郫縣豆瓣智能后發(fā)酵工藝優(yōu)化及品質分析

劉 平，王雪梅，向 琴，孫文佳，李亞隆，李佳釔，陳志偉，車振明

（西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039）

郫縣豆瓣被譽為“川菜之魂”，是川菜中必不可少的辣味調味品，其味辣香醇、紅棕油亮、黏稠絨實、醬香濃郁的特色，在世界“發(fā)酵辣椒醬”中獨一無二[1]。釀造郫縣豆瓣有3 個重要階段：甜瓣子發(fā)酵、椒醅制作、甜瓣子與椒醅混合后的后發(fā)酵。其中，后發(fā)酵是郫縣豆瓣產(chǎn)生風味的關鍵階段。

郫縣豆瓣傳統(tǒng)后發(fā)酵工藝采用天然曬露法，目前企業(yè)基本采用該法[2]，發(fā)酵過程主要依靠郫縣地區(qū)優(yōu)越的地理以及氣候環(huán)境，極有利于多種微生物生長繁殖和多種酶系充分而完全的酶解作用。發(fā)酵生產(chǎn)主要在水泥條池和陶瓷缸中實現(xiàn)，在“翻曬露”后發(fā)酵工藝中，除部分較大企業(yè)使用單獨的翻攪機實現(xiàn)“翻”外，其余各工藝環(huán)節(jié)均以人工操作為主。該法發(fā)酵周期長、人力消耗大、衛(wèi)生條件不易控制、產(chǎn)品質量穩(wěn)定性低、生產(chǎn)成本高、對氣候的依賴度較大，并且存在季節(jié)性生產(chǎn)[3]。同為傳統(tǒng)發(fā)酵調味品，釀造醬油已實現(xiàn)全過程機械化、密閉化生產(chǎn)，所生產(chǎn)的醬油成本低、品質高[4]。釀造米醋[5]也實現(xiàn)了自動化液態(tài)深層發(fā)酵，提高了米醋風味品質，并使得陳釀期的安全性得到保障。舒杰[6]研制的鎮(zhèn)江香醋固態(tài)發(fā)酵自動化監(jiān)測與翻醅控制系統(tǒng)，能控制醋醅溫度并遠程監(jiān)測，實現(xiàn)自動化、科學化翻醅。但是郫縣豆瓣在機械化、自動化、清潔化生產(chǎn)上與醬油、醋還有較大差距，一方面郫縣豆瓣發(fā)酵機理還未明晰，另一方面顛覆傳統(tǒng)生產(chǎn)模式需要更多智能生產(chǎn)方面的研究。

本研究以模擬傳統(tǒng)自然后發(fā)酵“翻曬露”為基礎，利用自主設計研發(fā)的“郫縣豆瓣智能生產(chǎn)設備”進行發(fā)酵。采用單因素試驗，通過理化指標對發(fā)酵參數(shù)進行優(yōu)化，并在此基礎上全面跟蹤評價智能后發(fā)酵豆瓣品質優(yōu)劣，為自動化后發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化應用和加工工藝的規(guī)范提供理論依據(jù)和技術參數(shù)。相比傳統(tǒng)發(fā)酵模式，設備旨在實現(xiàn)郫縣豆瓣后發(fā)酵工藝的全程可控，保障產(chǎn)品的質量與安全，縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟甜瓣子與椒醅均取自四川省郫縣豆瓣股份有限公司；鄰二氯苯（純度99.0%）、C6～C20正構烷烴標準品西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、草酸、甲醇、乙醇（均為優(yōu)級純） 上海源葉生物科技有限公司；甲基紅、溴甲酚綠、酚酞、亞甲藍指示劑 成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

PHS-320顯數(shù)式pH計 成都世紀方舟科技有限公司；K9860全自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司；WFJ7200分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；SB-5200DTN超聲清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；GCMS-QP2010 Plus氣相色譜-質譜聯(lián)用儀日本島津儀器公司；固相微萃取手動進樣手柄、75 μm CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；L-8900日立全自動氨基酸分析儀 中國天美科學儀器有限公司；e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；VG3S025渦旋混勻器德國IKA公司；TD-5M臺式低速離心機 四川蜀科儀器有限公司。

“郫縣豆瓣智能生產(chǎn)設備”由本團隊自主設計研發(fā)[7]，裝置圖如圖1所示。設備由郫縣豆瓣醬攪拌機、升降機、倒料架、支架、升降傳動機構、門、氣缸、調節(jié)支架、增濕機、加熱器組成，帶有自動化操作界面，能夠設置多種自動控制系統(tǒng)。在郫縣豆瓣后發(fā)酵過程中，環(huán)境的溫度、濕度、光照和含氧率等會影響微生物的生長代謝以及酶的作用，從而影響郫縣豆瓣的質量。故設備采用溫度與濕度傳感器精準感應發(fā)酵環(huán)境的溫濕度，并利用加熱器、增濕機、攪拌機、模擬光源對環(huán)境溫濕度、攪拌頻率、光照條件進行控制。為方便進出料和清洗，設備的升降機、滑動滾輪和外置推動氣缸三者完美結合：首先利用升降機將發(fā)酵罐運送至中層，保證中層有5 個獨立的發(fā)酵罐，然后利用氣缸和滾輪協(xié)同作用將料缸推出發(fā)酵柜體，此時即可進行進料或中途取樣；若整個發(fā)酵結束后，需要將物料全部取出和徹底清洗，可借助出料感應系統(tǒng)，插上出料缸的插頭即可自動、充分地傾倒出物料，并利用配套的高壓水槍進行及時清洗。

