淫羊藿苷與補腎固齒丸對大鼠慢性牙周炎牙槽骨重建的比較研究

廖丹， 葛頌

遵義醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義（563000）

牙周病是中老年人牙齒喪失的最主要原因［1］。目前臨床上牙周病以牙周基礎治療及牙周手術治療為主，重度、急性、伴有系統病等患者需選擇增加藥物輔助治療。中成藥補腎固齒丸能達到扶正祛邪、固齒強身的目的，固齒丸治療牙周炎，特別是青少年牙周炎有較好的臨床療效，可減緩牙槽骨的吸收、延遲復發(fā)［2］。隨著對中藥逐步深入研究，治療骨質疏松藥物淫羊藿苷（icariin，ICA）［3］引起了廣泛的關注。研究表明ICA 有促進成骨、提高新骨量，促進骨成熟，促進成骨細胞增殖、牙周膜干細胞增殖及骨向分化的作用，并且從作用機制層面探討了ICA 對成骨細胞的促進作用［4?10］及對破骨細胞的抑制作用［4］。動物實驗表明ICA 作為生物活性因子結合生物支架在促進成骨及骨成熟方面有顯著效果［11］，聯合抗炎藥物可治療種植體周圍炎細菌誘導的骨丟失［5］。但是在體內慢性牙周炎癥情況下，ICA 作為獨立影響因素是否仍具有促進成骨作用以及對成骨、破骨細胞的影響尚不明確。為探究臨床慢性牙周炎患者口服ICA 的治療效果及可能機制，本研究使用不同濃度的ICA 和補腎固齒丸給慢性牙周炎模型SD 大鼠連續(xù)灌胃1、2 個月，以補腎固齒丸為參照，檢測血清骨轉換標志物骨鈣素（osteocalcin，OCN）水平，觀察機體骨代謝情況；顯微CT（micro computed tomogra?phy，Micro?CT）掃描實驗牙后三維重建，觀察牙周骨立體結構、微結構改變，測量分析牙槽骨高度吸收值；應用HE 染色和甲苯胺藍染色從組織學角度觀察治療前后牙周組織變化，多角度評價ICA 改善慢性牙周炎牙周組織的效果，為中藥治療牙周病在臨床獲得更好的牙周組織修復再生提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑、器械與設備

60 只健康普通級雄性SD 大鼠，體質量170～190 g，購于第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，實驗動物質量合格證SCXK（渝）2102?0005。

ICA 由江蘇南通飛宇生物科技有限公司提供（批號：FY17420110），補腎固齒丸藥粉由成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司提供（批號：Z?51021248）。

牙周探針、齦下潔治器械、手術剪、持針器、一次性使用口腔器械盒、骨鉗、12 號灌胃針、50 mL 燒杯、Micro?CT（Scanco Medical，瑞士）、硬組織切磨系統（EXAKT Verteriebs，德國）。

1.2 建模方法

60 只大鼠隨機分成2 組：正常組9 只，牙周炎模型組51 只，正常組不做任何處理，牙周炎模型組予10%水合氯醛按0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉，取仰臥位，固定于鼠板，消毒，鋪巾，用探針銳性分離右側上頜第二磨牙牙齦，用4?0 無菌醫(yī)用絲線牙周結扎2 圈，置絲線于齦下，術后予高糖飲食2 個月。定期檢查絲線結扎情況，若有脫落應及時重新結扎。正常組予普通飲食2 個月。每2 周測量尾靜脈血血糖，數值均小于隨機血糖值16.7 mmol/L。本實驗研究所有動物實驗已通過遵義醫(yī)科大學動物實驗中心的動物實驗倫理審查。

1.3 組織學觀察建模情況

建模結束后，正常組、牙周炎模型組分別選取3 只處死，迅速分離右側上頜骨，4%多聚甲醛固定24 h，通過病理組織切片觀察實驗大鼠右側上頜第二磨牙牙周組織的變化，確定建模是否成功。

