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    pH值處理對(duì)黑豆分離蛋白結(jié)構(gòu)、流變特性及乳化性能的影響

    2020-12-12 13:26:42鐘明明齊寶坤江連洲
    食品科學(xué) 2020年22期
    關(guān)鍵詞:等電點(diǎn)溶解性水性

    曾 琪,胡 淼,王 歡,鐘明明,齊寶坤,江連洲

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

    黑豆是豆科植物大豆的干燥成熟種子[1],亦稱為馬豆、冬豆子、黑大豆,與普通大豆相比,黑豆蛋白的含量更高,常常被人們稱為“植物蛋白之王”、“豆中之王”。作為一種植物蛋白資源,黑豆分離蛋白(black bean protein isolate,BBPI)來(lái)源廣泛,氨基酸構(gòu)成比例合適,較大豆蛋白更為優(yōu)越,是優(yōu)質(zhì)蛋白資源之一。

    隨著社會(huì)的發(fā)展,人們對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)和安全越發(fā)重視,對(duì)蛋白質(zhì)的需求量日益增加。蛋白質(zhì)的乳化性和流變性是食品加工制造過(guò)程中需要考慮的重要性質(zhì)[2],許多研究發(fā)現(xiàn),pH值處理可以使氨基酸帶電,通過(guò)蛋白質(zhì)與水分子間的離子-偶極相互作用進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的溶解性,帶同種電荷的蛋白質(zhì)之間相互排斥導(dǎo)致亞基的解離和結(jié)構(gòu)的展開(kāi)[3],蛋白質(zhì)的溶解性和表面疏水性顯著影響著蛋白質(zhì)其他功能性質(zhì)的發(fā)揮[4]。目前,關(guān)于黑豆的研究主要集中在抗氧化機(jī)理及品種之間的營(yíng)養(yǎng)成分、功能性質(zhì)差異[5]及產(chǎn)品的研發(fā)[6],有關(guān)黑豆蛋白的研究集中于熱處理及超聲處理對(duì)黑豆蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響[7-8]。較多學(xué)者研究pH值處理改變蛋白質(zhì)性質(zhì),主要集中在極端酸堿處理對(duì)大豆蛋白、7S、11S的疏水性、溶解性等理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響[9]或極端pH結(jié)合熱處理對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響[10],關(guān)于pH值處理對(duì)BBPI的表面性質(zhì)、流變性質(zhì)及其穩(wěn)定乳液的相互關(guān)系的研究較少,植物蛋白的相互關(guān)系的研究可用于乳劑制備、長(zhǎng)期穩(wěn)定性預(yù)測(cè)和食品質(zhì)量控制。

    本研究采用不同pH值條件處理BBPI后調(diào)節(jié)回中性條件,研究pH值對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)、流變性、乳化性的影響以及與穩(wěn)定乳液的相互關(guān)系,使黑豆的資源能夠得到更好的發(fā)掘。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    黑豆 北大荒綠野食品有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzenesulfonicacid,TNBS)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)北京索萊寶科技有限公司;二喹啉甲酸法蛋白含量測(cè)定試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司;8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS) 美國(guó)Sigma公司。

    磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津博迪化工股份有限公司;正己烷 天津北科化學(xué)品有限責(zé)任公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    CR22G高速冷凍離心機(jī)、F-4500型熒光分光光度計(jì)日本日立公司;PHS-3D pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;XW-80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠;VIC-212電子天平 美國(guó)艾科勒公司;Discovery系列HR-1型流變儀 美國(guó)TA公司;傅里葉紅外光譜儀美國(guó)Nicoler公司。