圖1 郫縣豆瓣智能生產(chǎn)設備圖Fig. 1 Schematic diagram of the automatic equipment for Pixian broad-bean paste post-fermentation

1.3 方法

1.3.1 郫縣豆瓣智能發(fā)酵條件優(yōu)化

表1 郫縣豆瓣智能后發(fā)酵條件優(yōu)化Table 1 Protocols to optimize post-fermentation conditions of Pixian broad-bean paste

取成熟甜瓣子與椒醅，按質量比3∶7混合，在“郫縣豆瓣智能生產(chǎn)設備”中進行后發(fā)酵，具體設置如表1所示。每隔10 d取一次樣，連續(xù)測定3 個月，動態(tài)監(jiān)測后發(fā)酵過程中理化指標，包括氨基酸態(tài)氮、可溶性氮、總酸、還原糖含量，以及特征揮發(fā)性風味物質的變化規(guī)律，并以此為衡量標準進行條件優(yōu)化。

1.3.2 郫縣豆瓣智能發(fā)酵與自然發(fā)酵對比實驗

利用優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)進行智能發(fā)酵，取智能發(fā)酵1、2、3 個月，共3 個時間節(jié)點，并依次編號A-1M、A-2M、A-3M；作為對比，取自然發(fā)酵0 d和1、2、3、4、5、6、9、12 個月，共9 個時間節(jié)點，并依次編號T-0D、T-1M、T-2M、T-3M、T-4M、T-5M、T-6M、T-9M和T-12M。取樣方式參照已有報道[2,11]，盡量保證所取樣本的代表性和均勻性，樣品于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 理化指標測定

總酸采用酸堿滴定法[12-13]測定；氨基酸態(tài)氮采用甲醛滴定法[14]測定；還原糖采用直接滴定法[15]測定；水分采用直接干燥法[12]測定；鹽分采用硝酸銀滴定法[12-13]測定；游離氨基酸采用Lin Hongbin等[16]方法測定；有機酸采用于筱雨等[17]方法測定。

pH值測定：準確稱取5.00 g剁碎樣品，加入50 mL蒸餾水，保鮮膜封口，室溫攪拌浸提1 h，濾紙過濾后用pH計測定。

色價參考馬嫄等[18]的方法測定：采用丙酮超聲法提取色素，利用紫外分光光度計測定上清液在460 nm波長處的吸光度。

可溶性氮采用凱氏定氮法[19]測定：取樣品與蒸餾水按質量比1∶4均勻混合，40 ℃水浴攪拌提取1 h，室溫4 000 r/min離心15 min，測定上清液中蛋白質含量，即可溶性氮含量。

1.3.4 揮發(fā)性風味物質測定

在Liu Ping等[12]方法上略作修改，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜法。稱取5.00 g樣品于頂空瓶中，加入10 μL 10 μg/mL鄰二氯苯-甲醇溶液，60 ℃水浴平衡30 min后，用萃取頭吸附30 min，在氣相色譜進樣口解吸。

氣相色譜條件：色譜柱采用Agilent HP-5石英毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進樣口溫度240 ℃，不分流進樣；柱箱升溫程序：35 ℃保持5 min，以2.5 ℃/min升至115 ℃，以10 ℃升至200 ℃，最后200 ℃保持4 min。

質譜條件：電子電離源，溫度和能量分別為200 ℃和70 eV，質量掃描范圍m/z35～500。

揮發(fā)性組分定性定量參考已有研究方法[12,20]。首先，將各組分的質譜碎片模式與NIST17 Library譜庫進行比對，選擇SI≥80的組分進行初步定性；其次，根據(jù)相同氣相色譜條件下正構烷烴標品的保留時間計算各組分的保留指數(shù)，并與相關文獻報道進行比對，進一步輔助定性。最后，根據(jù)離子流色譜峰面積歸一化法對各組分進行定量，即根據(jù)各組分與內標物的峰面積之比等于其物質濃度之比。

1.3.5 感官評價

感官評價方法、評分標準及計算公式參考Liu Ping等[12]的方法，從滋味（口感、鮮味、咸味、酸味、甜味、苦味、辣味）、香味（香味度、持續(xù)性、協(xié)調性）、色澤（亮澤度、色度、均勻度）、外觀（均勻度、完整度、雜質）等方面進行感官評價，總體得分經(jīng)過加權處理，計算公式：

總分=0.4×滋味得分＋0.3×香味得分＋0.15×色澤得分＋0.15×外觀得分

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016對實驗數(shù)據(jù)進行處理和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 智能發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 攪拌頻率對郫縣豆瓣后發(fā)酵品質的影響

由圖2a可知，不同攪拌頻率下，氨基酸態(tài)氮質量分數(shù)均維持在0.200%水平以上，達到一級豆瓣的質量要求[21]，但整體香氣不足；隨發(fā)酵時間的延長，其含量呈先緩慢降低后緩慢升高的趨勢，發(fā)酵100 d含量約為初始值的1.4 倍。可溶性氮質量分數(shù)基本維持不變，變化范圍在0.511%～0.679%之間?？扇苄缘ǔ榘被釕B(tài)氮、游離氨基酸和某些小分子肽類等，可通過微生物代謝產(chǎn)生的蛋白酶降解蛋白質產(chǎn)生[22]。在后熟生香階段，某些含氮物質會發(fā)生自我降解，或與體系中其他物質發(fā)生化學反應而被消耗，如谷氨酸通過脫氨、脫羧或氧化形成琥珀酸[22]；或與還原糖發(fā)生美拉德反應形成揮發(fā)性風味物質和呈色物質[23]。由此，整個后熟期間可溶性氮的形成速率和消耗速率持平。