1.4 ICA 與補腎固齒丸治療大鼠實驗性牙周炎

1.4.1 實驗分組 建模成功后，牙周炎模型組剩余的48 只大鼠去除結扎絲線，齦下刮治器刮除實驗牙及兩顆鄰牙牙周軟垢及牙石，雙蒸水注射器沖洗，正常飼養(yǎng)1 周后隨機分為4 組，每組12 只。分別為慢性牙周炎組（periodontitis group，P 組）、ICA低劑量組（ICA low dose group，L 組）、ICA 高劑量組（ICA high dose group，H 組）及補腎固齒丸組（Bu?Shen?Gu?Chi?Wan group，B 組）。剩余6 只正常大鼠為正常組（normal group，N 組），采用相同方法進行牙周基礎治療?；A治療后所有大鼠正常飼養(yǎng)1周后開始給藥。給藥方案：①P 組和N 組，雙蒸水10 mL/（kg·d），ig；②L 組，20 mg/（kg·d）［12］，ig；③H組，ICA 40 mg/（kg·d），ig；④B 組，補腎固齒丸0.8 g/（kg·d）［13］，ig；。

1.4.2 血清骨轉換標志物測定 血清的收集與保存：分別于灌胃1個月、2個月，各組大鼠12 h禁食禁飲，頸總動脈放血收集血漿，4 ℃離心3 000 r/min，10 min，EP 管分裝血清，立即送至遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科通過德國Roche 公司cobas e601 全自動電化學發(fā)光免疫分析儀檢測血清OCN水平。

1.5 Micro?CT 三維影像學分析

1.5.1 設備及方法 Micro?CT：電壓70 kVp，電流200 μA，功率14 W，分辨率15.0 μm，曝光時間300 ms。VGstudio Max3.0 軟件重建/分析采集的掃描數據。各組大鼠處死后，分離出右側上頜牙槽骨，置于4%多聚甲醛中保存?zhèn)溆?。固? 周后送至四川大學華西口腔醫(yī)學院口腔疾病研究國家重點實驗室掃描Micro?CT，獲取圖像，每個樣本掃描80～90 min。圖像采集完成后，選取右側上頜第二磨牙根分叉區(qū)作為興趣區(qū)（the region of interest，ROI），軟件分析，三維重建，獲取數據。

同時測量右側上頜第二磨牙牙冠6 個位點的釉質牙骨質界到牙槽嵴頂的距離（cement?to?enam?el junction? alveolar bone crest，CEJ?ABC）。VGstu?dio Max3.0 軟件分析斷層圖像，將實驗牙牙體長軸與Y 軸平行，面近遠中向長軸與X 軸平行，面與Z 軸平行。測量實驗牙6 個位點分別為：近頰尖（mesio?buccal cusp，MBC）/近 腭 尖（mesio?palatal cusp，MPC）、頰溝（buccal groove，BG）/腭溝（palatal groove，PG）、遠頰尖（disto?buccal cusp，DBC）/遠腭尖（disto?palatal cusp，DPC）。測量某位點的CEJ?ABC 時，使Y 軸通過該位點，并在該面測量該處的CEJ?ABC。計算6 個位點的總值作為上頜第二磨牙的牙槽骨吸收值，進行統計學分析。由于本實驗部分實驗牙頰面頸部釉質缺損較大，CEJ?ABC 測量誤差較大，因此計算實驗牙腭側3 個位點的總值作為上頜第二磨牙的牙槽骨吸收值。

1.5.2 檢測指標 ①骨體積分數（bone volume/tis?sue volume，BV/TV）：骨性結構的體積與樣本總體積的比值，即礦化組織的比值（%），該數值越大，表明骨小梁含量越多。②骨小梁數目（trabecular number，Tb.N）：用于描述骨量變化（mm?1），在骨小梁厚度一定的前提下，數量越多，骨量越多。③骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）：指骨小梁之間的平均距離（mm），用于描述骨小梁結構形態(tài)，骨小梁之間的距離越大，分離度越大。④骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）：指骨小梁的平均厚度（mm），當發(fā)生骨質疏松時，Tb.Th 數值變小。⑤牙槽骨吸收值（alveolar bone absorption）：以CEJ?ABC 作為牙槽骨吸收的參考標準，吸收值越大，說明牙槽骨喪失越明顯。

1.6 組織學觀察

將每組大鼠牙槽骨標本掃描micro?CT 后行對半切開，一部分行常規(guī)脫鈣后進行HE 染色，另一部分僅酒精梯度脫水后制作硬組織切片，行甲苯胺藍染色，鏡下觀察實驗牙牙周組織情況。