    1.3 方法

    1.3.1 制備BBPI

    黑豆去皮、烘干、磨粉、過(guò)60 目篩,1∶3(g/mL)料液比加入正己烷脫脂,25 ℃攪拌1 h后4 500 r/min離心20 min,重復(fù)3 次,沉淀物室溫放置24 h干燥得到脫脂豆粉;參照蔣將等[3]的方法并加以改進(jìn),干燥后的脫脂豆粕按1∶10(g/mL)的料液比加入去離子水混合,常溫?cái)嚢?0 min,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0,攪拌1 h后,4 ℃、9 000 r/min離心20 min取上清液,上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0,攪拌1 h后,4 ℃,9 000 r/min離心20 min取沉淀物,沉淀物水洗2 次,取沉淀分散于水中,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0,冷凍干燥后備用。

    1.3.2 pH值處理BBPI

    取10 份等量的冷凍干燥后的BBPI粉末溶解于去離子水(1∶5 g/mL)中,25 ℃攪拌1 h,分別用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,或用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,25 ℃攪拌2 h,隨即用2 mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH 7.0,保持中性條件誘導(dǎo)重折疊1 h,冷凍干燥后置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3 溶解度

    參考Morr等[11]的方法研究BBPI的溶解度隨pH值的變化。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的蛋白溶液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中,4 ℃、9 100 r/min離心10 min,去除不溶性殘?jiān)?。上清液梯度稀釋,采用二喹啉甲酸法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量,溶解度表示為上清液中蛋白質(zhì)含量與樣品中總蛋白質(zhì)含量的百分比。

    1.3.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性

    取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白溶液15 mL與5 mL葵花籽油混勻,以12 000 r/min高速勻化2 min,形成均一的乳液,第0分鐘時(shí)從底部吸取50 μL加入5 mL 0.1%的SDS溶液,用旋渦混合器混勻,靜置30 min后從乳液底部再吸取50 μL加入5 mL 0.1%的SDS溶液,用旋渦混合器混勻,500 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。乳化性和乳化穩(wěn)定性分別按式(1)和(2)計(jì)算。

    式中:T為2.303;N為稀釋倍數(shù);C為形成乳化液之前的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/(g/mL);θ為乳化液的油相體積分?jǐn)?shù)/%;A0為乳化液均質(zhì)后第0分鐘時(shí)測(cè)得的吸光度;A30為乳化液均質(zhì)后靜置30 min后測(cè)得的吸光度;t30-t0為2 次測(cè)定的時(shí)間差。

    1.3.5 傅里葉紅外光譜測(cè)定

    參照朱明華等[12]的方法,分別取不同pH值處理后凍干的蛋白粉末1 mg,以1∶100的比例加入溴化鉀,研磨均勻,壓片,純溴化鉀為參照,掃描波段400~4 000 cm-1,分辨率4 cm-1,掃描次數(shù)32;傅里葉紅外光譜測(cè)定的酰胺I帶可以計(jì)算BBPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量,使用peakfit軟件擬合出在酰胺-I 區(qū)域(1 7 0 0 ~1 6 0 0 c m-1)的峰位,酰胺-I區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)最為敏感[13],根據(jù)峰的中心位置將其分配到相應(yīng)的結(jié)構(gòu)中,1 600~1 639 cm-1譜帶歸屬于β-折疊;1 640~1 650 cm-1譜帶歸屬于無(wú)規(guī)卷曲;1 651~1 660 cm-1譜帶歸屬于α-螺旋;1 661~1 700 cm-1譜帶歸屬于β-轉(zhuǎn)角[14]。

    1.3.6 表面疏水性

    參照Kato等[15]的方法稱取一定量蛋白樣品溶于去離子水,稀釋至蛋白質(zhì)濃度為0.005~0.500 mol/mL,取4 mL不同濃度蛋白樣品加入20 μL 8.0 mmol/L ANS,混勻器混勻,避光靜置15 min測(cè)熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長(zhǎng)390 nm,發(fā)射波長(zhǎng)470 nm,狹縫寬度5 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度作圖,斜率即為該蛋白樣品的表面疏水性。