圖2 攪拌頻率對郫縣豆瓣理化指標和特征風味物質的影響Fig. 2 Effects of stirring frequency on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

由圖2b可知，總酸含量呈不規(guī)律波動，一方面酵母菌和乳酸菌等微生物生長代謝產(chǎn)生有機酸使得總酸升高[3]，另一方面，有機酸自我揮發(fā)或與醇類物質發(fā)生酯化反應使得總酸降低[22]，當兩者速率相近時即形成相對平衡狀態(tài)。還原糖含量在整個發(fā)酵階段持續(xù)下降，發(fā)酵末期降幅高達70%，說明微生物生長代謝旺盛，葡萄糖等碳源物質消耗增加，此時豆瓣醬香風味物質逐漸累積。根據(jù)郫縣豆瓣現(xiàn)有標準，氨基酸態(tài)氮含量的高低通常標志著產(chǎn)品質量的優(yōu)劣，因此，通過氨基酸態(tài)氮含量能夠比較客觀地篩選較優(yōu)攪拌頻率。比較分析發(fā)現(xiàn)，攪拌2條件下的氨基酸態(tài)氮和可溶性氮整體趨勢均高于攪拌1，而總酸和還原糖含量無明顯差異。其原因可能在于：攪拌加大了醬醅和空氣接觸的機會，微生物生存環(huán)境中的氧氣含量增多，于是好氧菌迅速增殖（如乳酸菌），厭氧菌急劇凋亡（如醋酸桿菌、乳酸菌、酵母菌）[8]。高產(chǎn)蛋白酶的微生物占據(jù)優(yōu)勢后迅速增殖，不斷降解蛋白質，使得氨基酸態(tài)氮和可溶性氮持續(xù)累積。

前人研究鑒定出26 種郫縣豆瓣特征風味物質[23-24]，本研究在此基礎上進行揮發(fā)性風味物質評價。由圖2c可知，對比不同攪拌頻率的特征風味物質組成及含量，發(fā)現(xiàn)攪拌2條件下香氣化合物明顯豐富且濃度偏高，進一步說明該發(fā)酵條件能夠在一定程度上促進豆瓣后熟風格的形成，加快后熟進程。因此，選擇較優(yōu)攪拌條件為攪拌2，即攪拌1 次/d、1 min/次。

2.1.2 光照對郫縣豆瓣后發(fā)酵品質的影響

2.1.2.1 光源的選擇

圖3 光源對郫縣豆瓣理化指標和特征風味物質的影響Fig. 3 Effects of light sources on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

如圖3a所示，隨著發(fā)酵時間的延長，氨基酸態(tài)氮和可溶性氮質量分數(shù)緩慢升高，分別由發(fā)酵初期的0.280%和0.598%升至0.380%和0.673%。在圖3b中，總酸質量濃度變化幅度相對較小，基本維持在0.30 g/100 mL左右。還原糖質量分數(shù)逐漸降低，發(fā)酵末期約降至發(fā)酵初期的30%～36%。由圖3c可知，特征風味物質檢出個數(shù)先減少后逐步趨于穩(wěn)定，總含量先逐漸減少后增加，而后急劇減少，最后達到相對平衡。比較不同光源條件，發(fā)現(xiàn)總酸和氨基酸態(tài)氮含量無明顯差異。然而，熒光燈照射條件下，還原糖質量分數(shù)下降速率略大，發(fā)酵結束時下降約64%；LED燈光源下降了58%。還原糖消耗速率快，可能是由于發(fā)酵體系中的微生物在迅速生長，也可能是還原糖與其他物質反應加速形成了風味[23]，因此，光照在一定程度上加速了醬醅的成熟。在熒光燈照射下可溶性氮的變化范圍為0.511%～0.636%，LED燈下為0.577%～0.673%；發(fā)酵結束時，LED燈條件下其含量比熒光燈高，表明LED燈照射能使含氮化合物累積更多，其中可能包括某些呈味肽等，這也側面反映出豆瓣呈味效果可能更好[25]。此外，整個后發(fā)酵期間特征風味物質的含量在不同光源下無明顯區(qū)分；但發(fā)酵40 d后，LED燈照射下的香氣化合物豐富性增加，整體風味更加協(xié)調柔和；發(fā)酵90 d，特征風味物質個數(shù)達到熒光燈的2 倍。綜上，兩種光源對醬醅理化品質的影響程度較小，可基本忽略，這一結果與前人研究較為一致[9]；但考慮到豆瓣整體香氣的協(xié)調性，LED燈模擬日光似乎略有優(yōu)勢，具體原因有待進一步研究。因此，本研究后續(xù)分析暫選用LED燈，以探究光照時間和光照強度對郫縣豆瓣品質的影響。

2.1.2.2 光照時間的選擇

從圖4a可以看出，氨基酸態(tài)氮質量分數(shù)在發(fā)酵前80 d呈動態(tài)波動，基本維持在0.20%～0.33%，之后累積速率急劇升高，發(fā)酵末期接近0.40%。此外，無光條件下可溶性氮含量的整體趨勢均高于有光條件，發(fā)酵末期高達0.679%；24 h光照下僅0.630%。圖4b顯示，總酸呈不規(guī)律波動，但幅度較小，可忽略。發(fā)酵前30 d，還原糖消耗速率急劇加快，但不同光照時間下無明顯差異；發(fā)酵30～70 d過程中，不同光照時間下還原糖均維持在0.65%左右，消耗速率和生成速率逐步達到平衡。值得注意的是，在圖4c中，隨著醬醅曝光時間的延長，特征風味物質的含量差距越來越小，但其個數(shù)差距逐步拉大，無光條件下風味物質種類顯著偏高。由于某些波段的光束可能會造成穩(wěn)定性差的化合物分解，也可能影響發(fā)酵體系中產(chǎn)香菌的生長代謝，導致風味物質合成受阻[9]，故光照0 h（即無光照）更有助于加快郫縣豆瓣后發(fā)酵過程中獨特風味的形成。