1.7 統計學分析

使用SPSS18.0 軟件，所有定量資料數據用x±s表示，多組間均數比較，采用單因素方差分析，兩組間均數比較，采用LSD 法檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 大鼠牙周炎模型的建立

病理組織學觀察顯示（圖1），相較于正常組，牙周炎模型組SD 大鼠上頜第二磨牙牙齦增生，結合上皮向根方增殖、延伸，附著喪失嚴重，大量炎性細胞浸潤，牙槽嵴頂高度降低，牙槽骨吸收明顯。而正常組結合上皮位于釉牙骨質界處，無明顯炎性細胞浸潤，牙槽嵴頂未見吸收。

2.2 給藥后各組血清骨轉換指標的測定

如表1 所示，與N 組相比，P 組的血清OCN 水平明顯升高；與P 組相比，L 組、H 組和B 組OCN 水平明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），提示ICA 有減緩實驗性大鼠慢性牙周炎牙槽骨吸收的可能性。灌胃2 個月與1 個月相比，H 組、B 組血清OCN 水平降低，提示隨著用藥時間延長，一定濃度的ICA 可能減緩實驗性牙槽骨吸收的作用越明顯。

Figure 1 Pathological observation of normal group and periodontitis model group after modeling圖1 建模結束后正常組與牙周炎模型組病理學觀察

表1 給藥1、2 個月各組血清OCN 濃度Table 1 Serum OCN concentrations in each group 1 month and 2 months after administration ng/mL，x±s

2.3 Micro?CT 掃描結果

2.3.1 三維重建結果 給藥1 個月和2 個月，各治療組（B、H、L 組）牙槽嵴頂高度均大于P 組（圖2）。2.3.2 ROI 骨參數定量分析 給藥1 個月時，相較于N 組，P 組BV/TV、Tb.Th、Tb.N 值明顯減小，Tb.Sp明顯增大，差異有統計學意義（P＜0.05）；與P 組相比，H 組、L 組及B 組BV/TV、Tb.N 值明顯增大，H組、B 組Tb.Th 值明顯增大、Tb.Sp 值明顯減小，差異有統計學意義（P＜0.05）；而L 組Tb.Th 值稍增大、Tb.Sp 值稍減小，差異無統計學意義（圖3）。

給藥2 個月，相較于N 組，P 組各參數值變化趨勢與1 個月一致，差異均有統計學意義（P＜0.05）；H 組、L 組及B 組BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp值變化趨勢與給藥1 個月相似，并且BV/TV、Tb.N、Tb.Sp 值變化與P 組相應指標差異有統計學意義（P＜0.05）。除L 組外，H 組、B 組Tb.Th 與P 組差異有統計學意義（P＜0.05）。

各治療組Tb.N、Tb.Sp 給藥2 個月與給藥1 個月的差異（圖3）具有統計學意義（P＜0.05）。

骨參數定量分析結果顯示，H 組、L 組及B 組具有不同程度的牙槽骨修復甚至再生，H 組新生牙槽骨較L 組有所增加，H 組與B 組新生骨量無明顯差異，而給藥2 個月較1 個月成骨效果更佳。

2.3.3 各組牙槽骨吸收值比較分析 P 組大鼠牙槽骨吸收值較N 組升高，差異有統計學意義；L 組及H 組較P 組牙槽骨吸收值降低，差異有統計學意義（P＜0.05），B 組牙槽骨吸收值在給藥1 個月時稍降低，差異無統計學意義，在灌胃2 個月時明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

2.4 HE 染色

給藥1 個月（圖4），相較于N 組，P 組牙齦上皮增生明顯，固有層內見明顯炎癥細胞浸潤，但較建模時有所減少，結合上皮向根方增殖移位，牙周袋形成；牙槽骨表明見凹坑狀吸收陷窩和破骨細胞，牙周膜纖維變性，可見纖維斷裂。B 組、H 組、L 組均表現牙齦上皮少量增生，固有層少量中性粒細胞浸潤；有類骨質形成，骨化中心可見成骨細胞成排排列；成纖維細胞活躍。