    1.3.7 內(nèi)源熒光光譜分析

    取不同pH值處理后的BBPI樣品溶于去離子水中,蛋白質(zhì)的最終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL,采用F-4500型熒光分光光度計(jì)測(cè)定BBPI的內(nèi)源性熒光光譜,激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm,發(fā)射光的掃描范圍為280~350 nm,狹縫為5 nm,每個(gè)樣品溶液掃描3 次。

    1.3.8 流變學(xué)特性的測(cè)定

    1.3.8.1 表觀黏度的測(cè)定

    不同pH值處理后的BBPI樣品的表觀黏度利用馬爾文流變儀進(jìn)行測(cè)定,將各個(gè)樣品分別溶解于去離子水中制成質(zhì)量濃度為200 mg/mL的蛋白溶液,60 mm、0.5°的錐板,實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行,測(cè)定樣品在0.1~100 s-1頻率范圍內(nèi)的表觀黏度。

    1.3.8.2 彈性模量(G’)和黏性模量(G’’)的測(cè)定

    用流變儀測(cè)定蛋白質(zhì)的振蕩界面膨脹流變特性隨pH值的變化。將蛋白溶液(200 mg/mL)緩慢注入充滿夾具(60 mm,0.5°的錐板)中,室溫保溫5 min,測(cè)試參數(shù):振幅值0.3%,剪切頻率0.1~10 Hz,溫度25 ℃,分析樣品分散液的G’、G’’及損耗角正切值(tanδ)隨角頻率的變化。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    利用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性及相關(guān)性分析,采用Origin 8.0軟件作圖。紅外圖譜數(shù)據(jù)處理采用Peakfit 4.21軟件進(jìn)行擬合分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 溶解性與表面疏水性

    圖1 p值對(duì)BBPI的溶解性與表面疏水性的影響Fig. 1 Effect of pH on solubility and surface hydrophobicity of BBPI

    由圖1可知,BBPI的等電點(diǎn)在pH 4.0~5.0之間,表面疏水性在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的兩側(cè)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)且在等電點(diǎn)附近出現(xiàn)最大值,溶解性在pH 5.0時(shí)最低,遠(yuǎn)離pH 5.0的兩側(cè)時(shí)隨酸堿度的增加而增加,這表明在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)溶解性與表面疏水性呈負(fù)相關(guān),本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與Kato等[15]的研究一致,即溶解性高的蛋白質(zhì)分子表面存在的疏水性殘基較少。

    pH值處理通過(guò)改變蛋白質(zhì)的電離情況進(jìn)而改變BBPI的溶解度;蛋白質(zhì)的疏水性殘基大部分位于蛋白質(zhì)內(nèi)部,pH值處理后BBPI發(fā)生不同程度的變性,蛋白質(zhì)之間的相互作用改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面疏水性發(fā)生改變,隨酸堿度增加,疏水基團(tuán)暴露增多,當(dāng)疏水基團(tuán)增加到一定程度時(shí),蛋白質(zhì)分子間會(huì)通過(guò)疏水鍵相互聚集[9],發(fā)生疏水坍塌,從而引起表面疏水性下降。等電點(diǎn)附近表面疏水性出現(xiàn)最高值(pH 3.0)可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)亞基解離后經(jīng)過(guò)重折疊呈現(xiàn)舒展的狀態(tài),位于α-螺旋內(nèi)部的疏水氨基酸殘基暴露,導(dǎo)致疏水性增高。

    2.2 pH值處理對(duì)BBPI熒光強(qiáng)度的分析

    圖2 不同p值處理下BBPI的熒光光譜Fig. 2 Fluorescence spectra of black bean protein isolate under pH treatments

