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    牛至細(xì)胞懸浮培養(yǎng)合成多酚及黑曲霉誘導(dǎo)子的促進(jìn)作用

    2020-12-12 13:26:56李燕平王小強(qiáng)沈倍韻周香菊趙文佳陳繼光尹忠平
    食品科學(xué) 2020年22期
    關(guān)鍵詞:號(hào)峰生物量質(zhì)譜

    李燕平,劉 媛,王小強(qiáng),沈倍韻,周香菊,趙文佳,陳繼光,,尹忠平,

    (1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330045;2.南開(kāi)大學(xué) 藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300350)

    牛至(Origanum vulgare)為唇形科牛至屬多年生草本植物[1],又名山薄荷、野荊芥、五香草,主要分布于我國(guó)的新疆、甘肅、湖北等省區(qū)以及地中海地區(qū)、北非、北美等地[2]。牛至中含有具有獨(dú)特香味、抗菌消炎活性的香荊芥酚、百里香酚等揮發(fā)性成分[3],可廣泛用于飲料、食用香料、食品防腐劑、飼料添加劑等[4-6]。除揮發(fā)油外,牛至還富含多酚、三萜和甾醇等非揮發(fā)性活性成分,其中迷迭香酸是牛至多酚類(lèi)物質(zhì)的主要成分。迷迭香酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和改善記憶等多方面的生理活性[7-8]。Kikuzaki等[9]從牛至葉片中分離得到了咖啡酸、迷迭香酸和原兒茶酸等5 種多酚類(lèi)物質(zhì),并證實(shí)其有很強(qiáng)的抗氧化活性。Farr等[10]研究發(fā)現(xiàn),迷迭香提取物中所含的迷迭香酸可以顯著提高SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。Rocha等[8]通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),迷迭香酸具有很好的抗氧化和抗炎能力。因此,牛至中迷迭香酸等多酚類(lèi)物質(zhì)具有很好的開(kāi)發(fā)利用前景。

    以植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等為原料提取植物次生代謝產(chǎn)物,雖然材料種類(lèi)多、來(lái)源廣,但植物生長(zhǎng)周期較長(zhǎng),依賴(lài)于自然條件,受環(huán)境和病蟲(chóng)害的影響較大,同時(shí)由于原料成分復(fù)雜,純化的難度較大、成本高;而植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物具有周期短、可控性強(qiáng)、受自然環(huán)境影響小、目標(biāo)物易于提取和純化等諸多優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是一種有巨大潛力的天然產(chǎn)物生產(chǎn)技術(shù)[11]。但從目前的研究報(bào)道看,植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物還存在產(chǎn)量較低的問(wèn)題,而通過(guò)添加誘導(dǎo)子進(jìn)行刺激可有效提高目標(biāo)物的產(chǎn)量,是解決這一問(wèn)題的較好途徑之一[12]。黑曲霉誘導(dǎo)子(Aspergillus nigerelicitor,ANE)是一種能刺激植物和微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的真菌誘導(dǎo)子,其通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起相關(guān)基因表達(dá)的變化,從而促進(jìn)多酚類(lèi)、萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)等特定次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[13]。Rajendran等[14]研究表明,ANE和黃曲霉誘導(dǎo)子均可顯著促進(jìn)胡蘿卜愈傷組織中花青素的合成。熊瓊瓊等[15]在青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中添加200 μg/mL的ANE,細(xì)胞內(nèi)總?cè)坪刻岣叩?9.52 mg/g,為對(duì)照組的10.21 倍。Yu Longjiang等[16]發(fā)現(xiàn)外源ANE可以提高紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)體系中紫杉醇合成相關(guān)酶的活性,從而顯著提高紫杉醇產(chǎn)量。上述研究表明,ANE對(duì)植物細(xì)胞合成次生代謝產(chǎn)物有較好的促進(jìn)作用。

    本研究以實(shí)驗(yàn)室前期建立的牛至細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系合成迷迭香酸等多酚類(lèi)物質(zhì),初步鑒定其中的多酚化合物種類(lèi),為進(jìn)一步提高多酚的含量和產(chǎn)量,采用ANE對(duì)懸浮培養(yǎng)的牛至細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),研究誘導(dǎo)對(duì)迷迭香酸等多酚合成的影響,旨在為牛至細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)多酚提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞由江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;黑曲霉(CGMCC3.0453)購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

    MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;甲醇(色譜純) 美國(guó)Tieda試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TripleTOF5600+超高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-time of flight-tandem mass spectrometry,UPLC-TOF-MS/MS)儀美國(guó)ABSciex公司;1260高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀 美國(guó)Agilent科技有限公司;SW-CJ-ICU潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;ZHWY-3222回旋振蕩搖瓶機(jī)美國(guó)惠普公司;V-5600紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;SY-360超聲波提取儀 上海寧商超聲儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 牛至細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

    選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,重新接種到新的MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:MS培養(yǎng)基添加3.0 mg/L激動(dòng)素、0.5 mg/L二氯苯氧乙酸和30 g/L蔗糖,置于含有250 mL培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中進(jìn)行振蕩光培養(yǎng),接種量(鮮細(xì)胞質(zhì)量/培養(yǎng)液體積)為15 g/100 mL,培養(yǎng)pH值為5.8±0.2,溫度(28±1)℃,轉(zhuǎn)速120 r/min,每10 d繼代一次。

    1.3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制

    參照Liu Zebo等[17]方法。選取生長(zhǎng)迅速、性狀穩(wěn)定、活力高的10 d齡懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,篩網(wǎng)過(guò)濾后,稱(chēng)取6 g接種于裝有40 mL MS液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中,其他培養(yǎng)條件同1.3.1節(jié),培養(yǎng)16 d,每2 d收獲一次,烘干稱(chēng)質(zhì)量。以干質(zhì)量(g)為縱坐標(biāo)、收獲時(shí)間(d)為橫坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

    1.3.3 細(xì)胞生物量的測(cè)定

    將懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行真空抽濾后,置于50 ℃恒溫烘箱中烘干至質(zhì)量恒定,稱(chēng)量得干質(zhì)量。

    1.3.4 細(xì)胞活力的測(cè)定

    參照劉澤波[18]方法,采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)法。稱(chēng)取洗滌后的懸浮細(xì)胞200 mg,放入試管,加入0.1% TTC溶液(用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制成pH 7)5 mL,置于22 ℃恒溫箱中染色26 h。取出吸去TTC液,用重蒸餾水漂洗2~3 次后,加入5 mL 95%乙醇溶液,置于60 ℃水浴中孵育30 min,待細(xì)胞完全無(wú)色后,離心,取上清液在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,吸光度越大,則細(xì)胞活力越強(qiáng)。

    1.3.5 細(xì)胞總多酚的提取

    準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞粉末于試管中,加入20 mL 50%甲醇溶液,在50 ℃恒溫條件下超聲輔助提取50 min,提取液4 000 r/min離心10 min,收集上清液,低溫避光保存,備用。

    1.3.6 總多酚含量測(cè)定

    采用福林-酚比色法,參照朱仙慕等[19]的方法,以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得回歸方程y=0.010 6x+0.016 9 (y為吸光度,x為沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)),檢測(cè)范圍為20~120 μg/mL,R2為0.999 2??偠喾雍恳悦靠伺V翍腋∨囵B(yǎng)細(xì)胞(干質(zhì)量)樣品中沒(méi)食子酸當(dāng)量(mg)表示。

    1.3.7 HPLC及UPLC-TOF-MS/MS檢測(cè)條件

    將1.3.5節(jié)制得的樣品溶液,經(jīng)0.45 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾,備用。標(biāo)準(zhǔn)品均用50%甲醇溶液溶解,經(jīng)0.45 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾,備用。

    HPLC檢測(cè)條件:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流速1 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流動(dòng)相:乙腈(A)-0.2%醋酸溶液(B),梯度洗脫(0~40 min,5%~37.5% A、95%~62.5% B;40~45 min,37.5%~5% A、62.5%~95% B);檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm。

    U P L C-TO F-M S/M S 檢 測(cè) 條 件 : U P L C 條 件 :流速0.3 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL;流動(dòng)相:乙腈(A)-0.2%醋酸溶液(B),梯度洗脫(0~20 min,5%~40% A、95%~60% B;20~30 min,40%~95% A、60%~5% B;30~32 min,95% A、5% B;32~35 min,95%~5% A、5%~95% B),檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm。MS/MS條件:采用負(fù)離子模式;毛細(xì)管電壓3 500 V;質(zhì)量掃描范圍m/z50~1 250;霧化氣壓力40 psi;干燥氣流速10 L/min;干燥氣溫度350 ℃;碰撞電壓120 V。