圖4 光照時間對郫縣豆瓣理化指標和特征風味物質的影響Fig. 4 Effects of illumination time on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

2.1.2.3 光照強度的選擇

圖5 光照強度對郫縣豆瓣理化指標和特征風味物質的影響Fig. 5 Effects of light intensity on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

由圖5a、b可知，在不同光照強度下，可溶性氮、總酸和還原糖含量差異不明顯，但在發(fā)酵60 d后，無光條件下的氨基酸態(tài)氮累積含量略高。圖5c顯示，在后發(fā)酵20～60 d過程中，特征風味物質個數(shù)及含量的差異越來越明顯，且無光條件下物質種類更為豐富，化合物濃度更高；繼續(xù)發(fā)酵時，這種差異有逐步縮小的趨勢。因此，選擇較優(yōu)的光照強度條件0 只燈（即無光照），這也進一步驗證了上述光源和光照時間篩選得出的結論。綜上，光照對郫縣豆瓣理化品質的影響十分微小，這一結論與前人在醬油中的研究結果較為相似[9]；而光照可能會加快郫縣豆瓣呈香物質的形成速度，但這種影響相較于傳統(tǒng)曬露工藝優(yōu)勢，將在后文進行闡述。

2.1.3 環(huán)境溫度對郫縣豆瓣后發(fā)酵品質的影響

發(fā)酵郫縣豆瓣需經(jīng)歷夏季的“三伏天”，利用“三伏天”的溫度為微生物提供生長繁殖代謝的有利環(huán)境。有研究表明，郫縣豆瓣發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群不僅能代謝產(chǎn)生獨特風味，它的次級代謝產(chǎn)物還能對發(fā)酵體系中的腐敗雜菌起到抑制作用[26]。在郫縣豆瓣后發(fā)酵體系中，當環(huán)境溫度達到微生物最適生長溫度時能夠迅速增殖，當達到最適代謝溫度時能夠迅速積累代謝產(chǎn)物，尋找微生物生長和代謝的最佳環(huán)境溫度對指導實際生產(chǎn)具有重要意義。郫縣豆瓣的功能菌主要為乳酸菌和酵母菌，其最適生長溫度分別為30～40 ℃和25～30 ℃[8]，本研究在此基礎上探究不同環(huán)境溫度下各理化指標的變化，結果如圖6a、b所示。在不同溫度下，理化指標無顯著差異，無法通過理化指標篩選較為合理的發(fā)酵溫度。然而，40 ℃持續(xù)高溫發(fā)酵時，發(fā)酵體系中水分散失速率明顯加快，醬醅表面極易形成干殼，醬體顏色偏黑色或棕褐色，散發(fā)出濃烈的焦糊味和蒸煮味，感官上比較難以接受。相比之下，28 ℃時醬醅的補水頻率減少，所得醬體色、香、味的整體風格與傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣最為接近。進一步特征香氣物質測定結果如圖6c所示，發(fā)酵前30 d，34 ℃的環(huán)境溫度更有利于特征香氣化合物種類的保留；而繼續(xù)發(fā)酵時，不同溫度下特征風味物質的檢出個數(shù)越來越接近，最后基本維持在同一水平。另外，28 ℃保溫環(huán)境下，香氣物質的含量略高于其他溫度條件，原因可能在于高溫環(huán)境不適合某些產(chǎn)香微生物的生長代謝，當溫度超過其耐受溫度范圍時會出現(xiàn)不同程度的消亡。因此，本研究選擇最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖6 環(huán)境溫度對郫縣豆瓣理化指標和特征風味物質的影響Fig. 6 Effects of temperature on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

2.1.4 環(huán)境濕度對郫縣豆瓣后發(fā)酵品質的影響

在28 ℃保溫發(fā)酵時，若環(huán)境濕度較低，則發(fā)酵體系中水分散失較快；要保證醬醅黏稠度一致，則需要相應補水，故每隔10 d進行一次補水，以保證醬醅的濕潤狀態(tài)。由圖7可知，在不同濕度下，各項理化指標及特征風味物質的變化均無特定規(guī)律，因此，通過“露”彌補散失水分并未造成理化指標的差異，故后續(xù)實驗選擇自然室內濕度。

圖7 環(huán)境濕度對郫縣豆瓣理化指標和特征風味物質的影響Fig. 7 Effects of environmental humidity on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

2.2 智能后發(fā)酵郫縣豆瓣的質量評價

2.2.1 不同后發(fā)酵條件下理化指標的變化規(guī)律

利用2.1節(jié)優(yōu)化的智能發(fā)酵工藝參數(shù)進行發(fā)酵，即：無光照、28 ℃持續(xù)保溫、自然濕度環(huán)境下發(fā)酵，且每天翻攪1 次、每次翻攪1 min。動態(tài)監(jiān)測后發(fā)酵過程中郫縣豆瓣品質的優(yōu)劣，并將其與工廠中傳統(tǒng)自然發(fā)酵樣品進行比較分析，結果如圖8所示。