    由圖2可以看出,相比于未經(jīng)pH值處理的BBPI,pH值處理后,BBPI的熒光強(qiáng)度均有所下降且最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生不同程度的紅移,說(shuō)明pH值處理改變了蛋白質(zhì)色氨酸殘基的微環(huán)境,BBPI色氨酸殘基暴露;由表1可知,BBPI的最大吸收波長(zhǎng)(λmax)分布在325~340 nm之間;pH值處理?xiàng)l件下,隨酸處理程度加深,熒光強(qiáng)度從202.6增長(zhǎng)到265.4,最大吸收波長(zhǎng)從330 nm紅移到332 nm;隨堿處理程度加深,熒光強(qiáng)度從324.6增長(zhǎng)到408.2,蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)從330 nm紅移到333 nm,由此可見(jiàn),經(jīng)pH值處理后的蛋白質(zhì)的色氨酸殘基所處的微環(huán)境極性有所提高且堿處理對(duì)BBPI影響較大。

    表1 不同p值處理下BBPI的熒光強(qiáng)度和最大吸收波長(zhǎng)Table 1 Fluoresceine intensity and maximum absorption wavelength of black bean protein isolate under p treatments

    表1 不同p值處理下BBPI的熒光強(qiáng)度和最大吸收波長(zhǎng)Table 1 Fluoresceine intensity and maximum absorption wavelength of black bean protein isolate under p treatments

    pH 未處理 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 λmax/nm 328 332 332 331 330 330 330 330 330 332 333熒光強(qiáng)度 464.9 265.4 232.9 214.9 202.6 302.7 314.6 324.6 337.2 346.2 408.2

    λmax與色氨酸殘基所處的環(huán)境有關(guān),λmax<330 nm表示色氨酸殘基位于非極性環(huán)境,相反λmax>330 nm則表示色氨酸殘基位于極性環(huán)境,由表1可知,未經(jīng)pH值處理的BBPI的最大吸收波長(zhǎng)為328 nm,表明蛋白質(zhì)色氨酸殘基仍位于蛋白質(zhì)內(nèi)部非極性環(huán)境中,而熒光強(qiáng)度為464.9 nm,明顯大于pH值處理后的樣品熒光強(qiáng)度,可能是因?yàn)锽BPI自身外部的疏水基團(tuán)較多,所以BBPI的溶解性較差;經(jīng)pH值處理后蛋白質(zhì)的色氨酸殘基不同程度的暴露在外部的極性環(huán)境中[16]且BBPI的熒光強(qiáng)度隨著pH值處理程度加深而增加,反映了這種結(jié)構(gòu)變化屬于一種動(dòng)態(tài)過(guò)程,pH值處理后的蛋白樣品熒光強(qiáng)度低于未處理組,可能是因?yàn)锽BPI在pH值處理后再調(diào)整回pH 7的過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生一種處于變性與未變現(xiàn)之間的“熔球態(tài)”的蛋白,這種情況下的蛋白質(zhì)部分折疊,雖然不能恢復(fù)到之前的狀態(tài),但蛋白質(zhì)分子的再聚集會(huì)導(dǎo)致更多色氨酸殘基被包裹于更加疏水的分子內(nèi)部,從而引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度的下降[17];也可能是因?yàn)樗釅A環(huán)境下蛋白質(zhì)分子展開(kāi),使內(nèi)部色氨酸殘基暴露,蛋白質(zhì)分子間相互作用使色氨酸微環(huán)境變化,導(dǎo)致內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降[18]。

    2.3 pH值處理對(duì)BBPI傅里葉紅外光譜分析

    表2 酰胺I帶擬合p值處理下BBPI二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Contents of secondary structures of black bean protein isolate under p treatments measured by curve-fitting of amide ? band

    表2 酰胺I帶擬合p值處理下BBPI二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Contents of secondary structures of black bean protein isolate under p treatments measured by curve-fitting of amide ? band

