鹽度對(duì)郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵過程中微生物及產(chǎn)品品質(zhì)的影響

李雄波，李 恒，鄧維琴，張其圣，陳相杰，范智義，李潔芝，陳 功,

（1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 成都 611130；3.四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620030；4.成都市丹丹川菜調(diào)味品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，四川 成都 611730）

郫縣豆瓣是中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，被譽(yù)為“川菜之魂”，近年來，隨著川菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，郫縣豆瓣產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)了井噴式發(fā)展，然而由于郫縣豆瓣鹽度過高，發(fā)酵速度慢已成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，同時(shí)高鹽食品也不符合人們低鹽飲食的消費(fèi)趨勢[1]。甜瓣子是將去皮干制的蠶豆瓣復(fù)水漂燙后接種米曲霉制曲發(fā)酵1～2 d后（豆瓣曲），再與一定比例的鹽水（平衡后鹽度15%）混合發(fā)酵而成的一種半固態(tài)的豆瓣醬半成品[2-3]，因其瓣形完整而顯著區(qū)別于其他發(fā)酵醬類產(chǎn)品[4]。甜瓣子發(fā)酵是郫縣豆瓣生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)之一，因其特有的“短時(shí)漂燙”、“熟不過心”等工藝條件，一般被認(rèn)為是生料發(fā)酵[5]，生料發(fā)酵因原料未經(jīng)滅菌處理，附著較多雜菌，需要采用較高的鹽度以抑制雜菌的生長，這是郫縣豆瓣制作周期長和產(chǎn)品鹽度高的癥結(jié)所在。

鹽度是影響甜瓣子發(fā)酵的重要因素之一，然而國內(nèi)外鮮有關(guān)于鹽度對(duì)甜瓣子發(fā)酵過程影響的研究報(bào)道，但是其他豆類發(fā)酵食品（如：大醬、黃豆醬等）中鹽度對(duì)發(fā)酵的影響研究已有報(bào)道。研究結(jié)果表明，曲霉屬在各鹽度發(fā)酵的豆類食品中都是主導(dǎo)真菌菌群[6-7]；但細(xì)菌菌群在不同鹽度條件下存在較大差異。Kim等[8]研究發(fā)現(xiàn)低鹽大醬是由Enterococcus啟動(dòng)發(fā)酵，然后由Lactobacillus主導(dǎo)發(fā)酵，而高鹽大醬中Enterococcus主導(dǎo)整個(gè)發(fā)酵過程；Cui Yanhua等[9]對(duì)黃豆醬的研究表明，不同鹽度黃豆醬中乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)差異較大，其中高鹽黃豆醬中以嗜鹽乳酸菌（Tetragenococcus）為主，而低鹽黃豆醬中則以非嗜鹽乳酸菌（Enterococcus）為主。發(fā)酵食品中，微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異是導(dǎo)致物質(zhì)成分差異的主要原因，低鹽條件有利于總酸和氨基酸態(tài)氮的形成，但不利于還原糖的積累，高鹽條件則反之[10-12]。由此可見，不同鹽度條件下微生物菌群差異顯著；低鹽條件有利于提高發(fā)酵速度，產(chǎn)生更多的有機(jī)酸和氨基酸態(tài)氮等物質(zhì)；從產(chǎn)品指標(biāo)角度來說，可能有利于提高甜瓣子的品質(zhì)。然而，也有研究報(bào)道稱發(fā)酵食品中鹽度降低往往對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味產(chǎn)生不利影響，使得消費(fèi)者難以接受[12-13]。

目前，鹽度對(duì)甜瓣子發(fā)酵的影響研究非常匱乏，因此系統(tǒng)研究鹽度對(duì)甜瓣子發(fā)酵的影響，探明發(fā)酵過程中的微生物演變規(guī)律和物質(zhì)成分及產(chǎn)品品質(zhì)之間的關(guān)系，有助于優(yōu)化甜瓣子發(fā)酵工藝，為甜瓣子降鹽和快速發(fā)酵提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食鹽 市售；霉瓣子由郫都區(qū)某豆瓣醬生產(chǎn)企業(yè)提供。