智能后發(fā)酵過程中，由于補水量較多，醬醅含水量顯著高于自然發(fā)酵樣品，發(fā)酵3 個月時約高出4%，也因此體系含鹽量輕微偏低。水分和鹽分質量分數(shù)隨發(fā)酵時間的延長維持在相對穩(wěn)定水平，發(fā)酵前3 個月水分保持在60%左右，鹽分約為18.0%，后續(xù)發(fā)酵應注意適當控制補水量，以保證最終產(chǎn)品符合行業(yè)標準[21]。智能發(fā)酵豆瓣與自然發(fā)酵豆瓣的色價存在明顯差異，但均隨發(fā)酵時間的延長而逐漸下降。發(fā)酵3 個月，智能發(fā)酵樣品色價值為0.630±0.026，約為自然發(fā)酵樣品的1.24 倍，可見無光保溫環(huán)境下豆瓣色澤較深。原因可能在于辣椒中紅色素在無光條件下穩(wěn)定性較好，并且恒溫環(huán)境能夠促進美拉德反應形成色素?？偹岷蚿H值的整體變化趨勢與自然發(fā)酵相同，智能發(fā)酵1～3 個月過程中，總酸緩慢增加，pH值持續(xù)下降。值得注意的是，智能發(fā)酵豆瓣的總酸質量濃度顯著高于自然發(fā)酵，且發(fā)酵1 個月已經(jīng)高達（0.73±0.04）g/100 mL，遠超自然發(fā)酵12 個月的（0.61±0.04）g/100 mL，醬醅具有明顯的酸味，甚至有掩蓋豆瓣醬香味的趨勢，感官欠佳。由于醬醅含水量高、發(fā)酵環(huán)境空氣流速低以及攪拌次數(shù)偏少，導致體系中的溶氧量減少、醬醅與環(huán)境空氣的接觸減少，乳酸菌等厭氧菌生長代謝旺盛，使智能發(fā)酵體系中有機酸的累積速率加快。但有機酸的累積必須控制在適宜范圍，過多有機酸會導致醬醅發(fā)酸變質[27]。故為保證產(chǎn)品具有良好的風味，在后續(xù)智能發(fā)酵過程中應適當降低體系含水量或加快發(fā)酵環(huán)境的空氣流速，讓多余的有機酸充分揮發(fā)。未考慮通過增加攪拌次數(shù)使有機酸揮發(fā)，是因為攪拌容易破壞蠶豆瓣子和椒醅的完整性。

圖8 智能發(fā)酵與自然發(fā)酵郫縣豆瓣的相關理化指標Fig. 8 Physicochemical indexes of Pixian broad-bean pastes produced by intelligent fermentation and natural fermentation

智能發(fā)酵豆瓣除了酸類物質累積更快外，還原糖消耗速率、氨基酸態(tài)氮及可溶性氮生成速率均顯著高于自然發(fā)酵豆瓣。在1 個月時，智能發(fā)酵豆瓣的還原糖質量分數(shù)僅為（1.060±0.007）%，降幅超過30%，繼續(xù)發(fā)酵，還原糖呈緩慢波動式下降。由此表明，智能發(fā)酵過程中，還原糖的消耗階段集中在發(fā)酵前1 個月，此后由于體系中大量酸類物質的積累，使得酶活力降低并引起耐酸能力較弱的微生物逐漸消亡[3]，還原糖的生成速率降低。同時，在恒溫發(fā)酵體系中，還原糖與其他物質反應生成風味組分的速率加快[23]，兩者速率不斷變化并逐漸達到平衡狀態(tài)，此時還原糖含量基本維持恒定水平。

與之相反，智能發(fā)酵豆瓣氨基酸態(tài)氮含量持續(xù)增加，增加速率先快后慢，發(fā)酵1 個月后質量分數(shù)從（0.36±0.007）%升高至（0.41±0.012）%，約為發(fā)酵初期的1.5 倍，且智能發(fā)酵豆瓣的氨基酸態(tài)氮顯著高于傳統(tǒng)發(fā)酵全過程。由此表明，采用保溫發(fā)酵能夠激發(fā)氨基酸態(tài)氮的累積，縮短發(fā)酵周期，為進一步提高豆瓣質量提供了可能性?？扇苄缘吭谇鞍l(fā)酵1 個月過程中迅速增加，質量分數(shù)從（0.598±0.07）%升高至（0.652±0.03）%，累積量甚至高于傳統(tǒng)發(fā)酵12 個月含量水平，繼續(xù)發(fā)酵，含量略有降低，但仍保持在0.650%水平以上，同樣表明智能發(fā)酵有利于含氮化合物的累積，可能包括氨基酸態(tài)氮、多肽等，后續(xù)將繼續(xù)進行分析。

2.2.2 不同后發(fā)酵條件下有機酸的變化規(guī)律

圖9 智能發(fā)酵與自然發(fā)酵的郫縣豆瓣中有機酸含量的變化Fig. 9 Changes in organic acid contents of Pixian broad-bean pastes produced by intelligent fermentation and natural fermentation

自然發(fā)酵過程中，有機酸的變化并不明顯，故只將前3 個月的樣品進行對比。在智能發(fā)酵郫縣豆瓣中，利用高效液相色譜法檢出6 種有機酸。由圖9可知，在前3 個月發(fā)酵階段，總有機酸含量變化趨勢與自然發(fā)酵一致，均隨發(fā)酵的進行不斷累積。但智能發(fā)酵保溫條件下增速更快，發(fā)酵1 個月總有機酸含量高達（5.360±0.224）mg/g，這一結果與總酸和pH值測定結果相吻合。原因可能在于：1）智能發(fā)酵體系中較高的含水量與低頻率的翻攪，使醬醅中含氧率降低，再加上溫度適宜，均有利于乳酸菌、醋酸菌等厭氧產(chǎn)酸微生物的生長代謝[8,27]；2）發(fā)酵罐置于不銹鋼柜體中，醬醅表面空氣流速低，不利于有機酸的向外揮發(fā)[27]。

