骨形態(tài)發(fā)生蛋白研究進(jìn)展*

趙志軍，賴文濤，馮士軍，孫智敏，張春陽

[1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科疾病研究所(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué))；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)骨組織再生與損傷修復(fù)工程技術(shù)中心]

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)家族中的一員，1965年馬歇爾·烏里斯首次發(fā)現(xiàn)BMPs的活性[1]，然而，直到20世紀(jì)80年代后期，在相繼發(fā)現(xiàn)BMP-3、2、4之后，才更明確BMPs參與誘導(dǎo)骨形成的作用[2]。到目前為止，已確定識別大約20名BMP家族成員。BMPs信號通過絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，由Ⅰ型和Ⅱ型亞型組成。其中I型受體有3種，均能與BMP配體結(jié)合，即ⅠA型(BMPR-ⅠA或ALK-3)和ⅠB型BMP受體(BMPR-ⅠB或ALK-6)及ⅠA型激活素受體(ActR-ⅠA或ALK-2)[3]。Ⅱ型受體也有3種，分別是Ⅱ型BMP受體(BMPR-Ⅱ)、Ⅱ型和ⅡB激活素受體(ActR-Ⅱ和ActR-ⅡB)[4]。在這6種受體中，BMPR-ⅠA、BMPR-ⅠB和BMPR-Ⅱ是BMPs的特異性受體，ActR-ⅠA、ActR-Ⅱ和ActR-ⅡB是激活素的信號受體。這些受體在各種組織中是差異表達(dá)的。近年來，BMP配體、受體和信號分子在體內(nèi)功能的研究取得了重要進(jìn)展。

1 BMPs的生理功能

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)與多種功能密切相關(guān)。BMPs可誘導(dǎo)軟骨和骨的形成，不僅如此，BMPs也在一些非成骨性發(fā)育過程中起重要作用。神經(jīng)誘導(dǎo)是確定外胚層細(xì)胞分化的最早步驟。在脊椎動物中，BMPs作為表皮誘導(dǎo)信號，BMP-2誘導(dǎo)神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育成神經(jīng)元表型，BMP-4和7能特異性地誘導(dǎo)交感神經(jīng)腎上腺素能的表達(dá)[5]。BMPs還能通過抑制肌生成過程，為軀體發(fā)育提供方向。在肢體芽中，BMP-2與成纖維細(xì)胞生長因子4(fibroblast growth factor4,FGF-4)和音猬因子(sonichedgehog，SHH)相互作用，從而抑制肢體芽的膨脹，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞前體的形成[6]。

BMPs和BMP受體信號在正常骨形成中的生理作用方面有較多研究。在小鼠顱骨表面局部注射BMP-2可跳過形成軟骨階段，直接誘導(dǎo)骨膜骨形成[7]。成骨細(xì)胞前體2T3細(xì)胞中顯性負(fù)效BMPR-ⅠB的過度表達(dá)可抑制成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)和礦化骨基質(zhì)的形成[8]。以成骨細(xì)胞特異性Ⅰ型膠原啟動子為靶點的BMPR-ⅠB轉(zhuǎn)基因小鼠，出生后的骨形成，包括骨密度、靜態(tài)骨容積和動態(tài)骨形成率均降低[9]。這些結(jié)果表明，BMP受體信號在正常出生后骨形成中起著重要的作用。