    1.3.8 迷迭香酸含量測(cè)定

    采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定,具體條件如1.3.7節(jié)所示。以迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=10 989x+7.712 4(y為吸光度,x為迷迭香酸質(zhì)量濃度(μg/mL)),檢測(cè)范圍為25~400 μg/mL,R2為0.999 4。迷迭香酸含量以每克牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞(干質(zhì)量)樣品中迷迭香酸當(dāng)量(mg)表示。

    1.3.9 ANE的制備

    參照熊瓊瓊[15]的方法,取振蕩培養(yǎng)7 d的成熟黑曲霉菌絲,置于十字研磨器中,添加適量磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行研磨勻漿,4 000 r/min離心10 min;取上層懸濁液,121 ℃滅菌30 min,即得ANE。ANE質(zhì)量濃度以總糖含量計(jì),以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn),采用蒽酮-硫酸比色法進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.10 誘導(dǎo)參數(shù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    ANE質(zhì)量濃度:牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處理、培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié),培養(yǎng)至第10天時(shí)分別添加質(zhì)量濃度為25、50、100、200 μg/mL的ANE,空白對(duì)照組加入等體積的緩沖液(pH 6.0),繼續(xù)培養(yǎng)2 d后收獲細(xì)胞。

    ANE添加時(shí)間:牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處理、培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié),分別在指數(shù)生長(zhǎng)初期(第8天)、指數(shù)生長(zhǎng)中期(第10天)、指數(shù)生長(zhǎng)末期(第12天)添加50 μg/mL的ANE,空白對(duì)照組在相同時(shí)間點(diǎn)加入等體積的緩沖液(pH 6.0),均在添加誘導(dǎo)子后繼續(xù)培養(yǎng)2 d收獲細(xì)胞。

    ANE持續(xù)作用時(shí)間:牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處理、培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié),待其生長(zhǎng)至第10天時(shí)加入50 μg/mL的ANE,每組均設(shè)置空白對(duì)照,空白對(duì)照組均在相同時(shí)間點(diǎn)加入等體積的緩沖液(pH 6.0),持續(xù)作用1、2、3 d后收獲細(xì)胞。

    1.3.11 優(yōu)化誘導(dǎo)參數(shù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處理、培養(yǎng)條件同1.3.2節(jié),采用單因素試驗(yàn)得出的最佳條件,測(cè)定其生物量、總多酚和迷迭香酸的含量及產(chǎn)量,設(shè)置空白對(duì)照組,空白對(duì)照組加入等體積的緩沖液(pH 6.0),每組均設(shè)置3 個(gè)平行。

    1.4 統(tǒng)計(jì)分析

    數(shù)據(jù)采用Origin和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù),數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性

    如圖1所示,牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線總體呈典型的“S”型,與文獻(xiàn)報(bào)道的青錢(qián)柳[20]、黃梔子[17]細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線基本相似。為期16 d的生長(zhǎng)周期大致可以劃分為4個(gè)階段:遲滯期(0~8 d)、指數(shù)生長(zhǎng)期(8~12 d)、穩(wěn)定期(12~14 d)及衰退期(14~16 d)。當(dāng)牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞剛接種到新的培養(yǎng)環(huán)境中時(shí),需要一定時(shí)間適應(yīng)新環(huán)境,因此有一個(gè)較長(zhǎng)的生長(zhǎng)遲滯期,此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢;當(dāng)細(xì)胞逐漸適應(yīng)了新的培養(yǎng)環(huán)境,開(kāi)始迅速增殖,進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期(8~12 d),4 d時(shí)間內(nèi)細(xì)胞生物量從8.5 g/L迅速提高到19.00 g/L;第12天為細(xì)胞生物量最大時(shí)間點(diǎn),此時(shí)細(xì)胞呈濃密狀態(tài),且無(wú)褐化現(xiàn)象;14 d后細(xì)胞逐漸衰亡,生物量逐漸下降,出現(xiàn)較明顯褐化現(xiàn)象。

    圖1 牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curve of suspension-cultured O. vulgare cells