平板計(jì)數(shù)瓊脂、孟加拉紅培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基（生化試劑） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、37%甲醛溶液、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、重蒸酚、亞硫酸鈉、碳酸鈣（均為分析純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752G型紫外-可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；DZKW-4型恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；ESJ200-4A型分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；PHSJ-4F型pH計(jì) 梅特勒型-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZF-75L-H型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-150B-4型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 不同鹽度甜瓣子的制備

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，鹽度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為6%、9%、12%和15%，每組3 個(gè)平行，分別稱取2.5 kg豆瓣曲和2.5 kg鹽水混勻，置于食用酒精消毒處理后的玻璃罐中，37 ℃發(fā)酵57 d。定期采用無菌勺子攪拌甜瓣子，取樣待后續(xù)分析。

1.3.2 成分測定

中華合作時(shí)報(bào)社編委、中國農(nóng)資傳媒執(zhí)行總編輯孫立新以媒體視角看經(jīng)銷商的轉(zhuǎn)型。他在《新時(shí)代農(nóng)資經(jīng)銷商的機(jī)遇與使命》專題報(bào)告中，以媒體的視角分析了近年來農(nóng)資經(jīng)銷商的轉(zhuǎn)型和未來的發(fā)展方向，以中國農(nóng)資傳媒傳統(tǒng)活動(dòng)項(xiàng)目——全國百佳（優(yōu)秀）農(nóng)資經(jīng)銷商評(píng)選的活動(dòng)為例，闡述經(jīng)銷商正在發(fā)揮自身的特殊優(yōu)勢，扎根基層、誠信經(jīng)營，悄然向?qū)Α叭r(nóng)”的服務(wù)商轉(zhuǎn)變，投身公益事業(yè)，努力成為國家倡導(dǎo)的“一懂兩愛”的群體，承擔(dān)起美麗鄉(xiāng)村建設(shè)的特殊中間力量。

總酸與氨基酸態(tài)氮的測定：采用GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中酸度計(jì)法進(jìn)行測定；還原糖測定：采用3,5-二硝基水楊酸法[14]進(jìn)行測定。

1.3.3 感官特性評(píng)定

選取10 名項(xiàng)目組長期從事豆瓣醬發(fā)酵相關(guān)研究的研究員（男5 名，女5 名）組成評(píng)價(jià)小組，并對(duì)評(píng)價(jià)小組人員進(jìn)行感官評(píng)價(jià)知識(shí)和技能培訓(xùn)，以保證評(píng)價(jià)人員對(duì)甜瓣子的風(fēng)味特征能達(dá)成共識(shí)。評(píng)價(jià)小組人員從香氣、滋味、色澤、體態(tài)4 個(gè)方面對(duì)不同鹽度的甜瓣子進(jìn)行感官評(píng)分，以平均分作為產(chǎn)品指標(biāo)的評(píng)分。感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 甜瓣子的感官標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Pixian broad bean paste mash

1.3.4 微生物數(shù)量的測定

細(xì)菌總數(shù)的測定：根據(jù)GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測定》中方法稍作修改，改用含0.03%納他霉素的平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)；霉菌總數(shù)的測定：采用GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)》中平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)；乳酸菌總數(shù)的測定：稱取25.0 g樣品于裝有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，制成10－1稀釋液后于試管內(nèi)進(jìn)行梯度稀釋，選取3 個(gè)適宜稀釋度，分別取1 mL稀釋液于培養(yǎng)皿中，注入MRS固體培養(yǎng)基（含2%碳酸鈣）傾注培養(yǎng)，每個(gè)梯度做3 次平行，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，選取有明顯透明圈的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 樣品總DNA抽提及高通量測序

樣品總DNA抽提、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及基于Illumina MiSeq平臺(tái)的測序均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。采用338F-806R為引物擴(kuò)增細(xì)菌16S DNA V3-V4區(qū)序列，采用ITS1F-ITS2R為引物擴(kuò)增真菌ITS區(qū)序列。最終得到的序列按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類，得到OTU的代表序列，將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，最后采用RDP classififier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。16S細(xì)菌使用Silva數(shù)據(jù)庫，ITS真菌使用Unite的真菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度甜瓣子發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的變化

