(qiáng)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的遷移和黏附能力,并且還與蛋白激酶有密切關(guān)系,可共同參與脊髓損傷細(xì)胞的修復(fù)和功能改善［18］。有研究［19-21］顯示,急性脊髓損傷大鼠中損傷的脊髓組織中UrdU、Nestin和GFAP均較正常大鼠高表達(dá),而予以對癥治療可上調(diào)其表達(dá),提示在急性脊髓損傷治療中應(yīng)上調(diào)UrdU、Nestin和GFAP表達(dá),以改善脊髓功能。本研究中,模型組vWF陽性血管數(shù)目、損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于正常對照組,提示機(jī)體的自我修復(fù)機(jī)制可能啟動,進(jìn)而保證急性脊髓損傷的恢復(fù),但其作用不甚理想,遠(yuǎn)不如丸劑組、電針組和聯(lián)合組,且聯(lián)合組的作用最佳,表明蒙藥珍寶丸、電針夾脊穴和命門穴均可刺激急性脊髓損傷大鼠新血管生成,上調(diào)損傷的脊髓組織中BrdU、 Nestin、GFAPmRNA及蛋白表達(dá),從而發(fā)揮加快恢復(fù)的作用。

綜上所述,蒙藥珍寶丸、電針治療急性脊髓損傷大鼠均可改善其行為學(xué)、減輕病理損傷,并且均可促進(jìn)新血管生成,二者聯(lián)用的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用,且很可能是通過上調(diào)損傷脊髓組織的BrdU、Nestin、GFAP表達(dá)實現(xiàn)此作用的。本研究為蒙藥珍寶丸聯(lián)合電針在急性脊髓損傷患者臨床治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),提供了一種高效可行的治療方案,但該方案對損傷脊髓組織的BrdU、Nestin、GFAP表達(dá)上調(diào)的具體機(jī)制尚不明確,仍需進(jìn)一步研究探討,以加深人們對其認(rèn)識,更好地在臨床中推廣使用。