智能發(fā)酵樣品中所檢出的有機酸種類、分布及變化規(guī)律與自然發(fā)酵樣品的檢出情況極為相似。草酸由于檢出含量低于0.01 mg/g未在圖中出現(xiàn)，其檢出結果與已有研究存在差距[16-17]。檸檬酸占比仍居第一，含量高達3.860 mg/g以上，且隨著發(fā)酵時間延長呈緩慢增加趨勢，在0～3 個月期間，智能發(fā)酵與自然發(fā)酵無明顯差異。其次是蘋果酸（＞0.520 mg/g），累積階段集中在前發(fā)酵1 個月，智能發(fā)酵1 個月時，其累積量已達到0.521 mg/g；繼續(xù)發(fā)酵，累積速率略有下降；發(fā)酵3 個月后，含量超過了0.700 mg/g，遠超自然發(fā)酵的含量水平。由此說明，智能發(fā)酵比自然發(fā)酵更能促進蘋果酸的產(chǎn)生和累積，原理與總有機酸含量偏高類似，但有機酸累積過多會抑制醬醅中某些產(chǎn)酸微生物[28]，使得有機酸增速減小。酒石酸（＞0.710 mg/g）作為郫縣豆瓣中的第三大有機酸，也在前發(fā)酵1 個月累積，發(fā)酵1 個月結束時，含量約為發(fā)酵初期的2.7 倍，其智能發(fā)酵含量均遠超自然發(fā)酵。乳酸和琥珀酸在后熟期間的變化情況則相對較小，智能發(fā)酵3 個月，含量分別為（0.122±0.003）mg/g和（0.172±0.002）mg/g，僅比自然發(fā)酵3 個月高出0.034 mg/g和0.041 mg/g。

綜上，智能發(fā)酵過程中，蘋果酸、酒石酸、乳酸和琥珀酸的加成效應使總有機酸含量增加，當有機酸含量在適宜的范圍內增加時能夠促進郫縣豆瓣的呈味，一旦產(chǎn)酸過量則會引起醬醅酸敗，因此在后續(xù)利用該設備生產(chǎn)時需采取措施避免酸類物質過量累積。

2.2.3 不同后發(fā)酵條件下游離氨基酸的變化規(guī)律

由于游離氨基酸在自然發(fā)酵3 個月之后逐漸達到平衡，故只選用前3 個月的樣品進行比較。如圖10所示，智能發(fā)酵樣品中，除檢出17 種氨基酸和2 種酰胺類物質外，半胱氨酸（Cys）也有檢出，含量約為0.050～0.170 mg/g，這在自然發(fā)酵樣品中沒有檢出。智能發(fā)酵階段，總游離氨基酸含量變化范圍為18.203～21.027 mg/g，均顯著高于自然發(fā)酵樣品。發(fā)酵1 個月含量最豐富，約為自然發(fā)酵的1.4 倍；繼續(xù)發(fā)酵，含量呈現(xiàn)相似的動態(tài)下降趨勢，降幅低于自然發(fā)酵。此外，苦味、甜味、鮮味氨基酸含量變化范圍分別為6.548～7.618、5.670～6.418、5.581～6.663 mg/g，均顯著高于自然發(fā)酵樣品，且隨著發(fā)酵的進行均緩慢降低，降幅同樣低于自然發(fā)酵樣品，這表明智能發(fā)酵的呈味效果可能更好。

圖10 智能發(fā)酵與自然發(fā)酵的郫縣豆瓣中游離氨基酸種類與含量Fig. 10 Types and concentrations of free amino acids from Pixian broadbean pastes produced by intelligent fermentation and natural fermentation

由圖10可知，在所檢出的游離氨基酸中，含量大于1.000 mg/g的氨基酸共9 種，除自然發(fā)酵檢出的5 種高含量氨基酸谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）和天冬酰胺（Asn）外，還包括呈甜味的丙氨酸（Ala）、賴氨酸（Lys）以及呈苦味的纈氨酸（Val）和亮氨酸（Leu），總占比高達70%，各氨基酸含量高低排序依次為：Glu、Asp、Arg、Pro、Leu、Lys、Ala、Val、Asn。隨著發(fā)酵的進行，Glu和Asp的含量逐漸增加，Pro、Asn、Arg和Val的含量逐漸減少，Ala、Lys和Leu的含量基本維持在發(fā)酵1 個月的水平，這些變化趨勢與自然發(fā)酵極為相似，但自然發(fā)酵的各氨基酸發(fā)生急劇變化的時期均集中在前發(fā)酵1 個月；繼續(xù)發(fā)酵，智能發(fā)酵的變化速率略低于自然發(fā)酵。智能發(fā)酵3 個月，Asn含量偏低，約0.042 mg/g，其余8 種氨基酸的含量均高達自然發(fā)酵的2 倍。此外，甲硫氨酸（Met）含量隨發(fā)酵的進行不斷降低，由發(fā)酵1 個月0.219 mg/g下降至發(fā)酵3 個月的0.155 mg/g，此時約為自然發(fā)酵樣品的1.5 倍。其余低含量氨基酸，包括蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、異亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe），除在1 個月時累積量高達自然發(fā)酵的2 倍外，整個后熟初期基本維持在恒定水平。值得注意的是，智能發(fā)酵樣品中還檢出Cys，且隨發(fā)酵的進行持續(xù)增加。