    2.2 牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞多酚的合成特征

    圖2 牛至細(xì)胞總多酚含量和產(chǎn)量Fig. 2 Content and yield of polyphenols in suspension-cultured O. vulgare cells

    如圖2所示,在為期16 d的生長(zhǎng)周期中,總多酚含量大致呈“一”字型,而其產(chǎn)量走勢(shì)大致和生長(zhǎng)曲線相似呈典型的“S”型,且均在第12天達(dá)到峰值,分別為9.58 mg/g、182.08 mg/L。在生長(zhǎng)周期的前8 d,細(xì)胞總多酚含量基本維持在同一水平,但其產(chǎn)量逐漸增加;培養(yǎng)8~12 d,總多酚含量呈現(xiàn)小幅增加的趨勢(shì),可能此期間是細(xì)胞多酚的合成期;培養(yǎng)12 d后,細(xì)胞逐漸衰亡,總多酚含量和產(chǎn)量也逐漸下降。綜合分析牛至細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和多酚的積累量可知,在整個(gè)生長(zhǎng)周期中,總多酚含量一直維持在相對(duì)較低水平,其產(chǎn)量也相對(duì)較低,且其產(chǎn)量的提高大部分是由生物量引起的而非含量。目前的研究表明,ANE誘導(dǎo)是提高植物細(xì)胞次生代謝物含量的有效手段。杜坤玉[21]用黑曲霉粗提物處理虎杖愈傷組織,發(fā)現(xiàn)其白藜蘆醇含量顯著提高。劉澤波等[22]在青錢(qián)柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中加入200 μg/mL ANE 10 h后,三萜含量提高到了36.46 mg/g,為對(duì)照組的3.36 倍。因此,后續(xù)進(jìn)行ANE誘導(dǎo)研究,以進(jìn)一步提高牛至細(xì)胞總多酚含量。

    2.3 牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞多酚類(lèi)物質(zhì)的鑒定

    2.3.1 HPLC分析

    圖3 牛至細(xì)胞提取物的PLC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of the extract from O. vulgare cells

    由圖3可知,在本實(shí)驗(yàn)所采用的檢測(cè)方法和條件下,樣品溶液中的各色譜峰得到了較好分離,表明其中的化合物分離度較好,可以采用此條件進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)和分析;細(xì)胞提取物檢測(cè)色譜圖中主要有7 個(gè)色譜峰,為了確定這7 個(gè)色譜峰所代表的物質(zhì),結(jié)合UPLC-TOF-MS/MS進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)和分析。

    2.3.2 UPLC-TOF-MS/MS分析

    在HPLC檢測(cè)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用UPLC-TOF-MS/MS對(duì)牛至懸浮細(xì)胞提取物中的多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行鑒定,UPLC圖和總離子流圖如圖4所示,各物質(zhì)二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5。在UPLC-TOF-MS/MS檢測(cè)圖譜中,保留時(shí)間為1.25 min處有一個(gè)較高的峰,通過(guò)對(duì)比其與樣品制備所用溶劑的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息,推斷為溶劑峰而非次級(jí)代謝產(chǎn)物峰。

    圖4 UPLC(a)和總離子流圖(b)Fig. 4 UPLC chromatogram (a) and total ion current chromatogram (b)

    圖5 UPLC-TOF-MS/MS測(cè)定牛至細(xì)胞多酚類(lèi)物質(zhì)Fig. 5 Detection of polyphenols from suspension-cultured O. vulgare cells by UPLC-TOF-MS/MS

    1號(hào)峰的保留時(shí)間為2.81 min,其分子離子峰[M-H]-為m/z315.073 3,與原兒茶酸和己糖形成的糖苷類(lèi)化合物的分子質(zhì)量相吻合。在其二級(jí)質(zhì)譜中,出現(xiàn)了m/z152.013 6、153.020 5、108.025 4和109.032 5的特征碎片離子(圖5a),與Karar等[23]所鑒定的原兒茶酸-O-己糖苷的質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)基本相符。因此,初步推斷1號(hào)峰為原兒茶酸-O-己糖苷。