霉菌是甜瓣子發(fā)酵優(yōu)勢微生物，霉菌孢子的數(shù)量往往與甜瓣子的蛋白酶活性等相關(guān)，是保證后續(xù)郫縣豆瓣發(fā)酵成功的關(guān)鍵。由于采用了純種制曲，霉菌（圖1A）的起始數(shù)量較高（7.4（lg（CFU/g））），隨著發(fā)酵的進(jìn)行霉菌數(shù)量逐漸下降；高鹽條件下霉菌下降速度較慢，低鹽條件下降速度較快；尤其是在第8天之后，低鹽甜瓣子（6%和9%）與高鹽甜瓣子（12%和15%）之間霉菌數(shù)量有顯著差異，霉菌數(shù)量相差0.8（lg（CFU/g））以上，其中6%鹽度的甜瓣子發(fā)酵37 d以后霉菌幾乎不能檢出。

細(xì)菌在甜瓣子發(fā)酵過程中起到非常重要的作用，與甜瓣子的風(fēng)味和質(zhì)量密切相關(guān)。細(xì)菌總數(shù)在整個(gè)發(fā)酵過程中變化趨勢相似（圖1B），發(fā)酵開始時(shí)甜瓣子中細(xì)菌總數(shù)較高（6.9～7.1（lg（CFU/g））），當(dāng)與一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽水混合發(fā)酵以后，細(xì)菌數(shù)量急劇下降，不耐鹽的細(xì)菌數(shù)量大幅度減少，隨后細(xì)菌總數(shù)開始緩慢上升，后期則保持相對(duì)穩(wěn)定（7.3～7.4（lg（CFU/g）））。發(fā)酵前期，低鹽甜瓣子（6%和9%）和高鹽甜瓣子（12%和15%）中細(xì)菌數(shù)量有明顯差異，且低鹽條件下細(xì)菌數(shù)量高于高鹽條件下細(xì)菌數(shù)量，但發(fā)酵16 d以后二者差異逐漸縮小，不同鹽度條件下細(xì)菌數(shù)量基本相同且變化規(guī)律相近。乳酸菌只在低鹽甜瓣子（6%和9%）的發(fā)酵初期被檢測出（圖1C），其初始值在4.6（lg（CFU/g））左右，但16 d以后也全部消亡，這是由于后期總酸含量過高，反而抑制了乳酸菌的生長[15]。

圖1 鹽度對(duì)甜瓣子發(fā)酵過程中霉菌總數(shù)、細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌總數(shù)的影響Fig. 1 Effects of salt concentration on mold, bacteria and lactic acid bacteria counts during fermentation of broad bean paste mash

2.2 不同鹽度甜瓣子發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

微生物組成的差異可能是不同鹽度甜瓣子發(fā)酵過程中微生物含量差異的主要原因，采用Illumina高通量測序平臺(tái)對(duì)發(fā)酵前期（8 d）和發(fā)酵后期（57 d）不同鹽度的甜瓣子樣品進(jìn)行分析，細(xì)菌采用338F-806R為引物擴(kuò)增16S DNA V3-V4區(qū)序列，測得原始序列856 780 條，對(duì)原始序列進(jìn)行優(yōu)化處理后，得到有效序列428 390 條，并在97%相似度下將其進(jìn)行OTU聚類，共產(chǎn)生364 個(gè)OTU分類；真菌采用ITS1F-ITS2R為引物擴(kuò)增ITS區(qū)序列，測得原始序列988 740 條，對(duì)原始序列進(jìn)行優(yōu)化處理后，得到有效序列494 370 條，并在97%相似度下將其進(jìn)行OTU聚類，共產(chǎn)生7 個(gè)OTU分類。各樣本在屬水平上相對(duì)豐度大于1%的菌群結(jié)構(gòu)，如圖2所示。

