肺泡Ⅱ型上皮細胞衰老與肺纖維化研究進展

張 乙，徐 洪

(華北理工大學(xué) a.臨床醫(yī)學(xué)院；b. 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063210)

肺纖維化是多種肺部疾病的最終表現(xiàn)，以失控的損傷修復(fù)為主要特征，引起了炎性細胞浸潤、成纖維細胞增殖、肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過度沉積，引起肺泡正常結(jié)構(gòu)和功能的破壞。肺纖維化早期診斷較為困難，無特異性的臨床表現(xiàn)，亦無特異性的治療手段，因此研究肺纖維化發(fā)生、發(fā)展機制與尋求新的治療靶點，一直是肺部疾病相關(guān)研究領(lǐng)域的難點和熱點問題。研究發(fā)現(xiàn)，細胞衰老是多種肺部疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因素[1]。本文復(fù)習(xí)了近年來有關(guān)肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar type Ⅱ cells, AT2)衰老在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展相關(guān)機制的相關(guān)文獻。

1 細胞衰老可能是肺纖維化形成的核心機制之一

衰老能夠引起肺內(nèi)干細胞的減少、線粒體功能失調(diào)、氧化應(yīng)激損傷加劇和端粒酶縮短，最終導(dǎo)致肺內(nèi)細胞不能保持穩(wěn)態(tài)平衡，是慢性阻塞性肺疾病和特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)等多種肺部疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因素[1]。復(fù)制性衰老與端粒酶損傷有關(guān)，DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response, DDR)通過激活毛細血管擴張性共濟失調(diào)突變激酶(ataxia telangiectasia-mutated gene, ATM)和毛細血管擴張性共濟失調(diào)Rad3 相關(guān)激酶(ataxia telangiectasia and Rad3-related kinase, ATR)，引起p53介導(dǎo)的短暫增殖停滯，DNA損傷修復(fù)成功則重新進入細胞周期，修復(fù)失敗則走向衰老或凋亡；過早性/應(yīng)激相關(guān)衰老則與端粒長度無關(guān)，通過p16INK4a-Rb信號、p53-p21CIP1信號的活化和相應(yīng)的細胞周期阻滯，或以p27信號作為靶向，以衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)為主要特點，與肺纖維化的形成關(guān)系密切[2-3]。SASP表型能夠激活多種促纖維化信號，包括p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)信號和Janus活化激酶(Janus-activated kinases, JAK)信號，并導(dǎo)致核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號的激活，從而引起了炎性介質(zhì)如白細胞介素(interleukin, IL)、生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)-β和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)的升高；其他與SASP有關(guān)的標記物的信號還包括纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)-哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號等，SASP細胞通過自分泌和旁分泌的形式促進細胞衰老的范圍和程度，并引起慢性炎癥的擴展，并能夠引起巨噬細胞-肺泡上皮細胞-成纖維細胞間促纖維化信號的交互作用[4]。因此，以SASP靶蛋白和靶信號作為治療方向，或上調(diào)組蛋白去乙?；?sirtuin 1或6)的表達，或利用特異的靶向微小RNA(micro RNA, miRNA)，或利用二甲雙胍激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)信號，有可能通過拮抗細胞衰老，從而改善肺功能、延緩肺纖維化的進展，即細胞衰老信號可能是抗肺纖維化治療的靶向之一[4]。

然而值得注意的是，細胞衰老可能對器官纖維化起到正、反兩反面的調(diào)節(jié)作用。在IPF、四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化和多囊腎等一些衰老相關(guān)的疾病中發(fā)現(xiàn)，衰老相關(guān)成纖維細胞形成SASP并分泌少量的TGF-β1，促進鄰近成纖維細胞轉(zhuǎn)化活化為纖維化相關(guān)成纖維細胞，但敲除p53基因或阻斷衰老途徑后，器官纖維化的進展反而加劇，表現(xiàn)為劇烈的DNA損傷，不可控的細胞增殖和凋亡，ECM分泌紊亂[5-6]。進一步研究則發(fā)現(xiàn)，雖然衰老相關(guān)成纖維細胞與纖維化相關(guān)成纖維細胞均可表達肌成纖維細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)且具有典型的肌成纖維細胞超微結(jié)構(gòu)和收縮特性，但是衰老相關(guān)成纖維細胞與ECM有關(guān)的mRNA缺失表達，而蛋白水解酶、膠原酶、彈性酶和基質(zhì)溶酶等表達水平升高，對鄰近的纖維化相關(guān)成纖維細胞增殖和遷移具有一定的抑制作用[7-8]。