    2號(hào)峰的保留時(shí)間為3.98 min,其分子離子峰[M-H]-為m/z299.114 6,二級(jí)質(zhì)譜中有59.021 6、119.054 5、71.019 2和137.067 0等特征碎片離子(圖5b),參照文獻(xiàn)[24]推斷2號(hào)峰為紅景天苷。細(xì)胞多酚提取物加入紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行HPLC檢測(cè),結(jié)果表明紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品與2號(hào)峰出峰時(shí)間一致,加標(biāo)后的峰面積相應(yīng)增大,峰形左右對(duì)稱(chēng)。因此,推斷2號(hào)峰為紅景天苷。

    3號(hào)峰的保留時(shí)間為4.78 min,其質(zhì)譜信息與Karar等[23]等通過(guò)UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS法鑒定山楂中所含的水楊酸-O-葡糖苷的質(zhì)譜信息基本一致,其[M-H]-為m/z299.078 5,二級(jí)質(zhì)譜中有m/z93.038 9和137.026 5這兩個(gè)主要碎片離子峰(圖5c)。因此,推斷3號(hào)峰為水楊酸-O-葡糖苷。

    4、5、6號(hào)峰的保留時(shí)間分別為10.074、11.598 min和12.438 min,其分子離子峰m/z分別為521.129 7、359.082 0和373.093 4,二級(jí)質(zhì)譜中均有m/z161.02、135.04、179.03、197.04這些特征碎片離子峰。研究表明,迷迭香酸分子離子峰為[M-H]-為m/z359.08,二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子峰為m/z161.02、135.04、179.04、197.04[25]。因此,推斷這3 個(gè)化合物為迷迭香酸及其衍生物。5號(hào)峰的二級(jí)碎片主要有161.025 7、133.031 4、135.045 9、179.035 7和197.046 0(圖5e),其質(zhì)譜信息與Parejo等[25]所鑒定的迷迭香酸檢測(cè)數(shù)據(jù)基本一致,推斷5號(hào)峰為迷迭香酸。通過(guò)加入迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC檢測(cè),確證5號(hào)峰為迷迭香酸。4號(hào)峰和6號(hào)峰的二級(jí)碎片還分別有323.077 2、359.082 0、521.129 7(圖5d)和175.041 0(圖5f),通過(guò)與Yang Yimin[26]和Abedini[27]等報(bào)道的質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì),推斷4號(hào)峰為迷迭香酸-3-O-葡糖苷,6號(hào)峰為迷迭香酸甲酯。

    保留時(shí)間為6.8 min的色譜峰,其分子離子峰為m/z221.047 8,二級(jí)質(zhì)譜特征碎片峰的m/z77.045 9、133.068 5、55.027 9、159.047 0、131.052 4,尚未發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)報(bào)道,因此目前還無(wú)法做出判斷,有待于進(jìn)一步鑒定。

    2.4 ANE質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和多酚積累的影響

    2.4.1 ANE質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

    由圖6可知,在設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)添加ANE,細(xì)胞生物量無(wú)顯著性差異,細(xì)胞活力基本保持在同一水平,說(shuō)明添加25~200 μg/mL ANE對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。當(dāng)ANE質(zhì)量濃度低于200 μg/mL時(shí),所收獲細(xì)胞的外觀形態(tài)和顏色與對(duì)照組相比基本沒(méi)有差異,均呈淡黃白色;當(dāng)ANE質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時(shí),細(xì)胞發(fā)生了輕微的褐化,細(xì)胞顏色加深,呈淡黃褐色(圖7a)。較高質(zhì)量濃度的ANE處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一定程度的褐化,這與李萍等[28]的研究報(bào)道相似。為了觀察ANE誘導(dǎo)作用下懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在微觀形態(tài)上的變化,在倒置顯微鏡下觀察了不同ANE質(zhì)量濃度處理下的細(xì)胞形態(tài)(圖7b),發(fā)現(xiàn)在設(shè)定范圍內(nèi),ANE誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的微觀形態(tài)基本沒(méi)有影響,細(xì)胞均為圓形或橢圓形,大多數(shù)細(xì)胞聚集成10 個(gè)細(xì)胞左右的細(xì)胞團(tuán)。Yin Zhongping等[20]在研究青錢(qián)柳細(xì)胞生長(zhǎng)的研究中表明,單細(xì)胞和過(guò)大的細(xì)胞聚集體均不利于細(xì)胞生長(zhǎng),最適合青錢(qián)柳細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞聚集體大小為10~80 個(gè)細(xì)胞。