綜上所述，利用智能發(fā)酵設備進行無光、保溫發(fā)酵能夠顯著增加醬醅的游離氨基酸含量，原因可能在于保溫發(fā)酵為微生物增殖和多種酶系作用提供了良好的外部環(huán)境，使產(chǎn)物迅速累積，有助于醬醅后熟風味的形成。

2.2.4 不同后發(fā)酵條件下?lián)]發(fā)性風味物質的變化規(guī)律

表2 不同后發(fā)酵工藝郫縣豆瓣特征風味物質比較分析Table 2 Comparative analysis of characteristic volatile flavor compounds of Pixian broad-bean pastes prepared by different post-fermentation processes

通過固相微萃取-氣相色譜-質譜法測定智能發(fā)酵樣品與自然發(fā)酵樣品前3 個月的揮發(fā)性風味物質，定性定量結果見表2，自然發(fā)酵樣品中檢出的風味物質種類明顯更多，但智能發(fā)酵樣品中風味物質含量顯著偏高，尤其是特征風味物質。兩種發(fā)酵方式樣品的香氣化合物均為酯類、醇類、醛類、酮類、酚類、酸類、烴類和其他雜環(huán)物質。風味物質種類較多的依次為酯類、烴類、醇類、醛類，酚類物質的種類數(shù)最低；含量較高的組分為醇類（14.7%～22.8%）、酯類（24.4%～43.1%）和酚類（16.8%～38.9%）。隨著智能發(fā)酵的進行，醛類和酮類化合物的種類和含量逐漸減少；酯類、醇類、酚類、酸類和烴類化合物的種類變化較小，含量逐漸增加；而其他化合物的種類逐漸增加，但含量不斷減少。比較智能發(fā)酵與自然發(fā)酵對郫縣豆瓣揮發(fā)性風味物質的影響，發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵樣品的香氣物質種類更為豐富，在后發(fā)酵1～3 個月，除酚類和酸類的種類數(shù)基本相同外，其他化合物的種類數(shù)均顯著高于智能發(fā)酵樣品。發(fā)酵3 個月，自然發(fā)酵樣品的種類數(shù)高達137 種，比智能發(fā)酵樣品多28 種。由此說明，自然發(fā)酵更有利于郫縣豆瓣揮發(fā)性物質的生成及保留。值得注意的是，盡管自然發(fā)酵樣品中香氣化合物更豐富，但濃度和閾值才是決定其對郫縣豆瓣風味貢獻大小的重要因素。智能發(fā)酵樣品中，醛類和酮類化合物的含量均顯著偏低，發(fā)酵3 個月，醛類僅為自然發(fā)酵樣品的43%，而其他各類化合物的含量均顯著偏高。由表2可知，特征醛類物質在自然發(fā)酵樣品中的種類略多，含量持續(xù)累積；在智能發(fā)酵樣品中，含量基本恒定。其他特征物質的種類在兩種發(fā)酵方式下基本相同，但智能發(fā)酵中的含量顯著偏高，尤其是醇類和酸類物質。

酯類化合物作為郫縣豆瓣風味中種類最豐富的組分，總量基本維持在500 ng/g以上水平。隨發(fā)酵的進行，酯類物質含量持續(xù)累積，且智能發(fā)酵樣品的累積速率明顯較快。發(fā)酵3 個月結束時，酯類物質總量約為自然發(fā)酵樣品的1.24 倍，其中特征酯類組分含量更高，如十六酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯等。智能發(fā)酵的無光保溫條件使有機酸和醇類物質更加豐富，增大了酯化反應的底物濃度，使郫縣豆瓣的酯香味更加濃郁，這與前人研究結論相似[9]。

醇類化合物是郫縣豆瓣風味中較重要的組分，許多醇類物質除本身具有愉悅的花果香外[24]，還能與酸類物質發(fā)生酯化作用，促進郫縣豆瓣酯香成分的生成。在智能發(fā)酵過程中，醇類物質含量持續(xù)增加，發(fā)酵3 個月含量為自然發(fā)酵樣品的1.44 倍，其中特征醇類組分的含量也急劇上升，3-甲硫基丙醇、芳樟醇、苯乙醇含量分別從5.192、62.062、188.256 ng/g升至21.366、174.679、413.056 ng/g，分別為自然發(fā)酵樣品的2.2、3.8、1.8 倍。在自然發(fā)酵過程中，太陽光的紫外線可能會對某些微生物的生長代謝產(chǎn)生一定抑制作用，尤其是與醇類化合物產(chǎn)生有關的酵母菌等的生長活動[9,29-30]，因此自然發(fā)酵的醇類物質沒有智能發(fā)酵的含量高。

醛類化合物也是郫縣豆瓣香氣的重要貢獻者，性質極活潑，易被還原為相應的醇[24,31]，其含量變化情況在2 種發(fā)酵方式中呈完全相反的趨勢。隨著發(fā)酵的進行，自然發(fā)酵樣品中醛類物質含量持續(xù)增加，由初期的146.712 ng/g增至185.125 ng/g，而智能發(fā)酵樣品中則不斷降低，降幅高達46%。此外，比較特征醛類組分發(fā)現(xiàn)，苯甲醛、苯乙醛、壬醛、3-甲硫基丙醛在發(fā)酵3 個月時，自然發(fā)酵樣品中的累積量分別為智能發(fā)酵樣品的3.8、2.3、3.6、2.9 倍。由此說明，光照在一定程度上能夠促進醛類物質的生成，其途徑可能通過紫外線促進氨基酸與水之間的反應[30]。醛類物質雖是醬香味的主要來源，但濃度并非越高越好。有研究表明，3-甲硫基丙醛和苯乙醛在啤酒中的含量與其質量呈負相關，在長期貯藏的啤酒中因其含量高而導致啤酒產(chǎn)生老化風味[32]。