    注:同列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

    %pH α-螺旋 β-折疊 β-轉(zhuǎn)角 無(wú)規(guī)卷曲未處理 18.44±0.55a 42.58±0.53ab 22.15±0.05de 16.82±0.05d 2 16.18±0.57de 40.18±0.51cd 25.16±0.58ab 18.49±1.03bc 3 15.78±0.56ef 43.79±0.60a 21.26±0.54e 19.16±0.19b 4 15.09±0.05f 42.64±0.52ab 23.24±0.54cd 19.02±0.02bc 5 14.93±0.02f 42.15±1.02b 22.04±1.05de 20.87±0.02a 6 15.52±0.48ef 42.82±0.05ab 22.72±0.50cde 18.92±0.03bc 7 16.31±0.57de 41.71±1.49b 23.13±1.01cd 18.84±0.03bc 8 16.85±0.83cd 41.36±1.32bc 23.27±1.11cd 18.52±0.59bc 9 17.43±0.59bc 39.97±0.72cde 24.31±1.40bc 18.29±0.20c 10 17.92±0.59ab 39.77±0.05de 24.88±1.00ab 17.43±0.60d 11 18.17±0.56ab 38.71±0.57e 26.07±0.80a 17.05±0.48d

    由表2可知,BBPI含有4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)組分:α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲,其中α-螺旋和β-折疊為BBPI的有序結(jié)構(gòu),β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲為無(wú)序結(jié)構(gòu);與未處理BBPI樣品對(duì)比,pH值處理?xiàng)l件下BBPI的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少,無(wú)規(guī)卷曲含量增加,可能是因?yàn)閜H值處理使得BBPI發(fā)生部分變性,變性過(guò)程與α-螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)量的減少和無(wú)序結(jié)構(gòu)的數(shù)量增加有關(guān)[19];在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值處理下,α-螺旋含量顯著增加,β-折疊含量顯著下降,且隨著酸堿度的增加,這些變化更加明顯;靠近等電點(diǎn)時(shí),α-螺旋含量減小、β-折疊含量增多,可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)表面電荷量少,靜電斥力減小、疏水相互作用增大、分子間氫鍵增大導(dǎo)致的[20],無(wú)規(guī)卷曲含量的增加可能是受蛋白質(zhì)聚集的影響。β-折疊比例增加的同時(shí)α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例減小,可能是因?yàn)閜H值的變化影響了α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)之間的平衡,使其發(fā)生了結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[21]。通過(guò)與表面疏水性變化規(guī)律相關(guān)性分析表明,表面疏水性與β-轉(zhuǎn)角含量負(fù)相關(guān)(r=-0.423,P<0.05),表面疏水性與β-折疊含量正相關(guān)(r=0.502,P<0.05),說(shuō)明蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化影響了其功能性質(zhì)的表達(dá),王中江等[22]采用圓二色譜研究pH值對(duì)大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,得到的結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

    2.4 pH值處理對(duì)BBPI乳化性的分析

    如圖3所示,在pH值處理下,BBPI的乳化性及乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),等電點(diǎn)附近乳化性及乳化穩(wěn)定性最低,可能是因?yàn)榈入婞c(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)表面電荷量少,缺乏靜電排斥的相互作用會(huì)使得乳液中蛋白質(zhì)絮凝、聚集導(dǎo)致乳化性降低,偏離等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)表面靜電荷含量增加,增加了蛋白質(zhì)的溶解性進(jìn)而提高蛋白質(zhì)的乳化活性及乳化穩(wěn)定性,隨酸堿度增加,蛋白質(zhì)逐漸變性,變性蛋白所含氨基酸殘基的疏水基團(tuán)指向油相,而親水性基團(tuán)指向水,越偏離等電點(diǎn)乳化活性越好,可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)發(fā)生了改性,增強(qiáng)了與油相之間的作用,乳化活性更好[23]。

    圖3 p值對(duì)BBPI乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig. 3 Effect of pH on EAI and ESI of BBPI

    pH值處理可能會(huì)使得BBPI部分形成“熔融態(tài)”的蛋白質(zhì)[24],這部分蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,但三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)有所變化,結(jié)構(gòu)展開(kāi)會(huì)導(dǎo)致蛋白內(nèi)部疏水氨基酸暴露,表面疏水性增強(qiáng),蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變顯著提高了蛋白質(zhì)的乳化性能[24],結(jié)構(gòu)展開(kāi)使得蛋白質(zhì)具有相對(duì)柔軟的構(gòu)象,多肽鏈松散,乳化性能提高[25]。