給藥2 個月（圖5），P 組表現出牙齦增生明顯，固有層內見明顯炎癥細胞浸潤，但較給藥1 個月時有所減少，結合上皮附著向根方移位；牙槽骨表面見凹坑狀吸收陷窩及逐漸凋亡的破骨細胞。B 組較牙周炎組表現牙齦上皮未見明顯增生，固有層少量中性粒細胞浸潤；有類骨質形成，可見骨化中心成骨細胞成排排列；可見新生牙周膜纖維束埋入新形成的牙槽骨中；大量活躍的成纖維細胞。H組、L 組牙齦上皮增生不明顯，固有層內少量中性粒細胞浸潤；有類牙骨質形成，可見骨化中心成骨細胞成排排列；大量活躍的成纖維細胞。

Figure 2 Three?dimensional reconstruction of Micro?CT in each group 1 and 2 months after treatment圖2 給藥1、2 個月后各組Micro?CT 三維重建圖像

Figure 3 Quantitative analysis of micro?CT measurement parameters in each group 1 month and 2 months after administration圖3 給藥1、2 個月各組micro?CT 測量參數定量分析

2.5 硬組織切片甲苯胺藍染色

甲苯胺藍染色（toluidine blue staining，TB）結果顯示，灌胃1 個月，P 組多為原有的淡紫色牙槽骨，幾乎看不到類骨質及新生牙槽骨，H、L 組及B 組均觀察到類骨質形成。與1 個月相比，灌胃2 個月時，H、L、B 組的新生牙槽骨更多，能看到與原礦化骨之間有明顯的分界線，在新生骨邊緣有淺藍色的類骨質，牙周炎組仍未見明顯新牙槽骨形成（圖6、圖7）。

3 討 論

如何改善破壞的牙周組織，促進牙槽骨修復再生是牙周病治療中的關鍵環(huán)節(jié)之一。近年來隨著牙周組織工程的發(fā)展，牙周組織再生有了新的希望［14］。大量研究表明，生物活性因子ICA 在牙體牙髓牙周病學、口腔種植、口腔正畸等多個口腔醫(yī)學領域有一定的作用，如口服給予ICA 對大鼠正畸牙齒移動（orthodontic tooth movement，OTM）有積極的影響［12］。Wu 等［15］使用磷酸鈣骨水泥支架構建ICA 遞送系統，并裝載BMSCs，作用于去卵巢大鼠的顱骨缺損，同時25 mg/（kg·d）ICA 灌胃，局部用藥聯合全身系統性給藥達到最佳的骨修復效果。楊衛(wèi)等［16］使用25 mg/kg ICA 口服給藥觀察ICA 對骨質疏松牙周炎小鼠牙槽骨吸收的影響，發(fā)現ICA口服給藥在有效預防骨質疏松發(fā)生的同時，可減少牙周炎引起的牙槽骨吸收，并認為此作用來自或部分來自ICA 對成骨細胞的分化和礦化作用。本實驗用不同濃度的ICA 和補腎固齒丸給慢性牙周炎模型實驗大鼠連續(xù)灌胃，通過血清骨轉換標志物檢測、Micro?CT 掃描、組織學觀察等多種方法探究其對牙槽骨吸收的作用效果，為中藥防治牙周炎提供一定的實驗依據。

表2 Micro?CT 測量各組牙槽骨吸收值比較Table 2 Micro?CT measurement of alveolar bone absorption in each group

Figure 4 Observation of improvement in periodontal tissue 1 month after treatment by HE staining圖4 HE 染色觀察給藥1 個月牙周組織改善情況

Figure 5 Observation of improvement in periodontal tissue after 2 months of treatment圖5 HE 染色觀察給藥2 個月牙周組織改善情況

Figure 6 Observation of improvement in periodontal tissue 1 month after treatment by toluidine blue staining圖6 甲苯胺藍染色觀察給藥1 個月牙周組織改善情況