如圖2A所示，從屬水平看，不同鹽度甜瓣子中真菌菌群結(jié)構(gòu)單一，樣品中真菌菌群只包含3 個(gè)屬，分別為Aspergillus、Millerozyma和Zygosaccharomyces；且鹽度對(duì)發(fā)酵過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)影響較小，Aspergillus是不同甜瓣子發(fā)酵過程中絕對(duì)優(yōu)勢真菌菌群。其中，Aspergillus是不同鹽度甜瓣子發(fā)酵前期檢測到的唯一真菌菌屬，雖然發(fā)酵后期也檢測到Millerozyma、Zygosaccharomyces等酵母菌，但除了6%鹽度中Millerozyma相對(duì)豐度較高以外，其余鹽度甜瓣子中酵母菌相對(duì)豐度均低。有研究表明，酵母菌產(chǎn)生乙醇和其他代謝物能給發(fā)酵食品帶來理想的風(fēng)味和香氣特征[16]。

圖2 鹽度對(duì)甜瓣子發(fā)酵過程中屬水平真菌和細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effects of salt concentration on fungal and bacterial community in broad bean paste mash during fermentation at the genus level

如圖2B所示，在屬水平上，甜瓣子中鹽度越高，細(xì)菌菌群多樣性越豐富，但不同鹽度之間細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異。發(fā)酵初期，6%鹽度甜瓣子中Lactobacillus（57.49%）、Weissella（20.18%）和Staphylococcus（14.40%）是優(yōu)勢菌群；而9%、12%、15%鹽度甜瓣子中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)相似，以Staphylococcus（62.58%；59.78%；42.22%）、Bacillus（8.10%；13.04%；10.11%）、Weissella（4.32%；4.62%；9.51%）、Pseudomonas（2.51%；4.41%；1.33%）、Leuconostoc（6.17%；2.66%；7.53%）、Lactococcus（2.62%；2.25%；2.86%）為主要細(xì)菌菌群。6%鹽度的甜瓣子中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)在發(fā)酵初期便顯著區(qū)別于其他鹽度的甜瓣子，這是由于6%的鹽度對(duì)Lactobacillus等乳酸菌抑制作用弱[17]，乳酸菌產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵體系中pH值迅速降低，進(jìn)而抑制競爭微生物的生長[18]。隨著發(fā)酵進(jìn)行，不同鹽度甜瓣子中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化呈現(xiàn)出不同趨勢。發(fā)酵后期，6%鹽度的甜瓣子中Lactobacillus（78.08%）成為了絕對(duì)優(yōu)勢菌群；9%鹽度的甜瓣子中Staphylococcus（33.90%）相對(duì)豐度下降，而Lactobacillus（18.05%）和Pseudomonas（11.70%）相對(duì)豐度上升；12%鹽度的甜瓣子中Staphylococcus（29.46%）相對(duì)豐度下降，而Tetragenococcus（38.47%）相對(duì)豐度大幅提升；而15%鹽度的甜瓣子中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，這是由于高鹽抑制了絕大部分微生物的代謝活動(dòng)，使得菌群之間相互競爭作用較弱。

2.3 不同鹽度甜瓣子發(fā)酵過程中物質(zhì)成分的變化

甜瓣子發(fā)酵過程中，微生物及酶利用原料中蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)分解代謝形成總酸、氨基酸態(tài)氮和還原糖等物質(zhì)成分，這些物質(zhì)成分本身就是重要的風(fēng)味物質(zhì)，此外還參與多種風(fēng)味物質(zhì)的合成。因此，總酸、氨基酸態(tài)氮和還原糖含量是衡量甜瓣子品質(zhì)、發(fā)酵程度和微生物代謝情況的主要指標(biāo)。

圖3 鹽度對(duì)甜瓣子發(fā)酵過程中總酸、氨基酸態(tài)氮和還原糖含量的影響Fig. 3 Effects of salt concentration on total acidity, amino nitrogen and reducing sugar during fermentation of broad bean paste mash

