從物質(zhì)-代謝-毒性關(guān)聯(lián)視角多維度解析雷公藤復(fù)方配伍“異類相制”減輕肝損傷機(jī)制

周學(xué)平，周玲玲，朱華旭，馮哲，謝彤，陸艷，王婧，付玲

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.是治療風(fēng)濕病常用藥物，臨床療效確切，備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，但臨床常見肝、腎、生殖系統(tǒng)等毒副作用[1-2]，尤以肝毒性為多，居單味中藥首位[3]。因此，如何降低其毒性而不影響療效，是臨床應(yīng)用中亟待解決的難題。

對雷公藤減毒的研究，已從劑型改革、結(jié)構(gòu)修飾和中藥配伍等多方面開展[4-6]。中藥復(fù)方的增效減毒是中醫(yī)藥的特色和優(yōu)勢，已有的臨床和實(shí)驗(yàn)研究均提示：復(fù)方配伍減毒可能是實(shí)現(xiàn)雷公藤合理用藥目的的主要途徑，但目前的研究多為選擇相應(yīng)功效的中藥對抗毒副反應(yīng)[7-8]，缺乏與治療疾病時理法方藥的緊密聯(lián)系，更少上升至中醫(yī)藥理論的研究。

清絡(luò)通痹方(雷公藤復(fù)方)是國醫(yī)大師周仲瑛教授的經(jīng)驗(yàn)方，治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎安全有效。本團(tuán)隊(duì)從長期的臨床應(yīng)用中得到啟示，創(chuàng)新性提出“異類相制”配伍減毒理論，認(rèn)為有毒中藥通過與不同性味、不同功效中藥的合理配伍，以調(diào)其偏性、制其毒性，能減輕或消除毒性，又可全面兼顧病情、增強(qiáng)藥效[9]。近年來本團(tuán)隊(duì)以清絡(luò)通痹方(雷公藤、生地、三七、僵蠶、青風(fēng)藤)為載體，選擇臨床常見的肝毒性為切入點(diǎn)，開展系列探索研究，從物質(zhì)-代謝-毒性關(guān)聯(lián)視角多維度解析雷公藤復(fù)方配伍“異類相制”減輕肝損傷機(jī)制。

1 雷公藤代謝性肝損傷特點(diǎn)及復(fù)方配伍減毒效應(yīng)

采用大、小鼠等不同動物及L-02、HepG2、HepaRG等肝細(xì)胞株，將雷公藤與清絡(luò)通痹復(fù)方中不同功效藥物分別配伍進(jìn)行干預(yù)，結(jié)合含藥血清和主要活性組分(雷公藤甲素、三七總皂苷、梓醇)，通過多種體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)：一定劑量的雷公藤或其主要毒性成分雷公藤甲素可引起動物肝組織和肝細(xì)胞損傷，出現(xiàn)肝功能指標(biāo)異常，肝臟過氧化指標(biāo)改變，肝細(xì)胞壞死、水腫、脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤等；糖脂代謝產(chǎn)物水平升高；肝細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，線粒體膜破壞、嵴斷裂、空泡變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少、斷裂。研究也發(fā)現(xiàn)，雷公藤復(fù)方或復(fù)方組分配伍均能有效改善上述異常改變，尤以清絡(luò)通痹全方效果最優(yōu)，雷公藤分別配伍三七、生地效果次之[10-12]。

團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果提示雷公藤肝毒性與代謝存在一定的關(guān)聯(lián)。因此，擬從代謝角度研究復(fù)方配伍減輕雷公藤肝毒性的機(jī)制。

2 復(fù)方配伍減輕雷公藤肝毒性的機(jī)制

肝臟是重要的代謝解毒器官，也是糖類及脂質(zhì)代謝的主要場所。毒性劑量的雷公藤可能通過改變外、內(nèi)源性代謝(藥物自身代謝和肝臟糖脂代謝)過程導(dǎo)致肝損傷，復(fù)方配伍不同功效的藥物可能從不同途徑影響代謝過程，從而發(fā)揮減毒效應(yīng)。

2.1 復(fù)方配伍調(diào)節(jié)雷公藤自身代謝和肝臟糖脂代謝而發(fā)揮減毒效應(yīng)