    圖6 不同質(zhì)量濃度AN作用下的細(xì)胞生物量及細(xì)胞活力Fig. 6 Biomass and viability of the harvested cells under the elicitation of ANE at different concentrations

    圖7 AN作用下細(xì)胞外觀(a)和顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)(b)Fig. 7 ANE-elicited cells (a) and its morphology observed under inverted microscope (b)

    2.4.2 ANE質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞多酚積累的影響

    由圖8可知,隨著ANE質(zhì)量濃度的增加,細(xì)胞總多酚和迷迭香酸(細(xì)胞中的代表性多酚化合物)的含量和產(chǎn)量均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì),大致呈倒“V”字形,均在50 μg/mL時(shí)達(dá)到最高峰值;細(xì)胞總多酚的峰值含量和產(chǎn)量分別為26.21 mg/g、485.00 mg/L,分別增加了1.67 倍和1.83 倍;迷迭香酸的峰值含量和產(chǎn)量分別為18.55 mg/g、336.77 mg/L,分別增加了2.24 倍和2.37 倍。在懸浮培養(yǎng)的牛至細(xì)胞中,迷迭香酸是多酚中的主要成分,其占總多酚比例在58.35%~76.76%之間,ANE對(duì)細(xì)胞多酚合成的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在促進(jìn)迷迭香酸的合成上。綜合分析細(xì)胞生物量、總多酚含量和產(chǎn)量的變化規(guī)律可知,ANE誘導(dǎo)牛至懸浮培養(yǎng)細(xì)胞合成多酚的作用效果是通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)迷迭香酸等多酚物質(zhì)的含量實(shí)現(xiàn)的,而非細(xì)胞生物量。劉冉[29]在以茉莉酸甲酯誘導(dǎo)紅松細(xì)胞多酚合成的研究中發(fā)現(xiàn),1.00~2.50 μmol/L茉莉酸甲酯處理組與對(duì)照組相比,原花青素積累量沒(méi)有顯著差異;當(dāng)濃度為5.00、10.00 μmol/L時(shí),原花青素含量顯著高于對(duì)照組;而高濃度(20.00~40.00 μmol/L)處理則顯著降低了原花青素的積累量,其誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本研究基本一致。

    圖8 不同質(zhì)量濃度AN作用下牛至細(xì)胞迷迭香酸、總多酚的含量和產(chǎn)量Fig. 8 Contents and yields of rosmarinic acid and polyphenol in O. vulgare cells under the elicitation of ANE at different concentrations

    2.5 ANE添加時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和多酚積累的影響

    2.5.1 不同時(shí)間點(diǎn)添加ANE對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

    圖9 不同時(shí)間點(diǎn)添加AN作用下細(xì)胞生物量(A)和細(xì)胞活力(B)Fig. 9 Biomass (A) and viability (B) of cells under the elicitation of ANE added at different times

    在指數(shù)生長(zhǎng)初期添加ANE對(duì)牛至懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)有輕微的抑制作用,此時(shí)細(xì)胞生物量下降為對(duì)照組的94%;在指數(shù)生長(zhǎng)中期和末期添加誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)基本沒(méi)有影響,ANE誘導(dǎo)組的細(xì)胞生物量大致與對(duì)照組細(xì)胞生物量持平(圖9A)。細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果(圖9B)表明,隨著時(shí)間的推移,細(xì)胞活力呈逐漸下降的趨勢(shì);在不同的時(shí)間點(diǎn)添加誘導(dǎo)子,ANE組細(xì)胞活力與對(duì)照組細(xì)胞活力基本一致,說(shuō)明添加50 μg/mL ANE不會(huì)抑制細(xì)胞活力。此外,在指數(shù)生長(zhǎng)期添加誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞的外觀形態(tài)沒(méi)有影響,培養(yǎng)瓶中均有細(xì)胞掛壁,細(xì)胞培養(yǎng)物呈現(xiàn)濃稠膏狀,真空抽濾后的細(xì)胞顆粒均一、呈細(xì)砂狀(圖10)。

    圖10 第10天添加50 誘導(dǎo)作用2 d后的細(xì)胞Fig. 10 Cells elicited for 2 days by ANE added on the 10th day