由圖3A可知，甜瓣子中鹽度越低，總酸含量越高，特別是發(fā)酵12 d以后，低鹽甜瓣子（6%和9%）中總酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于高鹽甜瓣子（12%和15%）。高鹽甜瓣子（12%和15%）發(fā)酵過程中總酸含量始終較低，發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別只有1.4%、1.1%；而低鹽甜瓣子（6%和9%）中總酸含量在發(fā)酵前期快速上升，分別在第12、16天達(dá)到峰值3.2%、2.3%。但是，6%鹽度甜瓣子中總酸含量在發(fā)酵后期逐漸下降，這是由于低鹽條件下乳酸菌在發(fā)酵后期消亡（圖1C），而酵母生長代謝旺盛，酵母菌產(chǎn)生的乙醇通過酯化反應(yīng)消耗了部分酸類物質(zhì)，從而使得總酸含量下降。從鹽度對(duì)甜瓣子中總酸含量的影響來看，甜瓣子中鹽度控制在12%以上才能有效防止發(fā)酵過程產(chǎn)酸過高。

由圖3B可知，不同鹽度條件下，甜瓣子發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量均呈先增加后趨于穩(wěn)定的變化趨勢，但不同鹽度之間變化趨勢存在一定差異，表現(xiàn)為鹽度越高，氨基態(tài)氮含量上升速度越慢，含量越低。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，6%、9%、12%、15%鹽度的甜瓣子中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.00、0.77、0.66、0.53%，低鹽甜瓣子（6%和9%）中氨基酸態(tài)氮含量遠(yuǎn)高于高鹽甜瓣子（12%和15%）中氨基酸態(tài)氮含量。此外，甜瓣子中氨基酸態(tài)氮主要在發(fā)酵前期（0～12 d）形成，6%、9%、12%、15%鹽度的甜瓣子中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12 d時(shí)分別為0.85%、0.67%、0.55%、0.44%，此時(shí)含量均超過發(fā)酵結(jié)束時(shí)含量的80%以上，這可能與發(fā)酵初期蛋白酶活性高有關(guān)。從氨基酸態(tài)氮含量來看，低鹽條件更有助于提高甜瓣子的發(fā)酵速度。

由圖3C可知，甜瓣子中還原糖含量呈先增加后逐漸趨于穩(wěn)定的變化趨勢，且鹽度越低，還原糖含量越低。6%鹽度甜瓣子中還原糖含量在整個(gè)發(fā)酵過程中始終較低，發(fā)酵結(jié)束時(shí)僅有2.8%；9%、12%、15%鹽度的甜瓣子中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～8 d差異較小，都由1.9%左右快速上升至5.9%左右，此后逐漸出現(xiàn)差異，發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別為4.2%、5.7%、6.6%。

2.4 鹽度對(duì)甜瓣子感官品質(zhì)的影響

感官品質(zhì)是直接表征甜瓣子品質(zhì)的重要指標(biāo)。通過從香氣、滋味、色澤和體態(tài)4 個(gè)方面對(duì)發(fā)酵結(jié)束的甜瓣子進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果如圖4所示。

圖4 鹽度對(duì)甜瓣子感官品質(zhì)的影響Fig. 4 Effects of salt concentration on sensory quality of broad bean paste mash

由圖4可知，鹽度對(duì)甜瓣子的香氣、滋味、色澤和體態(tài)均有較大影響。12%鹽度的甜瓣子感官品質(zhì)最佳，其醬酯香較濃郁，味鮮醇厚。15%鹽度的甜瓣子感官品質(zhì)次之，口味偏咸，醬酯香和鮮味不及12%鹽度的甜瓣子，這與甜瓣子中氨基酸態(tài)氮含量有關(guān)（圖3B），延長發(fā)酵時(shí)間，甜瓣子感官品質(zhì)能有所改善。6%和9%鹽度的甜瓣子整體感官品質(zhì)最差，雖然其色澤較好，但是蠶豆瓣軟爛不成形，并且具有明顯的酸敗氣味，口感過酸，這與甜瓣子中蛋白質(zhì)被過度分解（圖3B）、總酸含量過高有關(guān)（圖3A）。根據(jù)感官評(píng)價(jià)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總酸和氨基酸態(tài)氮含量是影響甜瓣子感官品質(zhì)的關(guān)鍵因素，氨基酸態(tài)氮含量高有利于感官品質(zhì)提升，總酸含量過高則導(dǎo)致感官品質(zhì)下降。低鹽化有利于氨基酸態(tài)氮形成，縮短發(fā)酵時(shí)間，但同時(shí)也造成總酸含量過高，感官品質(zhì)不佳。因此，甜瓣子發(fā)酵不能一味的追求低鹽化，需要選擇一個(gè)合適的鹽度才能發(fā)酵得到品質(zhì)較佳的甜瓣子。