2 BMPs和BMP受體的突變

對BMPs和BMP受體自然突變的研究表明，BMPs在幾種遺傳性疾病中均起著重要作用。在短耳突變的小鼠中，BMP-5基因被破壞，這種突變的BMP-5基因與廣泛的骨骼缺陷有關(guān)，包括長骨寬度的減少和部分椎體的大小以及整體骨骼重量下降[10]。進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良(fibrodysplasia ossificians progressive,FOP)是一種非常罕見和易致殘的遺傳病，其特征是大腳趾的先天性畸形和進(jìn)行性異位軟骨內(nèi)骨化，在FOP患者中發(fā)現(xiàn)BMP-4存在異位表達(dá)[11]。家族性原發(fā)性肺動脈高壓是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，其致病基因定位于染色體2q33，肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞叢洋病變是本病的主要表型。這種病變能導(dǎo)致肺動脈壓力升高，引起右心室衰竭甚至死亡。在對此病的多個家族系進(jìn)行基因分型后發(fā)現(xiàn)，患者中均存在BMPR-Ⅱ基因突變[12]。不僅如此，BMP-2、BMP-4和BMP-5的過度表達(dá)與口腔上皮的惡化有關(guān)[13]，前列腺癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有BMP-2和BMP-3的過度表達(dá)[14]。

3 BMPs、BMP受體和SMADs的無效突變

為確定BMP配體、受體和信號蛋白在胚胎發(fā)育和出生后發(fā)揮的作用，對已經(jīng)產(chǎn)生了BMP配體、受體和Smad基因的無效突變動物和它們的表型變化進(jìn)行了廣泛的研究。缺乏BMP-2和BMP-4的小鼠是不能存活的。純合子BMP-2突變胚胎在胚胎發(fā)育的第7.5 d(E 7.5)～10.5 d(E 10.5)之間死亡，并且心臟發(fā)育存在障礙，表現(xiàn)為心臟在外胚層中的發(fā)育異常[15]；純合子BMP-4突變胚胎在E 6.5～E 9.5之間死亡，這種胚胎幾乎沒有中胚層的分化[16]；BMP-7缺陷小鼠出生后不久就因腎臟發(fā)育不良而死亡。突變胚胎在幾個發(fā)育階段的組織學(xué)分析表明，腎后間充質(zhì)細(xì)胞的分化障礙，導(dǎo)致新生腎臟幾乎沒有腎小球。此外，BMP-7缺陷小鼠的視力障礙似乎起源于晶狀體誘導(dǎo)[17]。然而，缺乏BMP-6的小鼠是可行的和可育的，并且在已知表達(dá)BMP-6 mRNA的組織中沒有明顯的缺陷[18]。BMP-6主要表達(dá)于增生性軟骨，由于BMP-2和BMP-6在組織中存在協(xié)同表達(dá)，BMP-2可在功能上補償因BMP-6無效突變引起的BMP-6缺失的問題。

BMPR-ⅠA基因的無效突變導(dǎo)致小鼠胚胎在E 9.5死亡，并且在E 7.5首次檢測到具有形態(tài)缺陷的純合子突變體：突變胚胎中沒有中胚層的形成[19]，這表明BMPR-ⅠA是誘導(dǎo)過程中導(dǎo)致中胚層形成的關(guān)鍵因素。

缺乏BMPR-ⅠB的小鼠是可行的，它們僅在附肢骨骼中表現(xiàn)出缺陷。在BMPR-ⅠB缺失小鼠中，指骨區(qū)軟骨前細(xì)胞增殖和軟骨細(xì)胞分化明顯減少；在成年突變小鼠中，近端指間關(guān)節(jié)缺失，指骨被單一基本元素所取代，而遠(yuǎn)端指骨不受影響。橈骨、尺骨和脛骨的長度正常，但掌骨和跖骨的長度減少[20]。BMPR-ⅠB突變小鼠的附肢缺損與GDF-5位點的等位基因GDF-5bp-j缺失純合子小鼠相似，GDF-5在軟骨形成中有關(guān)鍵作用，并且與BMPR-ⅠB具有較高的親和作用[21]，表明BMPR-ⅠB在體內(nèi)軟骨形成中也起著重要作用。

BMP配體可利用多種Ⅰ型BMP受體介導(dǎo)其在軟骨和骨形成過程中的信號傳遞。在BMPR-ⅠB和BMP-7雙突變小鼠中，前肢和后肢均出現(xiàn)了嚴(yán)重的附肢骨骼缺損：尺骨幾乎消失，橈骨縮短[22]。由于BMP-7與BMPR-ⅠB和ActR-ⅠA(Alk2)能有效結(jié)合[23]，所以BMPR-ⅠB和ActR-ⅠA(Alk2)在體內(nèi)軟骨和骨形成中起著重要的協(xié)同或重疊作用。