    2.5.2 不同時(shí)間點(diǎn)添加ANE對(duì)細(xì)胞多酚積累的影響

    圖11 不同時(shí)間點(diǎn)添加AN作用下迷迭香酸、總多酚的含量(a)和產(chǎn)量(b)Fig. 11 Contents (a) and yields (b) of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of ANE with different addtion times

    有研究表明,在遲滯期添加誘導(dǎo)子會(huì)抑制次生代謝產(chǎn)物的合成,而在穩(wěn)定期添加誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有刺激效果,因?yàn)榇藭r(shí)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分基本被消耗完,細(xì)胞已經(jīng)停止生長(zhǎng);只有指數(shù)生長(zhǎng)期最適于誘導(dǎo),此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、活力最強(qiáng),對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗最快,次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)酶的表達(dá)量最高,添加誘導(dǎo)子往往能達(dá)到最佳刺激效果。何夢(mèng)玲等[30]分別在廣藿香懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的第0、7、9、13天時(shí)加入1 mg/L水楊酸進(jìn)行誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)在第9天(指數(shù)生長(zhǎng)初期)添加誘導(dǎo)效果最好。王瑩[31]對(duì)培養(yǎng)至第9~11天的紅豆杉細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)在指數(shù)期添加誘導(dǎo)子能迅速、顯著提高次生代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)信號(hào)強(qiáng)度,細(xì)胞對(duì)刺激最敏感,且不同時(shí)期誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)的機(jī)制也不同。結(jié)合2.1節(jié)和2.2節(jié)研究結(jié)果可知,牛至細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)期是多酚的合成期,因此本研究選擇細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初、中、末期3 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)添加ANE以促進(jìn)牛至細(xì)胞多酚的合成,圖11表明,在指數(shù)生長(zhǎng)期的不同時(shí)間點(diǎn)添加50 μg/mL ANE進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí),對(duì)細(xì)胞合成多酚的刺激效果差別很大。在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初期和中期添加誘導(dǎo)子,細(xì)胞總多酚的積累量顯著提高,含量分別提高了1.43 倍和1.76 倍,其中迷迭香酸含量分別提高了1.51 倍和2.27 倍,而在指數(shù)生長(zhǎng)末期添加誘導(dǎo)子基本上沒(méi)有促進(jìn)作用,ANE誘導(dǎo)組細(xì)胞總多酚含量與對(duì)照組大致相同。

    綜合分析誘導(dǎo)子對(duì)牛至細(xì)胞的生長(zhǎng)和總多酚積累的影響可知,在指數(shù)生長(zhǎng)中期(第10天)添加ANE,對(duì)多酚合成的誘導(dǎo)效果最好,此時(shí)總多酚產(chǎn)量達(dá)到485.00 mg/L,提高了1.80 倍,其中迷迭香酸產(chǎn)量占70.12%,達(dá)到340.08 mg/L,是對(duì)照組的3.27 倍。因此,細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期為添加ANE的最佳時(shí)間點(diǎn)。

    2.6 ANE持續(xù)作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和多酚積累的影響

    圖12 不同AN作用時(shí)間下細(xì)胞生物量、細(xì)胞活力(a)和添加AN作用2 d后的細(xì)胞液外觀(b)Fig. 12 Biomass and viability of cells under the elicitation of ANE for different durations (a) and cells elicited by ANE for 2 days (b)

    誘導(dǎo)子作用1~3 d,誘導(dǎo)組的細(xì)胞生物量和細(xì)胞活力與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(圖12a),添加50 μg/mL ANE對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。此外,誘導(dǎo)子作用時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的外觀形態(tài)沒(méi)有顯著影響(圖12b),但ANE作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞合成多酚的影響較為顯著(表1)。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞總多酚含量和產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)作用時(shí)間為2 d時(shí),ANE對(duì)細(xì)胞合成多酚的促進(jìn)效果最好,此時(shí)總多酚含量提高了1.62 倍,產(chǎn)量為480.38 mg/L;其中迷迭香酸含量提高了2.28 倍,產(chǎn)量達(dá)到353.25 mg/L。因此,ANE誘導(dǎo)的最佳作用時(shí)間為2 d。Zhao Jian等[32]研究也表明,如果誘導(dǎo)子處理時(shí)間太短,誘導(dǎo)效果不明顯,但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可能會(huì)抑制次生代謝產(chǎn)物合成并造成細(xì)胞死亡。