3 討論與結(jié)論

鹽度是影響甜瓣子發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一，本研究結(jié)果表明，不同鹽度對(duì)甜瓣子發(fā)酵過程中微生物數(shù)量、菌群結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)品品質(zhì)有著不同程度的影響。甜瓣子發(fā)酵過程中，鹽度越低，霉菌總數(shù)下降速度越快，主要是由于不同鹽度甜瓣子中物質(zhì)成分差異導(dǎo)致的，甜瓣子中總酸含量隨發(fā)酵的進(jìn)行不斷積累，且鹽度越低總酸含量越高（圖3A），酸度過高致使霉菌的生長受到抑制，這在同類型產(chǎn)品中也常有報(bào)道[19-20]。不同鹽度甜瓣子中細(xì)菌總數(shù)變化規(guī)律一致，先下降后緩慢增加，最后趨于平穩(wěn)，但發(fā)酵前期低鹽甜瓣子（6%和9%）中細(xì)菌總數(shù)高于高鹽甜瓣子（12%和15%）。發(fā)酵前期，由于低鹽條件下滲透壓作用相對(duì)較弱，一些較為耐受的細(xì)菌能夠正常生長，因此低鹽條件下細(xì)菌數(shù)量更高，尤其是低鹽甜瓣子（6%和9%）中乳酸菌數(shù)量（圖1C）明顯高于高鹽甜瓣子（12%和15%）（未檢出），這可能是導(dǎo)致二者細(xì)菌總數(shù)差異的主要原因。

高通量測序結(jié)果顯示，不同鹽度對(duì)甜瓣子中真菌菌群結(jié)構(gòu)影響較小，Aspergillus是不同鹽度甜瓣子發(fā)酵過程中絕對(duì)優(yōu)勢真菌菌群，這是由于采用米曲霉純種制曲，導(dǎo)致甜瓣子發(fā)酵過程中真菌幾乎被Aspergillus所覆蓋。米曲霉能分泌蛋白酶、淀粉酶等多種酶，具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)水解能力和淀粉糖化能力，因此被廣泛運(yùn)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)中[21]。不同鹽度甜瓣子中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，低鹽甜瓣子（6%和9%）中優(yōu)勢細(xì)菌菌群主要是Lactobacillus、Staphylococcus、Weissella，高鹽甜瓣子（12%和15%）中則主要是Staphylococcus、Tetragenococcus、Bacillus。細(xì)菌對(duì)鹽的耐受性不同，是導(dǎo)致不同鹽度條件下細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異化的主要原因。Lactobacillus的耐鹽性能較差[17]，因此在低鹽甜瓣子（6%和9%）中相對(duì)豐度較高，而高鹽甜瓣子（12%和15%）中生長代謝受到抑制，它與發(fā)酵食品中乳酸、乙酸等有機(jī)酸形成密切相關(guān)[22]。Staphylococcus在鹽度越高的甜瓣子中相對(duì)豐度越高，有研究表明其對(duì)鹽具有高度的耐受性[23]，Staphylococcus是郫縣豆瓣中優(yōu)勢菌屬[24-25]，可以為豆瓣醬帶來甜味而不是帶來酸味，被認(rèn)為是豆瓣醬風(fēng)味的一個(gè)重要貢獻(xiàn)者[26]。除6%鹽度以外，Bacillus在其余鹽度中都具有較高的相對(duì)豐度，研究表明，Bacillus也是甜瓣子中優(yōu)勢菌屬之一，其具有極強(qiáng)的耐受性和產(chǎn)淀粉酶能力，對(duì)甜瓣子發(fā)酵進(jìn)程和風(fēng)味形成有著重要的作用[24,27]。Tetragenococcus具有較強(qiáng)的耐鹽性能[17]，因此廣泛存在于醬油、豆瓣醬等發(fā)酵食品中[24,28]，與發(fā)酵食品風(fēng)味形成密切相關(guān)，有研究將其用于改善豆瓣醬風(fēng)味[29]，而本研究中Tetragenococcus只在12%鹽度甜瓣子中含量豐富。此外，Weissella和Pseudomonas也是豆瓣醬中主要細(xì)菌菌群[30]，Weissella與發(fā)酵食品中有機(jī)酸和酯類等風(fēng)味物質(zhì)形成有關(guān)[31]，而Pseudomonas與甜瓣子中醛類化合物形成顯著相關(guān)[30]。由此可看出，甜瓣子發(fā)酵不僅僅是霉菌主導(dǎo)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異也是影響豆瓣甜瓣子品質(zhì)的主要原因。