雖然目前尚無細胞衰老與塵(矽)肺纖維化發(fā)生、發(fā)展直接相關(guān)的文獻報道，但衰老相關(guān)因素與塵(矽)肺纖維化進展關(guān)系密切。流行病學(xué)調(diào)查顯示，塵肺病患者接塵年齡與發(fā)病工齡呈負相關(guān)，即隨著接塵年齡的增加，發(fā)病工齡相應(yīng)縮短[9]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，與衰老有關(guān)的標記物，如p21、磷酸化組蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX, γH2AX)隨大鼠染塵時間增加而增高[10]。其他研究也發(fā)現(xiàn)，支氣管一次性灌注構(gòu)建的小鼠模型肺組織中，也存在著γH2AX表達水平的上調(diào)[11]。與衰老有關(guān)的自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體應(yīng)激等信號在矽肺發(fā)生、發(fā)展中的異常活化，通過調(diào)節(jié)p53及其下游信號，參與了對慢性炎癥、膠原沉積、肌成纖維細胞分化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等促纖維化信號的調(diào)控[12-13]，即在塵(矽)肺纖維化進展中，也可能伴隨了衰老信號的激活。

2 肺泡Ⅱ型上皮細胞的衰老加速了肺纖維化進程

已知AT2在維持肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)中具有重要意義，其主要功能包括增殖成為新的AT2細胞、向AT1細胞分化、分泌表面活性物質(zhì)，具有肺水轉(zhuǎn)運功能和免疫功能，因此部分文獻認為AT2細胞的功能異常是肺纖維化形成的重要因素，自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體應(yīng)激導(dǎo)致DDR被激活，除了可以導(dǎo)致AT2細胞的凋亡以外，同時能夠誘導(dǎo)AT2發(fā)生衰老，形成SASP表型，是肺纖維化重要的驅(qū)動因素[14]。

已經(jīng)證實AT2細胞衰老多伴有其他表型的轉(zhuǎn)換，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系密切。在IPF患者以及博來霉素小鼠模型中，均發(fā)現(xiàn)了衰老相關(guān)指標的上調(diào)，且來源于博來霉素小鼠的原代AT2細胞β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal)染色陽性，分泌型焦磷酸蛋白(secreted phosphoprotein, SPP)1和MMP2等公認的SASP指標表達均增加，且表現(xiàn)出上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型，予以抗衰老藥達沙替尼(dasatinib)和懈皮素(quercetin)則能夠顯著抑制博來霉素介導(dǎo)的細胞衰老和纖維化病變[15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose regulated protein, GRP)78基因敲除小鼠的AT2細胞表現(xiàn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷、凋亡、衰老和分化能力下降等表現(xiàn)，并伴隨著TGF-β1信號的異常激活，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是衰老和IPF之間的主要聯(lián)系[16]。另有研究也發(fā)現(xiàn)，細胞分裂周期蛋白(cell division cycle 42, Cdc42)的缺失表達能夠?qū)е翧T2細胞不能分化為AT1細胞，即無法形成新的肺泡結(jié)構(gòu)，且機械張力的增高導(dǎo)致AT2細胞TGF-β信號的異常激活，驅(qū)動衰老小鼠發(fā)生“外周向中心發(fā)展”的進展性肺纖維化，該研究將肺泡再生受損、機械性張力和進展性肺纖維化建立了聯(lián)系[17]。

該研究還利用單細胞測序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技術(shù)將AT2細胞區(qū)分為兩種亞群，其中與Cdc42表達缺失的基因與IPF發(fā)相關(guān)靶基因有類似的特點，多集中在肌動蛋白骨架的調(diào)節(jié)和黏著斑信號[17]，與肌成纖維細胞分化關(guān)系密切[18]。針對3例對照和6例IPF患者肺組織的scRNA-seq研究發(fā)現(xiàn)，存在不同作用類型的肺上皮細胞，其中命名為“不確定(indeterminate)”階段的肺上皮細胞伴隨著TGF-β、p53、Wnt等信號的異常激活[19]。來源于博來霉素小鼠肺組織的scRNA-seq研究也發(fā)現(xiàn)，老齡鼠AT2細胞炎癥相關(guān)指標上調(diào)，脂質(zhì)代謝指標下調(diào)[20]。另有研究顯示，AT2分化為AT1細胞在生理與病理狀態(tài)下機制不同，并與鄰近成纖維細胞有關(guān)[21]。上述研究提示，AT2細胞可能具有多種亞群，除了分泌肺泡表面活性物質(zhì)、分化為AT1細胞外，其可能還具有其他類型的作用，在病理狀態(tài)下也可能具有不同的反應(yīng)。