    表1 AN不同作用時(shí)間下迷迭香酸、總多酚的含量和產(chǎn)量Table 1 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of AN for different durations

    表1 AN不同作用時(shí)間下迷迭香酸、總多酚的含量和產(chǎn)量Table 1 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of AN for different durations

    時(shí)間/d 指標(biāo) 迷迭香酸 總多酚對(duì)照組 ANE組 對(duì)照組 ANE組作用1 含量/(mg/g) 5.82±0.12 13.19±0.95 10.03±0.26 20.82±1.19產(chǎn)量/(mg/L) 98.94±2.29 224.23±8.91 170.51±3.59 353.94±10.54 2 含量/(mg/g) 5.74±0.21 18.84±1.24 9.79±1.07 25.62±1.07產(chǎn)量/(mg/L) 107.63±2.24 353.25±10.28 183.56±2.55 480.38±10.39 3 含量/(mg/g) 5.78±0.11 16.02±1.23 11.21±1.04 23.85±1.04產(chǎn)量/(mg/L) 112.71±2.38 312.39±9.74 218.60±2.57 465.08±10.88

    2.7 ANE優(yōu)化誘導(dǎo)條件的驗(yàn)證

    對(duì)優(yōu)化的ANE誘導(dǎo)條件進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,優(yōu)化誘導(dǎo)條件下(即在第10天添加50 μg/mL ANE,持續(xù)作用2 d后收獲細(xì)胞),ANE誘導(dǎo)組細(xì)胞的迷迭香酸含量和產(chǎn)量分別為對(duì)照組的3.25 倍和3.33 倍,總多酚含量和產(chǎn)量分別為對(duì)照組的2.83 倍和2.90 倍(表2),與前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致,表明ANE誘導(dǎo)確實(shí)能有效地促進(jìn)細(xì)胞合成多酚。孫思琳等[33]研究了硫化氫對(duì)白樺懸浮細(xì)胞多酚積累的影響,結(jié)果表明經(jīng)硫化氫處理后,細(xì)胞多酚含量為2.70 mg/g,是對(duì)照組的1.37 倍;劉冉等[34]分別以60、80 μmol/L茉莉酸甲酯和水楊酸誘導(dǎo)紅松細(xì)胞,松多酚的含量分別增加了7.23 mg/g和14.68 mg/g;與上述研究結(jié)果相比,牛至細(xì)胞經(jīng)ANE誘導(dǎo)后多酚含量和產(chǎn)量都處于更高水平,說(shuō)明ANE對(duì)牛至細(xì)胞合成多酚具有更加顯著的誘導(dǎo)效果,因此具有較好的應(yīng)用前景。

    表2 優(yōu)化后的AN誘導(dǎo)作用條件下牛至懸浮細(xì)胞迷迭香酸和總多酚的含量及產(chǎn)量Table 2 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in AN-treated O. vulgare cells under optimized conditions

    表2 優(yōu)化后的AN誘導(dǎo)作用條件下牛至懸浮細(xì)胞迷迭香酸和總多酚的含量及產(chǎn)量Table 2 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in AN-treated O. vulgare cells under optimized conditions

    總多酚產(chǎn)量/(mg/L)ANE組 0.76±0.02 19.02±0.28 27.16±0.78 361.38±8.77 516.04±10.23對(duì)照組 0.74±0.03 5.86±0.12 9.61±0.19 108.41±9.11 177.79±2.97組別 生物量/(g/40 mL)迷迭香酸含量/(mg/g)總多酚含量/(mg/g)迷迭香酸產(chǎn)量/(mg/L)

    3 結(jié) 論

    以牛至細(xì)胞懸浮培養(yǎng)合成多酚,通過(guò)UPLC-TOFMS/MS鑒定了該細(xì)胞中原兒茶酸-O-己糖苷、紅景天苷、水楊酸-O-葡糖苷、迷迭香酸-3-O-葡糖苷、迷迭香酸和迷迭香酸甲酯6 種多酚類(lèi)物質(zhì);50 μg/mL ANE可顯著促進(jìn)牛至細(xì)胞多酚的合成,誘導(dǎo)后總多酚的含量和產(chǎn)量分別增加了1.83 倍和1.90 倍,其中迷迭香酸含量和產(chǎn)量分別增加了2.25 倍和2.33 倍。

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