鹽度對(duì)甜瓣子中總酸、氨基酸態(tài)氮和還原糖等物質(zhì)成分含量有顯著影響，鹽度越低，總酸和氨基酸態(tài)氮含量越高，而還原糖含量越低。甜瓣子中氨基酸態(tài)氮主要是由蛋白酶分解原料中蛋白質(zhì)形成，而蛋白酶主要來自制曲階段，制曲的本質(zhì)就是利用米曲霉等微生物在原料中生長繁殖，以獲取蛋白酶等多種生物酶[32]，因此發(fā)酵初期蛋白酶活性高，氨基酸態(tài)氮生成速度快。但是，有研究表明，蛋白酶活性隨著鹽含量的增加而顯著下降[21,33-34]，因此低鹽條件更有利于氨基酸態(tài)氮的形成。發(fā)酵食品中還原糖主要由淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生，但會(huì)被發(fā)酵過程中微生物代謝所消耗。Su Nanwei等[34]研究發(fā)現(xiàn)，0%～18%的鹽度對(duì)淀粉酶活性影響較小，表明不同鹽度甜瓣子中還原糖含量差異主要由微生物代謝消耗差異導(dǎo)致。有研究表明，甜瓣子發(fā)酵過程中還原糖含量變化主要是由乳酸菌引起[24]。此外，傳統(tǒng)發(fā)酵食品中有機(jī)酸等酸類物質(zhì)的形成也與乳酸菌密切相關(guān)[22,24]，低鹽甜瓣子（6%和9%）發(fā)酵初期乳酸菌生長代謝旺盛是導(dǎo)致其總酸含量過高的主要原因。但是，乳酸菌的生長代謝能力隨著鹽含量的增加而逐漸受到抑制[35-36]。因此，不同鹽度條件下乳酸菌在數(shù)量和代謝速率等方面的差異，是導(dǎo)致甜瓣子中還原糖含量和總酸含量差異的主要原因。低鹽甜瓣子（6%和9%）中乳酸菌含量豐富，生長代謝旺盛，導(dǎo)致還原糖被大量消耗并產(chǎn)生酸類物質(zhì)；高鹽甜瓣子（12%和15%）中乳酸菌生長代謝活動(dòng)受到抑制，還原糖在發(fā)酵過程中被大量積累。感官評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，12%鹽度的甜瓣子感官品質(zhì)最佳，15%鹽度次之，6%和9%鹽度得分最低。低鹽條件有利于氨基酸態(tài)氮的形成，提高甜瓣子發(fā)酵速度，但鹽度過低，微生物代謝旺盛，發(fā)酵體系中酸度過大，蠶豆瓣被分解軟爛，不利于甜瓣子的感官品質(zhì)。本研究結(jié)果顯示甜瓣子發(fā)酵不能一味追求低鹽化，鹽含量應(yīng)控制在適宜范圍（≥12%）方可保證產(chǎn)品的風(fēng)味和口感。