Gene Xpert-MTB/RIF法快速診斷脊柱分枝桿菌及利福平耐受性的臨床應(yīng)用研究

姚海山，盧炯炯，郭 鑫，沈生軍*

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810000）

結(jié)核病是發(fā)展中國家最常見和最具挑戰(zhàn)性的疾病之一，我國是結(jié)核病的高發(fā)國家，同時也是耐多藥結(jié)核的高負(fù)擔(dān)國家。根據(jù)全球結(jié)核病報告，肺外結(jié)核病約占所有結(jié)核病的20%，其中脊柱結(jié)核是最常見的肌肉骨骼結(jié)核。脊柱結(jié)核發(fā)病隱匿，早期無典型臨床表現(xiàn)，且病灶位于椎體等深部組織，臨床標(biāo)本不易獲得。因此，脊柱結(jié)核診斷較為困難。當(dāng)大部分患者確診時，已存在明顯的脊柱骨質(zhì)破壞，并且常伴有神經(jīng)功能的損傷。所以脊柱結(jié)核的早期診斷及規(guī)范化治療有著重要意義。在已有的臨床診斷技術(shù)中，傳統(tǒng)顯微鏡檢查陽性率低，細(xì)菌培養(yǎng)時效性差，影像學(xué)表現(xiàn)特異度較低等諸多問題，延長了診斷時間，延緩了治療進(jìn)展。

1 Xpert-MTB/RIF技術(shù)的基本情況

Xpert-MTB/RIF技術(shù)是一種利用GeneXpert平臺（Cepheid, Sunnyvale, CA, United States）進(jìn)行的自動聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）測試（即分子測試）。能夠檢測結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥性，是一種簡便、快捷的實踐技術(shù)。Xpert-MTB/RIF技術(shù)利用分子信標(biāo)技術(shù)檢測利福平耐藥性，分子信標(biāo)是一種核酸探針，可以識別和報告正常的、利福平易感的野生型rpoB基因序列的存在或缺失。使用了5個不同顏色的信標(biāo)，每個信標(biāo)在擴(kuò)增的rpoB基因中覆蓋一個單獨(dú)的核酸序列。當(dāng)信標(biāo)與匹配序列結(jié)合時，它會發(fā)出熒光（或點(diǎn)亮），這表明存在利福平敏感結(jié)核病特有的基因序列之一。

Xpert-MTB/RIF技術(shù)的操作流程簡單方便，實驗室將接收的組織樣本用無菌研磨機(jī)在1～2毫升無菌生理鹽水中研磨，獲得質(zhì)地均勻的懸濁液，再用NaLC-NaOH對材料進(jìn)行去污。用無菌移液管吸取2 ml的樣本液體后，緩慢加入檢測盒的加樣孔中后，最后將檢測盒放入Xpert-MTB/RIF儀器中檢測。整個檢測流程約需2小時左右。與傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增檢測（NAATs）相比，結(jié)核分枝桿菌樣品處理、PCR擴(kuò)增和檢測集成到一個自成一體的測試單元。取樣后，所有的步驟都是自動化的，并包含在墨盒中。此外，用于溶解樣本的試劑是結(jié)核性的（也就是說，它有殺死結(jié)核細(xì)菌的能力），這在很大程度上消除了實驗過程中對生物安全的擔(dān)憂。這些特點(diǎn)使得該技術(shù)可以從中心實驗室或參考實驗室中取出，并在離病人更近的地方使用。

2 Xpert-MTB/RIF在脊柱結(jié)核中的發(fā)展情況

2010年9月，世界衛(wèi)生組織（世衛(wèi)組織）召集了一個專家小組，審查關(guān)于Xpert-MTB/RIF測定（美國加利福尼亞州森尼韋爾市Cepheid）準(zhǔn)確性的證據(jù)，目的是制定指導(dǎo)該試驗使用的建議。自2010年以來出現(xiàn)了大量關(guān)于Xpert-MTB/RIF技術(shù)的應(yīng)用數(shù)據(jù)，有必要更新世衛(wèi)組織的政策和指導(dǎo)。因此，世衛(wèi)組織全球結(jié)核病規(guī)劃委托進(jìn)行了三次系統(tǒng)審查，以更新和修訂指南。世衛(wèi)組織于2011年初發(fā)布了關(guān)于使用Xpert-MTB/RIF技術(shù)的政策建議，推薦Xpert-MTB/RIF應(yīng)作為對懷疑患有MDR-TB或HIV相關(guān)結(jié)核病的患者的初步診斷試驗和Xpert-MTB/RIF可被視為在MDR-TB或HIV不太受關(guān)注的環(huán)境下對顯微鏡的后續(xù)檢測，特別是在進(jìn)一步檢測涂片陰性標(biāo)本時。在2013年世衛(wèi)組織再次推薦使用Xpert-MTB/RIF技術(shù)診斷成人和兒童肺結(jié)核和利福平耐藥和Xpert-MTB/RIF技術(shù)用于診斷成人和兒童肺外結(jié)核及利福平耐藥。在我國Xpert-MTB/RIF技術(shù)較廣泛應(yīng)用于肺結(jié)核診療。目前，在脊柱結(jié)核這一方面的研究，我國處于初級研究階段。