    2.5 pH值處理對(duì)BBPI流變學(xué)特性的分析

    2.5.1 表觀黏度

    圖4 p值對(duì)BBPI表觀黏度的影響Fig. 4 Effect of pH on apparent viscosity of BBPI

    由圖4可知,在同一剪切速率下,不同pH條件處理后BBPI溶液的表觀黏度不同,pH值處理后的蛋白質(zhì)溶液的表觀黏度大于未處理組,說(shuō)明處理后的蛋白體系趨于穩(wěn)定[26];不同pH條件處理的蛋白溶液樣品間表觀黏度值和變化趨勢(shì)差異較大,等電點(diǎn)時(shí)的表觀黏度最低,所有樣品的表觀黏度隨剪切速率的增加均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),即表現(xiàn)出剪切稀釋的現(xiàn)象,符合非牛頓流體特性,這與Karaman等[27]報(bào)道的乳液剪切稀化一致。

    表觀黏度的變化規(guī)律與乳化活性及乳化穩(wěn)定性大體一致,即遠(yuǎn)離等電點(diǎn)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在pH 3時(shí)表觀黏度大于pH 2條件下的蛋白溶液,可能是因?yàn)樵摋l件處理BBPI導(dǎo)致疏水基團(tuán)暴露較多,蛋白間形成了三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),降低了流動(dòng)性,即蛋白質(zhì)分子之間的連接更加緊密,表觀黏度增大[28-29]。表觀黏度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)且在等電點(diǎn)時(shí)最小,這與孫少敏等[30]報(bào)道的小麥醇溶蛋白溶液的研究一致,這是因?yàn)榕R近等電點(diǎn),水合度小,溶液流動(dòng)時(shí)受到的阻力小,故在pH 4、5時(shí)黏度較小;遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)溶解性高,水化程度比較高,能固定更多的水分子,體積變大,根據(jù)托克斯定律[31],蛋白溶液體積越大,溶液在流動(dòng)的過(guò)程中受到的內(nèi)部阻力越大,阻礙了介質(zhì)的自由移動(dòng)從而表現(xiàn)出較高的表觀黏度,所以表觀黏度呈上升趨勢(shì)[32];尤其當(dāng)pH值過(guò)于偏酸偏堿時(shí),蛋白質(zhì)發(fā)生部分變性,削弱了表面水合層蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚集形成較大的聚合物,很大程度上提高了蛋白質(zhì)溶液的黏度[33]。也可能是因?yàn)檫h(yuǎn)離等電點(diǎn),蛋白質(zhì)表面帶同種電荷量增加,靜電斥力增加導(dǎo)致黏度增加[33]。

    2.5.2 BBPI黏彈性

    圖5 p值對(duì)BBPI的G’、G’’的影響Fig. 5 Effect of pH on G’ and G’’ of BBPI

    由于蛋白質(zhì)發(fā)生凝膠的能力與聚集狀態(tài)有很大的關(guān)系,所以蛋白質(zhì)在不同的pH值處理?xiàng)l件發(fā)生的不同聚集模式可能對(duì)蛋白質(zhì)的凝膠能力有很大的影響,小幅振蕩變形流變測(cè)試已經(jīng)被廣泛用于研究蛋白凝膠過(guò)程中的黏彈性和分子間相互作用。由圖5可以看出,儲(chǔ)能模量對(duì)掃描頻率具有一定的依賴性,pH值處理后的樣品G’值高于未處理組,說(shuō)明pH值處理BBPI可以在一定程度上促進(jìn)形成均一、致密、高強(qiáng)度的蛋白質(zhì)凝膠狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[34],pH值處理后的樣品的G’增大,原因可能是pH值處理后蛋白質(zhì)中的亞基發(fā)生變性,巰基氧化形成二硫鍵,新的二硫鍵進(jìn)一步加強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子間的共價(jià)作用,加固了蛋白的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),G’增強(qiáng)[35];pH 4.0、5.0時(shí)G’、G’’增長(zhǎng)緩慢可能是因?yàn)榕R近等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)水合能力差,蛋白質(zhì)重排變得困難,降低了G’增長(zhǎng)的速度,蛋白質(zhì)發(fā)生聚集生成沉淀不能產(chǎn)生凝膠,黏彈性較差。pH 11.0樣品的G’和G’’低,可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性結(jié)構(gòu)展開(kāi),有序結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變導(dǎo)致流動(dòng)性增加,這有可能破壞已經(jīng)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),所以G’下降[35];也可能是極端pH值條件下破壞了疏水相互作用力和范德華力,使蛋白亞基之間的二硫鍵發(fā)生斷裂,蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)部分展開(kāi),從而改變了蛋白質(zhì)緊密的三維結(jié)構(gòu),黏彈性減弱。不同pH值處理后樣品的G’增幅差異較大,說(shuō)明pH值對(duì)蛋白形成凝膠網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)有很大的影響。