2.1.1 調(diào)節(jié)雷公藤自身代謝 雷公藤毒性成分主要是二萜內(nèi)酯類成分(雷公藤甲素等)，其次是生物堿類(雷公藤堿等)，二者同時又是主要藥效成分。團(tuán)隊(duì)采用指紋圖譜及指標(biāo)性成分含量測定方法研究了復(fù)方配伍前后雷公藤中上述化學(xué)成分的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)方配伍后無新的化合物產(chǎn)生，雷公藤甲素等二萜內(nèi)酯類和生物堿類成分在水提取液中的含量均有所降低，尤以全方及配伍三七、生地較為顯著。上述結(jié)果證明了復(fù)方配伍使雷公藤中毒性成分呈緩慢溶出的特征，改善了配伍前的“突釋”現(xiàn)象，這可能是雷公藤復(fù)方配伍減毒的機(jī)制之一[13-14]。

進(jìn)一步采用清絡(luò)通痹全方、雷公藤分別配伍方中各藥，給予模型動物后發(fā)現(xiàn)，全方及各配伍組中雷公藤甲素的最大血藥濃度(Cmax)下降，半衰期(T1/2)延長，作用時間也相對延長；雷公藤甲素在肝臟、腎臟中的分布均有下降趨勢，代謝時間延長。上述結(jié)果證明了雷公藤通過配伍三七、生地等藥，可顯著降低毒性[15]。該過程可能是由于配伍使得雷公藤甲素等毒性成分在治療域內(nèi)吸收強(qiáng)度減弱、作用時間相對延長，從而起到了控釋和緩釋調(diào)節(jié)作用。

2.1.2 調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝 團(tuán)隊(duì)的研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤所致的肝損傷多伴有糖類及脂質(zhì)代謝異常，如生化指標(biāo)血糖、血脂異常，基因芯片檢測顯示糖脂代謝相關(guān)基因表達(dá)改變等[16]。進(jìn)一步由氣質(zhì)聯(lián)用代謝組學(xué)及液質(zhì)聯(lián)用代謝組學(xué)平臺，分析雷公藤配伍前后大鼠血漿和肝組織代謝譜的變化。結(jié)果顯示復(fù)方配伍使機(jī)體的代謝譜發(fā)生了變化，全方能夠糾正雷公藤引起的肝損傷，雷公藤分別配伍生地、三七的作用次之。三七和生地可能是通過糾正機(jī)體的氨基酸代謝和脂肪酸代謝發(fā)揮配伍減毒作用[17-18]。分析代謝通路的關(guān)鍵代謝酶，發(fā)現(xiàn)雷公藤產(chǎn)生肝毒性主要來源于機(jī)體內(nèi)脂肪酸水平的升高[19]，復(fù)方配伍可使肝組織中升高的脂肪酸水平降低。

研究結(jié)果表明：雷公藤可同時影響機(jī)體的外、內(nèi)源性代謝，復(fù)方配伍可通過調(diào)節(jié)雷公藤引起的外、內(nèi)源性代謝變化而發(fā)揮減毒效應(yīng)。配伍減毒效應(yīng)的實(shí)現(xiàn)與影響雷公藤藥物代謝過程和內(nèi)源性代謝相關(guān)，且以調(diào)節(jié)內(nèi)源性糖脂代謝為主。

2.2 復(fù)方配伍通過調(diào)節(jié)肝臟代謝酶減輕雷公藤肝毒性

肝臟代謝酶在外、內(nèi)源性代謝過程中均發(fā)揮著重要的作用，其中細(xì)胞色素P450(CYP450)酶活性對Ⅰ相代謝的降解反應(yīng)起著決定性作用；葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)是Ⅱ相代謝時最重要的一種酶，可使毒性物質(zhì)解毒失活。

為了解雷公藤肝損傷過程中肝臟代謝酶的變化和復(fù)方配伍對上述變化的影響，團(tuán)隊(duì)建立了CYP450同工酶溫孵體系和超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，發(fā)現(xiàn)毒性劑量的雷公藤可導(dǎo)致肝內(nèi)CPY3A、CYP2C9、CPY2C19酶活性的下降，全方組大鼠肝臟CYP450含量顯著升高；酶促動力學(xué)研究表明，三七改善雷公藤抑制CYP3A的作用較明顯，而生地改善雷公藤抑制CYP2C19的作用較明顯[10,20]。配伍三七、青風(fēng)藤調(diào)節(jié)UGT1A1和UGT1A6的表達(dá)，配伍三七、僵蠶增加UGT2B7在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的表達(dá)[21]。

上述對大鼠肝臟Ⅰ/Ⅱ相代謝酶的分析提示，復(fù)方配伍可能通過對藥物代謝酶及多種亞酶活性、表達(dá)和定位的調(diào)節(jié)，減輕雷公藤肝毒性。

2.3 復(fù)方配伍調(diào)控核受體-代謝通路減輕雷公藤肝毒性

核受體是一組轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，一類為藥物代謝性核受體，如孕烷X受體(PXR)、組成型雄烷受體(CAR)等；一類為糖脂代謝性核受體，如過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)、肝X受體(LXR)、法尼醇X受體(FXR)等。核受體在機(jī)體藥物代謝、藥物解毒過程及糖脂代謝調(diào)控中起著重要作用。