3 肺泡Ⅱ型上皮細胞的衰老可能是肺纖維化壁龕形成的重要因素

肺內(nèi)干細胞主要包括基細胞(還包括Clara細胞)，以表達轉(zhuǎn)錄因子腫瘤蛋白63(tumor potein 63, Trp63)、細胞角蛋白5、平足蛋白(podoplanin)等為主要特征，可自我更新并分化為氣道基細胞、纖毛細胞和分泌細胞，對于維持氣道上皮完整性具有重要意義[22]。而AT2細胞作為肺內(nèi)干細胞，與壁龕細胞(成纖維細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞)、ECM和來源于壁龕細胞的可溶性因子形成的干細胞壁龕共同調(diào)節(jié)了肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)[23]?；诜尾糠智谐g(shù)模型，能夠發(fā)現(xiàn)血小板源性生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)α陽性表達的肺成纖維細胞作為肺壁龕細胞，對于AT2細胞對急性肺損傷的修復(fù)具有重要意義，如果阻斷了PDGFα陽性表達的肺成纖維細胞相關(guān)信號，則影響AT2細胞的增殖和修復(fù)功能；體外培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)，與成纖維細胞共培養(yǎng)的AT2細胞更容易產(chǎn)生克隆性增殖，并可向AT1細胞分化[23]。因此肺壁龕是維持肺穩(wěn)態(tài)的重要微環(huán)境。

在肺纖維化進展中，AT2細胞存在衰老信號、促纖維化信號、轉(zhuǎn)分化信號的異常激活，是AT2細胞具有不同的亞群的依據(jù)[18-21]，也可以認為AT2細胞在空間上和時間上多個信號的異常激活交織在一起，展現(xiàn)了AT2細胞不同的細胞命運。研究發(fā)現(xiàn)，肺泡壁龕(間充質(zhì))細胞能夠?qū)nt信號發(fā)生應(yīng)答，以PDGFα陽性表達為特征，對于AT2細胞的生長和自我更新具有重要意義；而陽性表達Axin2的壁龕細胞則在損傷后優(yōu)先分化為肌成纖維細胞，參與損傷修復(fù)/纖維化進程[24]。另外一項研究則發(fā)現(xiàn)，陽性表達Axin2的AT2細胞是肺內(nèi)干細胞的主要亞群，能夠接受來自鄰近的成纖維細胞的Wnt分泌信號并保持干細胞特性，即成纖維細胞短程旁分泌Wnt促進AT2細胞的活性和增殖；當發(fā)生損傷時，AT2細胞能夠自分泌Wnt信號并暫時擴大干細胞儲備，并向AT1細胞分化，從而進行損傷修復(fù)[21]。在病理性條件下，ECM能夠通過整合素信號驅(qū)動內(nèi)源性潛在型TGF-β1信號的激活，促進AT2細胞發(fā)生EMT[25]。AT2細胞在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT進程中，能夠通過分泌結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)反過來通過自分泌和旁分泌形式活化成纖維細胞，從而促進了纖維化進展[26]。在對石棉肺的研究中發(fā)現(xiàn)，組織駐留的肺泡、支氣管周和血管周巨噬細胞和單核細胞來源的巨噬細胞構(gòu)成了纖維化壁龕，其中清除單核細胞來源的巨噬細胞能夠有效的改善肺纖維化病變，單核細胞來源的巨噬細胞通過M-CSF及其受體信號，通過激活PDGFα從而促進了成纖維細胞的增殖，并調(diào)節(jié)不同亞群的AT2細胞，這種巨噬細胞-間質(zhì)(成纖維)細胞和AT2細胞交互作用，是肺纖維化壁龕形成的重要環(huán)節(jié)[27]。課題組最近的實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，在矽肺纖維化不同的發(fā)展階段，AT2細胞呈現(xiàn)不同的特征表型，即正常情況下靜息、巨噬細胞肺泡炎階段增殖/活化、矽結(jié)節(jié)形成階段失去原有功能(可能是衰老)，最終凋亡。且AT2細胞與巨噬細胞一樣，在染塵早期即激活，可能與其鄰近的成纖維細胞、ECM和巨噬細胞的交互作用形成纖維化壁龕。推測AT2細胞在空間上和時間上多個信號的異常激活交織在一起，展現(xiàn)不同的細胞命運，包括衰老、凋亡，以及由“抗纖維化功能”向“促纖維化功能”轉(zhuǎn)變，可能是肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的新機制之一。

綜上所述，細胞衰老是肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。目前研究發(fā)現(xiàn)的與細胞衰老有關(guān)的信號和治療靶點，在正常的肺穩(wěn)態(tài)調(diào)控中也具有重要意義，對這些已知促纖維化信號的阻斷反而可能會起到相反結(jié)果，因此對于肺纖維化的靶向治療應(yīng)更為精準。以AT2細胞作為靶向細胞，以拮抗細胞衰老作為治療靶點，能夠從逆轉(zhuǎn)纖維化和維持肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)兩個方面拮抗肺纖維化的形成，可視為今后肺纖維化治療有前景的策略之一。