3 Xpert-MTB/RIF法診斷技術(shù)應(yīng)用價值

Xpert-MTB/RIF法檢測結(jié)核分枝桿菌131個菌落形成單位（cfu/ml），比分枝桿菌培養(yǎng)法檢測100～1000 cfu/ml更為有效，且Xpert-MTB/RIF法檢測取決于標(biāo)本中MTBDNA的含量，并非培養(yǎng)法檢測依靠活菌計數(shù)。早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌有助于迅速開展適當(dāng)?shù)目菇Y(jié)核治療；利福平是否耐受有助于調(diào)整用藥。Liang Tang等根據(jù)術(shù)中獲取的脊柱結(jié)核病灶，特意將病灶分類為三組不同成分單一組織，其為膿液、肉芽腫組織及干酪樣組織。分組后進(jìn)行檢測脊柱脊柱分枝桿菌。結(jié)論認(rèn)為獲得膿液成分的標(biāo)本，可確保使用Xpert-MTB/RIF法更方便、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核分枝桿菌。Lin QX等對43名經(jīng)病理證實患有晚期關(guān)節(jié)結(jié)核的患者進(jìn)行了基于PCR的熒光檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉芽組織的陽性率高達(dá)74.42%，與干酪樣組織（58.14%）和膿液（37.21%）。與Liang Tang等研究相似，說明在不同部位的標(biāo)本中MTB-DNA含量差異較大，故Xpert-MTB/RIF法并非僅對膿液標(biāo)本有著較高的辨識度，而需要根據(jù)不同部位的標(biāo)本具體分析，而當(dāng)前國內(nèi)外缺乏這一方面的研究。Arockiaraj J等印度南部使用Xpert-MTB/RIF法回顧性研究中，以復(fù)合參考為參考標(biāo)準(zhǔn)，Xpert-MTB/RIF法敏感性和特異性分別為71.2%和100%。饒敬澄等人同以復(fù)合參考為金標(biāo)準(zhǔn)，其敏感性和特異性分別為74.4%和100%?？梢奨pert-MTB/RIF在診斷脊柱結(jié)核分枝桿菌有很高的特異性與敏感性。賈晨光等人經(jīng)研究，抗酸染色、BACTEC MGIT 960液體快速培養(yǎng)、Xpert-MTB/RIF檢測脊柱結(jié)核分枝桿菌的敏感度分別為38.35%、41.67%、79.76%，特異度分別為100.00%、100.00%、96.87%。金陽輝等研究所得，抗酸染色、BACTEC MGIT 960液體快速培養(yǎng)及Xpert-MTB/RIF檢測的總體敏感性分別為25.92%、48.15%和77.78%。特異度分別為100.00%、100.00%、96.87%。二者研究共同點(diǎn)在Xpert-MTB/RIF法比抗酸染色、BACTEC MGIT 960液體快速培養(yǎng)靈敏性更高，特異性均大于96%。而且抗酸染色及液體培養(yǎng)過程緩慢及敏感性低，所以Xpert-MTB/RIF法更適用早期診斷脊柱結(jié)核分枝桿菌。金陽輝等研究還提到不同操作方法獲得結(jié)核病灶后，用Xpert-MTB/RIF法檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感性由高到低依次為開放手術(shù)（83.78%）、B超穿刺（76.47%）、椎體穿刺（44.68%）。開放手術(shù)、B超穿刺與椎體穿刺組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Liang Tang等的結(jié)果相同，開放手術(shù)更利于獲得膿液、肉芽組織等有效成分。

綜上所述，通過Xpert-MTB/RIF系統(tǒng)檢測脊柱結(jié)核分枝桿菌及對利福平藥物耐受性方面是切實可行的，并且在檢測速度、靈敏性、特異性、生物安全性等多方面均顯示優(yōu)勢。雖然Xpert-MTB/RIF系統(tǒng)目前在我國脊柱結(jié)核方面的研究尚處于發(fā)展階段，但是，它的巨大潛力正推動這一領(lǐng)域逐漸獲得更多的關(guān)注。