2.3.1 復(fù)方配伍調(diào)控核受體-代謝通路的主要靶點(diǎn) 本團(tuán)隊(duì)采用基因芯片技術(shù)篩選及分析雷公藤復(fù)方配伍前后差異基因，發(fā)現(xiàn)其與CYP450酶、PPAR等核受體、脂肪酸延長等有關(guān)。雷公藤可下調(diào)CYP8B1、CYP2E1、CYP2C、CYP2B等代謝酶基因的表達(dá)，清絡(luò)通痹方可上調(diào)CYP3A4、CYP2E1、CYP8B1等代謝酶基因的表達(dá)。PCR進(jìn)一步驗(yàn)證，清絡(luò)通痹方可逆轉(zhuǎn)雷公藤導(dǎo)致的大鼠肝臟核受體PXR、CAR、PPAR轉(zhuǎn)錄水平的降低[16]。

2.3.2 復(fù)方配伍調(diào)控核受體-代謝通路減輕肝細(xì)胞損傷的機(jī)制 團(tuán)隊(duì)分別研究了PXR、CAR[22-23]等核受體在雷公藤肝毒性中的角色及對外、內(nèi)源性代謝的調(diào)控作用，在此基礎(chǔ)上探索復(fù)方配伍減輕肝毒性的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤復(fù)方組分配伍可影響CAR的表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)CYP3A4、CYP2C9、UGT1A6等Ⅰ/Ⅱ相代謝酶，促進(jìn)雷公藤自身代謝。研究表明調(diào)控核受體-代謝網(wǎng)絡(luò)是復(fù)方配伍減毒的重要機(jī)制之一，不同功效藥物作用的靶點(diǎn)存在差異，復(fù)方配伍通過多靶點(diǎn)、多通路作用實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)性調(diào)控效應(yīng)是“異類相制”減毒的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

2.4 復(fù)方配伍調(diào)節(jié)肝細(xì)胞自噬和凋亡減輕雷公藤肝毒性

雷公藤干擾代謝可誘發(fā)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，其在細(xì)胞自噬激活和凋亡機(jī)制中起著重要作用，雷公藤極性代謝產(chǎn)物亦可引起肝細(xì)胞線粒體損傷、氧化應(yīng)激，影響細(xì)胞自噬和凋亡。

團(tuán)隊(duì)研究中發(fā)現(xiàn)，毒性劑量的雷公藤能夠激活氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，這可能與機(jī)體的保護(hù)機(jī)制相關(guān)，隨著雷公藤甲素濃度的持續(xù)增加，過度自噬可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[24]。而復(fù)方配伍三七、生地或其活性組分可減輕雷公藤引起的過度自噬，從而起到減毒作用。

研究還發(fā)現(xiàn)配伍的活性組分主要通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf1/2的表達(dá)，影響Nrf1下游線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)和細(xì)胞色素C(Cyt-C)，降低線粒體損傷和細(xì)胞凋亡[12]；增加Nrf2下游基因NQO1和HO-1轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)抗氧化酶的抗氧化作用，從而保護(hù)線粒體；且多種組分組合比單一組分效應(yīng)更明顯[11]。可進(jìn)一步從肝細(xì)胞自噬和凋亡著眼，深入探討復(fù)方配伍減輕雷公藤毒性的關(guān)鍵機(jī)制。

3 “異類相制”理論的傳承與創(chuàng)新

3.1 “異類相制”是傳統(tǒng)方藥配伍理論基礎(chǔ)上的創(chuàng)新

中藥配伍理論及組方原則肇始于《神農(nóng)本草經(jīng)》《素問》，《神農(nóng)本草經(jīng)·序例》云：“若有毒宜制，可用相畏、相殺者，不爾勿合用也”；《素問·至真要大論》謂：“主病之謂君，佐君之謂臣，應(yīng)臣之謂使”，古代醫(yī)家則總結(jié)歸納為“七情”和“君、臣、佐、使”。其中“七情”配伍中的“相畏”“相殺”是指一種藥物的毒副作用能被另一種藥物所抑制；或一種藥物能減輕另一種藥物的毒性。而傳統(tǒng)“君、臣、佐、使”制方中的佐制藥可消除或減弱君、臣藥的毒性，或制約君、臣藥峻烈之性?？梢娤辔贰⑾鄽⒑妥糁扑幣湮榫芷鸬綔p毒作用。臨床實(shí)踐和科學(xué)研究表明：復(fù)方組成中起到配伍減毒的并非僅為佐藥或兩味藥間的“相畏”“相殺”，而是由多種藥物的交互協(xié)同或拮抗作用，達(dá)到既增效而又減毒的目的。傳統(tǒng)的中藥“七情”和方劑配伍理論已難以完全解釋諸多方藥配伍的解毒作用，“異類相制”是基于臨床實(shí)踐在傳承中醫(yī)方藥配伍理論基礎(chǔ)上的創(chuàng)新。