Smad1無效突變小鼠死于E 10.5，因為它們無法與胎盤連接。Smad1突變胚胎表現(xiàn)為內(nèi)臟后內(nèi)胚層、胚外外胚層和絨毛膜中胚層的過度生長。Smad1突變胚胎中尿囊的過度生長效應(yīng)導(dǎo)致該組織的大小和形態(tài)急劇降低，同時也導(dǎo)致無法與胎盤形成有效連接[24]。純合子Smad5缺失突變小鼠在妊娠E 10.5～E 11.5期間因血管生成障礙而死亡。突變的卵黃囊缺乏正常血管，且血細(xì)胞分布也不規(guī)則。這種突變胚胎不僅血管擴(kuò)張，而且血管平滑肌細(xì)胞數(shù)量也減少[25]。這些發(fā)現(xiàn)表明Smad5可能在血管生成過程中調(diào)控內(nèi)皮-間充質(zhì)相互作用。

4 對BMP信號的負(fù)調(diào)控

BMPs對骨形成和其他細(xì)胞功能有較強刺激作用。這些作用體現(xiàn)在BMPs的活性受不同分子水平的控制：(1)一系列BMP拮抗劑結(jié)合BMP配體，從而抑制BMP功能；(2)Smad6是Smad家族的成員，它結(jié)合Ⅰ型BMP受體，阻止Smad1和Smad5的結(jié)合和磷酸化；(3)Tob是一種抗增殖蛋白，它選擇性地結(jié)合Smad1和Smad5，抑制成骨細(xì)胞中的BMP信號；(4)Smad泛素調(diào)節(jié)因子1(Smurf1)是E3泛素連接酶，它與Smad1和Smad5相互作用，并介導(dǎo)這些Smad蛋白的降解。

BMP拮抗劑的突變表明，在特定的系統(tǒng)中，BMPs的活性很重要。例如，近端指間關(guān)節(jié)畸形(proximal symphalangism，SYM1)是一種常染色體顯性疾病，表現(xiàn)為手指近端指骨間關(guān)節(jié)強直、腕骨和跖骨融合，部分病例表現(xiàn)為傳導(dǎo)性聽力喪失。這些癥狀與另一種關(guān)節(jié)形態(tài)障礙疾病—多發(fā)性滑膜炎綜合征有共同之處。據(jù)報道，這兩種疾病都是由人類noggin基因的雜合突變引起的。Noggin是一種分泌多肽，它與BMP-2、BMP-4和BMP-7結(jié)合并使它們失活，通過阻斷Ⅰ型和Ⅱ型BMP受體結(jié)合表位的分子界面抑制BMP信號。每個BMP-7單體上的Ⅰ型和Ⅱ型受體結(jié)合區(qū)與二聚體noggin復(fù)合物的特定剪接片段相互作用，從而阻止BMP-7與BMP受體結(jié)合[26]。到目前為止，已從與關(guān)節(jié)形態(tài)發(fā)生有關(guān)的不相關(guān)家族中發(fā)現(xiàn)7種noggin基因突變[27]。

硬化癥是一種隱性遺傳骨硬化性疾病，由硬化蛋白突變引起。這種疾病最初被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥的變體[28]，但隨后的代謝研究表明,其主要是由于骨形成增加，而不是骨吸收障礙導(dǎo)致[29]。研究還發(fā)現(xiàn)，硬化蛋白與BMP拮抗劑家族有一定聯(lián)系，其中包括Noggin、Chordin、Gremlin和Dan。硬化蛋白在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中表達(dá)，與BMP-5、BMP-6和BMP-7結(jié)合，并具有較高的親和力。硬化蛋白在多能成纖維細(xì)胞C3H10T1/2中的表達(dá)阻斷了成骨細(xì)胞的分化，而轉(zhuǎn)基因小鼠成骨細(xì)胞在骨鈣素啟動子的控制下，硬化蛋白的過度表達(dá)則引起骨質(zhì)疏松[30]。這些研究表明，激活內(nèi)源性BMP信號可促進(jìn)骨形成，并且出生后正常骨形成也必須經(jīng)過BMP活性的調(diào)控。

