高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)安神補(bǔ)腦膠囊中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷含量*

江 勛，彭婷婷，周 峰

（湖南省衡陽市市場(chǎng)監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 衡陽421001）

安神補(bǔ)腦膠囊是由鹿茸、制何首烏、淫羊藿、干姜、甘草、大棗經(jīng)提取后加維生素B1組成的復(fù)方制劑，具有生精補(bǔ)髓、益氣補(bǔ)血、健腦安神的功效，用于腎精不足、氣血兩虧所致失眠、健忘、頭暈、神經(jīng)衰弱等癥[1]，臨床應(yīng)用廣泛，療效較好，且安全性好。全國僅有4家藥品生產(chǎn)企業(yè)具備批準(zhǔn)文號(hào)（分別為國家食品藥品監(jiān)督管理局 標(biāo) 準(zhǔn)YBZ15322009，YBZ02542009，YBZ06762009，YBZ08452009），但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不一，均以2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量測(cè)定作為處方中制何首烏的質(zhì)控指標(biāo)。方中制何首烏和淫羊藿為君藥。淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)除濕等功效，可用于增強(qiáng)免疫力、治療骨質(zhì)疏松、改善心肺功能[2-4]，約有55種，我國有45種[5]，其中4種收錄于2015年版《中國藥典（一部）》，分別為淫羊藿Epimedium BrevicornuMaxim、箭葉淫羊藿Epimedium Sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim、柔毛淫羊藿Epimedium PubescensMaxim、朝鮮淫羊藿Epimedium KoreanumNakai的干燥葉，性辛、溫，味甘，補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕[6]。不同品種、產(chǎn)地、采收季節(jié)的淫羊藿中的指標(biāo)性功效成分淫羊藿苷含量差異較大[7-8]，可能導(dǎo)致不同廠家不同批次產(chǎn)品的療效差異。為了能更有效地對(duì)安神補(bǔ)腦膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制，本研究中把單一指標(biāo)定量控制提高到同時(shí)控制2個(gè)指標(biāo)成分的含量，建立同時(shí)測(cè)定安神補(bǔ)腦膠囊中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷含量的高效液相色譜（HPLC）法[9]?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AT型液相色譜儀，SPD-M20A型檢測(cè)器，均購自日本島津公司；AE240S型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)公司，精度為十萬分之一）；DK-615HT型超聲波清洗儀（深圳市得康洗凈電器有限公司，功率為360 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)為110844-201814，純度為91.0%），淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)為110737-201516，純度為94.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；安神補(bǔ)腦膠囊（江蘇晨牌藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)分別為1804152，180523，1807092，1901072，1903082，1904012，1907122；江西南昌桑海制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為181007，181209，190120，190247；亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)為190301）；乙腈（色譜純，批號(hào)為N9CA1H），甲醇（色譜純，批號(hào)為T3AG1H），均購自美國Honey Well公司；水為屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Shimadzu Shim-packVP-ODSC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～11 min時(shí)20%A，11～12 min時(shí)20%A～36%A，12～24 min時(shí)36%A，24～25 min時(shí)36%A～20%A，25～30 min時(shí)20%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷峰計(jì)均不低于10 000。在此色譜條件下，2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷與其他組分均能達(dá)到基線分離，色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷251.84μg、淫羊藿苷74.52μg的混合對(duì)照品溶液。取樣品0.25 g，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率為300 W，頻率為40 kHz）處理30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按標(biāo)準(zhǔn)中的處方量及制備方法，分別制備不含制何首烏、淫羊藿的樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：分別取對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋成含2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷16.79，33.58，67.16，134.32，167.90，201.47，251.84μg/mL和淫羊藿苷4.98，9.93，6.62，19.86，49.68，59.61，74.52μg/mL的系列溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表1。

定量限和檢測(cè)限確定：精密量取對(duì)照品溶液，用甲醇依次稀釋至由高到低的溶液，測(cè)得2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷的檢測(cè)限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。結(jié)果見表1。

圖1高效液相色譜圖

表1線性關(guān)系、定量限和檢測(cè)限考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷色譜峰面積的RSD分別為0.47%和0.61%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為1807092）適量，分別于配制后0，4，8，12，18，24 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷色譜峰峰面積的RSD分別為0.41%和0.62%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批（批號(hào)為1807092）樣品6份，分別依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.87%和0.95%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批（批號(hào)為1807092）樣品9份，分別精密加入2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷對(duì)照品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品約0.25 g，精密稱定，依法制備供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液和樣品溶液各20μL，注入液相色譜儀，平行測(cè)定2次，計(jì)算2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷含量。結(jié)果見表3。

表3安神補(bǔ)腦膠囊成分定量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=12）

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

紫外吸收?qǐng)D譜顯示，2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷最大吸收波長(zhǎng)分別為320 nm[9]和270 nm[6]，但其色譜圖中二者對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處均有干擾峰存在。試驗(yàn)表明，在350 nm波長(zhǎng)處二者均有良好吸收，且相應(yīng)保留時(shí)間處無雜質(zhì)峰干擾，故選擇350 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)[9]。

3.2 流動(dòng)相選擇

分別考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液的等度洗脫和梯度洗脫，結(jié)果僅乙腈-水梯度洗脫可以同時(shí)對(duì)2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷的分離都達(dá)到滿意效果，且流動(dòng)相本身干擾小，穩(wěn)定、可靠，故選擇乙腈-水梯度洗脫。

3.3 提取方法選擇

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷均在稀乙醇中有良好的溶解度，且提取效果佳，干擾少，故選擇稀乙醇為提取溶劑。分別考察了提取時(shí)間為20，30，40 min時(shí)二者的含量，結(jié)果30 min的提取效果最佳。

3.4 樣品分析

對(duì)收集到的12批不同廠家生產(chǎn)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷含量較接近，但淫羊藿苷含量差異較大?？紤]不同廠家的安神補(bǔ)腦膠囊功能指標(biāo)成分含量差異可能與原藥材質(zhì)量差異及生產(chǎn)工藝有關(guān)，不同品種、產(chǎn)地、采收季節(jié)的淫羊藿中淫羊藿苷含量差異顯著。目前，含量檢測(cè)研究多采用單一成分測(cè)定的方法，耗時(shí)、低效。本試驗(yàn)中采用在同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定2個(gè)指標(biāo)成分的方法，操作簡(jiǎn)便，效率高，結(jié)果可靠，為提升本制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了可靠依據(jù)。

3.5 方法評(píng)價(jià)

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷分別為處方中制何首烏和淫羊藿2味君藥的指標(biāo)性功效成分，含量都較高，均為水溶性物質(zhì)，溶出度好。前者具有調(diào)血脂、抗氧化、抗炎、提高學(xué)習(xí)記憶能力、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、保護(hù)血管上皮細(xì)胞等生物活性[10-11]；后者具有增強(qiáng)性腺功能、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、促進(jìn)骨生長(zhǎng)、延緩衰老，強(qiáng)心、降血壓、抗心律失常、增加腦血流量，抑菌、抗病毒、抗炎、降血脂、抗腫瘤等多種作用[4]。以其二者作為指標(biāo)成分，采用HPLC法進(jìn)行質(zhì)量控制，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，能更好地保證安神補(bǔ)腦膠囊的質(zhì)量及療效。