3.2 “異類相制”理論內(nèi)涵的現(xiàn)代闡釋

不同功效藥物(生地、三七、僵蠶、青風(fēng)藤)與雷公藤配伍，能降低雷公藤毒性物質(zhì)溶出，影響其體內(nèi)過程；調(diào)節(jié)藥物代謝酶，逆轉(zhuǎn)脂質(zhì)代謝的異常，也可調(diào)節(jié)代謝酶基因表達(dá)及肝臟核受體轉(zhuǎn)錄水平，通過調(diào)控核受體-代謝酶減輕雷公藤肝毒性；并調(diào)控Nrf1-線粒體途徑、Nrf2-抗氧化途徑，改善脂質(zhì)過氧化損傷、線粒體損傷和肝細(xì)胞過度自噬與凋亡，從而起到保護(hù)肝臟的作用。配伍減毒效應(yīng)以全方作用最佳，配伍生地、三七次之。

藥物的性味與功效密切相關(guān)，分析復(fù)方的藥物組成，歸納“異類相制”配伍減毒的方式主要有性味相制、異效相制、扶正制毒，且在組方中每多交互相呈。清絡(luò)通痹方中雷公藤祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛；生地滋陰補(bǔ)腎，益腎即可養(yǎng)肝；三七活血化瘀，“祛瘀生新”，尚有補(bǔ)血之功；青風(fēng)藤祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)；僵蠶祛風(fēng)解痙，化痰散結(jié)。生地、三七味甘，功偏補(bǔ)養(yǎng)，且三七性溫，可減雷公藤之苦寒，體現(xiàn)為性味相制，并通過扶正固本以制雷公藤之毒(肝毒性)；祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)之雷公藤與滋腎養(yǎng)肝之生地配伍，補(bǔ)瀉兼施，則為異效相制；青風(fēng)藤、僵蠶可增強(qiáng)雷公藤散邪之力，偏于增強(qiáng)藥效；諸藥配伍具有協(xié)同、互補(bǔ)的綜合效應(yīng)，以性味相制、異效相制、扶正相制的不同交互方式發(fā)揮“異類相制”配伍減毒作用。

研究運(yùn)用藥理毒理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)與分子生物學(xué)多學(xué)科的技術(shù)和方法，從整體動物、組織器官、細(xì)胞與亞細(xì)胞、分子基因不同層次，闡釋復(fù)方配伍協(xié)同減毒作用的微觀機(jī)制；不同功效藥物配伍通過細(xì)胞、分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的不同環(huán)節(jié)、不同靶點(diǎn)發(fā)揮的減毒效應(yīng)也體現(xiàn)了“異類相制”的特征，為方藥配伍理論源頭創(chuàng)新及指導(dǎo)雷公藤的臨床安全合理應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)語

依據(jù)疾病的病機(jī)立法組方，合理配伍有毒中藥，起到增效減毒的雙重效應(yīng)，與單純的對應(yīng)性配伍解毒藥物有異。從辨證論治過程來看，臨床在確定治法之后，依法遣藥組方，通過不同功效藥物的合理配伍，發(fā)揮其相輔相成、相反相制的綜合作用，以符合辨證論治的要求。在中醫(yī)藥理論中，多從功能主治的角度論述復(fù)方配伍的合理性，而對有毒中藥配伍減毒的組方理論闡述甚少。隨著臨床用藥經(jīng)驗(yàn)的積累，中藥復(fù)方配伍的目的與形式已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出“七情”和“君、臣、佐、使”所論范疇?！爱愵愊嘀啤崩碚撛从谂R床，為有毒中藥的臨床應(yīng)用提供了新的理論指導(dǎo)，應(yīng)深入闡明其科學(xué)內(nèi)涵，探討復(fù)方配伍減毒的機(jī)制，使中醫(yī)藥理論在傳承的基礎(chǔ)上發(fā)展創(chuàng)新，從而提高復(fù)雜難治性疾病的臨床療效及用藥安全性。