在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中，牙槽骨不斷的進行骨轉換，包括了骨吸收與骨形成連續(xù)復雜的過程，在此過程中骨吸收與骨形成相互偶聯，OCN則是反映骨轉換的標志物，當牙槽骨吸收活躍時，牙槽骨骨轉換率升高，血清中的OCN 濃度可能升高。Yang 等［17］等觀察補腎固齒丸對大鼠實驗性牙周炎牙槽骨重建的影響，結果發(fā)現補腎固齒丸組的血清OCN 濃度顯著低于牙周炎模型組，認為給予補腎固齒丸能夠降低大鼠牙槽骨的骨轉換率，減緩牙周炎進程中的牙槽骨吸收。本實驗選用OCN 作為骨轉換敏感指標，探究在ICA 用藥情況下SD 大鼠慢性牙周炎模型牙槽骨骨代謝情況。與N 組大鼠比較，P 組大鼠血清OCN 水平明顯升高；H組、L 組及B 組較P 組血清OCN 水平明顯下降，差異有統計學意義。提示給予ICA 和補腎固齒丸能降低大鼠牙槽骨的骨轉換率，改善牙周骨代謝，減緩牙周炎進程中的牙槽骨吸收。

組織病理形態(tài)計量法為金標準，CT 測量結果與病理結果高度一致，是目前評價骨結構較常用的方法［18］。Micro?CT 可清晰掃描骨小梁立體結構，進行3D 重建，并精確計量骨參數，分析骨組織的“質”與“量”，同時進行各種數據測量。本實驗計量了ROI 的骨小梁的數目（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）以及骨小梁厚度（Tb.Th）反映根分叉區(qū)ROI牙槽骨的質，以骨體積分數（BV/TV）來反映新生牙槽骨的量，當骨質疏松時，Tb.N、Tb.Th、BV/TV 均會減小。同時測量標本腭側3 個位點CEJ?ABC 之和反應牙槽骨吸收程度，探討用藥前后牙槽骨吸收的變化。在實驗性牙周炎模型SD 大鼠灌胃1、2 個月后，對各組BV/TV、Tb.N、Tb.Sp 以及Tb.Th 進行單因素方差分析，結果顯示補腎固齒丸能促進實驗性牙周炎的牙槽骨修復與丁一等［13］的實驗結果相一致。而本研究結果表明，高劑量ICA 同樣可促進實驗性牙周炎的修復改建，促進作用與B 組相比，差異無統計學意義；L 組與B 組有顯著差異，差異有統計學意義；給藥2 個月較給藥1 個月成骨效果更佳。所有骨參數分析結果均表明ICA 在減緩牙槽骨吸收的進程中發(fā)揮積極作用。形態(tài)學分析結果顯示，P 組大鼠牙槽骨吸收值較正常組升高，差異具有統計學意義；H 組、L 組牙槽骨吸收值較P 組降低，差異具有統計學意義，B 組牙槽骨吸收值在給藥1 個月稍降低，而在給藥2 個月時明顯降低，差異有統計學意義。結果同樣顯示ICA 在一定程度上能改善牙周牙槽骨吸收和骨破壞。同時還發(fā)現，無論在骨參數方面還是骨吸收值方面，ICA 高劑量組改善牙槽骨吸收效果優(yōu)于低劑量組。

HE 染色結果顯示，在給藥1、2 個月，H、L、B 組均觀察到牙齦上皮增生不明顯，上皮及固有層內少量炎性細胞浸潤，有新生牙骨質及牙槽骨形成，成骨細胞成排排列，偶見少量破骨細胞，而P 組形成深牙周袋，大量炎性細胞浸潤，牙槽骨形成骨吸收陷凹。硬組織切片顯示H、L、B 組均觀察到淺藍色的類骨質，而P 組不明顯。

本研究以SD 大鼠為實驗對象，“絲線結扎+高糖飲食”2 個月成功建立大鼠慢性牙周炎模型，分別給予ICA、補腎固齒丸治療1、2 個月后，通過檢測大鼠血清骨代謝標志物變化，顯微CT 三維重建定量分析各組骨參數以及釉?牙骨質界?牙槽嵴頂（CEJ?ABC）的距離，制作組織切片鏡下觀察牙周組織變化。各項指標結果分析認為ICA 具有改善牙槽骨代謝狀況，促進牙槽骨改建，延緩牙周組織破壞的作用，一定程度上輔助治療牙周炎，為其應用于臨床獲得更好的牙周組織再生提供一定的實驗依據。