酚類、酸類化合物在智能發(fā)酵中，含量也顯著偏高，發(fā)酵過程中累積速率明顯較快。酚類物質通常被鑒定為發(fā)酵制品的重要香氣化合物，如4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙基苯酚，其形成同樣與酵母菌等微生物有關[33]。智能發(fā)酵過程中，酚類含量持續(xù)增加，其中特征酚類組分4-乙基苯酚在歷經(jīng)3 個月發(fā)酵后，含量約為傳統(tǒng)發(fā)酵樣品的1.6 倍。同時，適宜的酸類物質在一定程度上能促進酯香成分生成，并協(xié)調整體呈味風格；但酸類物質累積過量極易產(chǎn)生不愉悅的刺激性酸味，其形成主要與乳酸菌和酵母菌的代謝活動有關[9,28]。智能發(fā)酵樣品中酸類物質含量為自然發(fā)酵樣品的2.6 倍，且特征酸類組分異戊酸僅在智能發(fā)酵樣品中檢出，這均表明智能發(fā)酵極大程度上促進了產(chǎn)酸微生物的代謝，體系酸性物質過量累積，使得酸味成為郫縣豆瓣的主導風味，嚴重影響了郫縣豆瓣的品質。

此外，雜環(huán)化合物中的吡嗪和吡咯類物質，因其易揮發(fā)、香氣強、低閾值而成為郫縣豆瓣的特征香氣組分，主要在甜瓣子發(fā)酵階段形成，在后熟期間濃度有所下降，并逐步形成醬香風格。比較發(fā)現(xiàn)，2,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪在智能發(fā)酵中的累積量分別為自然發(fā)酵的2.8、5.6 倍，因此智能發(fā)酵能夠在一定程度上加速郫縣豆瓣特征風味形成進度。

綜上所述，自然發(fā)酵的傳統(tǒng)翻曬露發(fā)酵工藝和智能發(fā)酵的無光保溫發(fā)酵工藝各有優(yōu)缺點，前者的揮發(fā)性物質種類更加豐富，發(fā)酵成品的整體風味更加協(xié)調、柔和，而后者雖能促進大部分特征風味物質形成（醛類物質除外），但會造成體系中過量酸類物質積累，嚴重影響整體感官品質。

2.2.5 不同后發(fā)酵類型的感官評價

對智能發(fā)酵與自然發(fā)酵3 個月的樣品進行感官評價。如圖11a所示，兩種樣品均表現(xiàn)出咸味適中、辣味適中、不甜不苦的滋味特征。但智能發(fā)酵樣品口感更加細膩，原因可能在于智能發(fā)酵設備攪拌更加均勻充分；同時，智能發(fā)酵樣品鮮味較足、酸味較重，說明智能發(fā)酵能夠促進鮮味氨基酸與有機酸的形成與累積，該結論與游離氨基酸、有機酸的測定結果相吻合，但突出的酸味感受并不是優(yōu)質郫縣豆瓣的特征。如圖11b所示，兩種樣品香味持久度相當，相比之下，智能發(fā)酵樣品風味更加濃郁，但其酸味過重使得整體風味呈現(xiàn)出不協(xié)調感，因此智能發(fā)酵在香味上的感官評分與自然發(fā)酵持平。從色澤上看，兩種樣品均呈現(xiàn)出光亮晶潤、顏色均勻的特點，但智能發(fā)酵樣品所表現(xiàn)出的油亮的深褐色，與郫縣豆瓣的特征色更加接近，這與色價測定結果一致，故智能發(fā)酵樣品色澤得分略高。而無論是智能發(fā)酵樣品，還是自然發(fā)酵樣品，從外觀上看均呈現(xiàn)出形態(tài)完整、醬體均勻、沒有雜質的狀態(tài)，故外觀得分相同?？傮w來看，智能發(fā)酵樣品的感官評分略高于自然發(fā)酵樣品。

圖11 智能發(fā)酵與自然發(fā)酵郫縣豆瓣的感官評分Fig. 11 Sensory scores of Pixian broad-bean pastes produced by intelligent fermentation and natural fermentation

3 結 論

利用自主設計的智能發(fā)酵設備，模擬傳統(tǒng)“翻曬露”工藝進行后發(fā)酵，采用單因素試驗對發(fā)酵工藝參數(shù)進行優(yōu)化，根據(jù)氨基酸態(tài)氮、可溶性氮、總酸和還原糖含量等理化指標和特征風味物質的檢出情況進行篩選，最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：攪拌1 次/d、1 min/次，無光照，28 ℃持續(xù)保溫，自然室內濕度。

在此基礎上進行智能發(fā)酵，并與自然發(fā)酵樣品比較，發(fā)現(xiàn)智能發(fā)酵樣品的含鹽量偏低，含水量、色價值、總酸含量較高，還原糖消耗速率、氨基酸態(tài)氮及可溶性氮生成速率較高，發(fā)酵周期縮短。對有機酸、游離氨基酸揮發(fā)性風味物質進行對比分析，發(fā)現(xiàn)智能發(fā)酵促進了郫縣豆瓣中有機酸的增加，有利于含氮化合物的累積，增加了醬醅中游離氨基酸含量，能夠促進大部分特征香氣物質形成（醛類物質除外），但會造成體系中過量酸類物質積累，影響整體感官品質；而自然發(fā)酵的揮發(fā)性物質種類較豐富，釀造成品的整體風味更協(xié)調。因此，在后續(xù)研究中需對酸類物質進行控制，避免累積過量。