Tob是一種新型抗增殖蛋白家族成員，包括Tob、Tob2、BTG1、BTG2和BTG3。Tob通過與Smad1和Smad5蛋白的結(jié)合，抑制BMP誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中Smad依賴性轉(zhuǎn)錄。在Tob基因敲除小鼠中，BMP-2信號增強，BMP-2對成骨細(xì)胞增殖和分化的影響增加，同時也對BMP-2誘導(dǎo)的局部骨形成有促進(jìn)作用[31]。

調(diào)節(jié)BMP信號蛋白活性的另一個重要機(jī)制是由泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解機(jī)制。泛素-蛋白酶體蛋白水解途徑在細(xì)胞周期進(jìn)程、基因轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等各種重要生物過程中起著至關(guān)重要的作用[32]。泛素-蛋白質(zhì)結(jié)合物的形成需要三種酶參與泛素轉(zhuǎn)移反應(yīng)的級聯(lián)反應(yīng)：泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)。蛋白質(zhì)泛素化的特異性由E3泛素連接酶決定，它在確定底物特異性和26S蛋白酶降解蛋白質(zhì)中起著重要作用[33]。

5 BMP-2的治療利用

BMP-2的誘導(dǎo)成骨能力已在臨床前模型中得到證實。許多用于評估BMP-2治療骨缺損能力的動物模型都使用了臨界大小的骨缺損。這種設(shè)置有助于分析BMP-2誘導(dǎo)骨的能力。在包括大鼠、兔、狗、羊和非人類靈長類動物在內(nèi)的物種中，BMP-2也能用于治療長骨臨界大小的骨缺損[34]?；蛑委熝芯勘砻?，骨缺損是通過植入一種與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合的可吸收聚合物來愈合的，也就是植入腺病毒BMP-2[35]。在兩種不同的小鼠模型中，rhBMP-2的全身性給藥增加了間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，并逆轉(zhuǎn)了卵巢切除引起的與年齡相關(guān)的骨丟失[36]。這些結(jié)果表明，BMP-2可用于治療骨質(zhì)疏松癥。還有研究表明，以磷酸鈣或脂質(zhì)體載體注射rhBMP-2，能加速兔尺骨截骨模型和大鼠股骨頭缺損模型的骨愈合進(jìn)程[37]。除此之外，rhBMP-2還可作為脊柱融合手術(shù)中完整的骨移植替代物，在某些情況下，BMP-2誘導(dǎo)成功融合的療效甚至優(yōu)于自體骨移植。BMP-2在多種臨床應(yīng)用中被證明有效，包括椎間和腰椎后外側(cè)融合[38]、誘導(dǎo)新的牙本質(zhì)形成[39]，并有潛在的應(yīng)用作為根管手術(shù)的替代物，BMP-2還是一種有效的種植體周圍骨誘導(dǎo)劑，能應(yīng)用于牙周重建[40]。

雖然近年來在了解BMP信號在體內(nèi)的作用方面取得了顯著的進(jìn)展，但由于大多數(shù)BMP配體、受體和信號分子的缺失都可能產(chǎn)生致命的表型，所以仍需對單個BMP配體、受體和信號分子進(jìn)行組織特異性敲除，以進(jìn)一步確定BMP信號在特定組織中的特定作用。通過生成BMP配體、受體和信號分子的組織特異性和可誘導(dǎo)的條件敲除等位基因?qū)⑹刮覀冞M(jìn)一步了解關(guān)于BMP信號在出生后和成年動物中的生理功能。