    圖6 p值對(duì)BBPI的tanδ的影響Fig. 6 Effect of pH on tanδ of BBPI

    tanδ值可以作為衡量蛋白質(zhì)在凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。由圖6可知,未處理組、pH 2.0、4.0、5.0、11.0的BBPI溶液tanδ>1且呈上升趨勢(shì),說(shuō)明蛋白溶液體系的聚合度變小,形成的凝膠狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定,可能在高剪切頻率下,破壞了已經(jīng)形成的三維結(jié)構(gòu)。pH值處于等電點(diǎn)時(shí)tanδ值大,說(shuō)明蛋白質(zhì)的G’’性強(qiáng),流動(dòng)性大,不利于形成凝膠狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[36]。pH 3.0時(shí)tanδ<1且隨頻率增加有所上升,表明pH 3的條件顯著提高BBPI的黏彈性[37]。pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的蛋白溶液的tanδ<1且從低剪切頻率到高剪切頻率幾乎不變,表明在這個(gè)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)黏性越低,彈性越高,tanδ值越低表明形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更好[38],說(shuō)明在6<pH<10范圍內(nèi)pH值處理使得蛋白在溶液中的彈性更強(qiáng),結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,可能是疏水相互作用在穩(wěn)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)聚集物方面發(fā)揮重要作用。對(duì)比表面疏水性數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),表面疏水性強(qiáng)的BBPI樣品溶液形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更好。

    3 結(jié) 論

    pH值處理對(duì)BBPI的理化性質(zhì)及流變性質(zhì)產(chǎn)生了一定的影響,遠(yuǎn)離等電點(diǎn)隨pH值升高,蛋白質(zhì)間的疏水作用降低,減少了靜電粒子的相互作用,溶解性得到改善,具有高溶解性蛋白質(zhì)的表面疏水性較低;三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi),亞基解離,巰基氧化成二硫鍵可以進(jìn)一步加強(qiáng)蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),疏水氨基酸暴露影響蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu),表面活性增強(qiáng),溶解性和乳化性隨之增強(qiáng),蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了由β-折疊向α-螺旋的轉(zhuǎn)變,表面疏水性與β-折疊含量正相關(guān)(r=0.502,P<0.05),溶解度與乳化性變化趨勢(shì)一致,與表面疏水性變化趨勢(shì)相反。

    隨pH值處理?xiàng)l件變化,表觀黏度先減少后增大,pH值處理后BBPI乳液的黏彈性均高于未處理組,表面疏水性對(duì)形成凝膠狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要作用;研究發(fā)現(xiàn)制備乳液時(shí)具有高溶解性和低疏水性(pH 11.0)的蛋白質(zhì)能更好的與油水界面結(jié)合,乳化活性與穩(wěn)定性最好;具有高溶解性和高疏水性(pH 3.0)的蛋白質(zhì)能形成強(qiáng)黏彈性界面膜,且表面疏水性越高,形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更好。

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