干細(xì)胞及其外泌體治療勃起功能障礙的研究進(jìn)展

莊靖銘（綜述） 侯劍剛（審校）

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院泌尿外科 上海 200040）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是一種常見的男科疾病，指男性無能力達(dá)到性生活所需要的充分勃起或維持勃起時(shí)間過短的病癥。各個(gè)年齡段均可發(fā)生，以中老年為主，且年齡越大發(fā)病率越高［1］。生理上，勃起需要副交感神經(jīng)末梢釋放的一氧化氮（NO）來實(shí)現(xiàn)。因此，各種原因引起的NO釋放減少和/或限制陰莖血流量可以導(dǎo)致ED。從病因?qū)W分析，ED 可分為器質(zhì)性、心理性和混合性。器質(zhì)性ED 可由多種代謝條件紊亂（如糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、陰莖纖維性海綿體炎等）或物理打擊（如創(chuàng)傷、盆腔手術(shù)等）所引起［2-3］。心理障礙（如焦慮、抑郁）可以通過精神性或藥物相關(guān)性途徑抑制勃起功能從而導(dǎo)致心理性ED。盡管在過去二十多年出現(xiàn)了諸如口服磷酸二酯酶抑制劑（phosphodiesterase 5 inhibitors，PDE5i）、海綿體內(nèi)注射（intracavernosal injections，ICI）血管活性藥物和低強(qiáng)度沖擊波等療法，但治療效果僅限于緩解癥狀，往往是出現(xiàn)暫時(shí)性的好轉(zhuǎn)而非永久性治愈或根本的病理性改善。對(duì)于嚴(yán)重ED 的治療突破則更加有限，其中糖尿病性ED 以及創(chuàng)傷后ED（包括醫(yī)源性）更加嚴(yán)重，且對(duì)傳統(tǒng)藥物治療反應(yīng)不佳。尋找和開發(fā)新療法，從而延長改善時(shí)間，提高療效，是這個(gè)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

在眾多療法中，干細(xì)胞（stem cells，SCs）療法因其對(duì)ED 有治愈的可能而引起了廣泛的關(guān)注。在此，我們簡要綜述現(xiàn)有ED 干細(xì)胞療法的臨床前實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)和未來可研究的方向。

干細(xì)胞干細(xì)胞是具有多向分化能力的可自我更新的細(xì)胞，可以從胎盤、羊水、脂肪組織、肝臟、肌肉、骨髓和臍帶血等組織中回收。成人干細(xì)胞駐留在稱為干細(xì)胞巢（stem cell niche）的特殊微環(huán)境中，巢內(nèi)細(xì)胞根據(jù)與干細(xì)胞的接近程度分為基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞。干細(xì)胞通過細(xì)胞黏附和細(xì)胞外基質(zhì)分子錨定到細(xì)胞巢。干細(xì)胞可以通過分泌細(xì)胞因子和生長因子傳遞信息［4］，其具有分裂能力和向各種類型的細(xì)胞分化的潛能。一個(gè)母細(xì)胞可產(chǎn)生兩個(gè)相同的干細(xì)胞（維持其數(shù)量）或兩個(gè)分化的細(xì)胞，甚至能產(chǎn)生一個(gè)干細(xì)胞和一個(gè)分化的細(xì)胞。它們分裂、分化和組織再生的能力高度依賴于周圍環(huán)境［5］。干細(xì)胞根據(jù)發(fā)育階段可分為胚胎干細(xì)胞（embryonic SCs，ESCs）和成體干細(xì)胞（adult stem cells，ASCs）；根據(jù)發(fā)育潛能可分為全能干細(xì)胞（totipotent）、多能干細(xì)胞（pluripotent）、專能干細(xì)胞（multipotent）和祖細(xì)胞（progenitor）。全能干細(xì)胞分化潛能最大，可分化出成熟生物體的所有細(xì)胞，但人類的全能干細(xì)胞只存在于胚胎發(fā)育的前3 天。多能干細(xì)胞可以產(chǎn)生三個(gè)生發(fā)層（即外胚層，中胚層和內(nèi)胚層）中的所有細(xì)胞；專能干細(xì)胞可以在發(fā)育成熟的器官中發(fā)現(xiàn)，并且可以分化成它們自己所在的生發(fā)層的細(xì)胞；最后，祖細(xì)胞顯示出最小的分化潛能（最多可分化成兩種類型的細(xì)胞）［6］。除了具有分化產(chǎn)生成熟組織細(xì)胞的能力，干細(xì)胞還發(fā)揮旁分泌作用，其似乎在受損或缺陷組織的愈合過程中起到了關(guān)鍵作用［7］。這可能是通過干細(xì)胞外泌體的趨化性、抗炎性、再生性、血管生成性和抗細(xì)胞凋亡性來實(shí)現(xiàn)的［8］。這些能力促使眾多學(xué)者研究它們?cè)谥委煾鞣N疾病中的可能性。

臨床前實(shí)驗(yàn)現(xiàn)階段大多數(shù)研究使用大鼠模型模擬了不同類型的人類ED。最廣泛應(yīng)用的兩種模型是誘導(dǎo)大鼠糖尿病引發(fā)的慢性ED（diabetes mellitus-induced erectile dysfunction，DMED）和模擬根治性前列腺切除術(shù)（radical prostatectomy，RP）后海綿體神經(jīng)損傷（cavernous nerve injury，CNI）的急性ED。治療方法大多是向成模動(dòng)物直接注射干細(xì)胞。已有多種類型的干細(xì)胞應(yīng)用于研究器質(zhì)性ED，這其中包括了 ESCs、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal SCs，MSCs）、神經(jīng)嵴干細(xì)胞（neural crest SCs，NCSCs）、內(nèi) 皮 祖 細(xì) 胞（endothelial progenitor cells，EPCs）、肌 源 性 干 細(xì) 胞（musclederived SCs，MDSCs）、脂肪源性干細(xì)胞（adiposederived stem cells，ADSCs）和尿源性干細(xì)胞（urinederived stem cells，USCs）。另外，在開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，一些研究人員也開始進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞共培養(yǎng)）來探究干細(xì)胞改善ED 功能的機(jī)制。

胚胎干細(xì)胞（ESCs） 由于倫理與法律的限制，ESCs 在ED 研究中的使用受到限制。 只有Bochinski 等［9］在2004 年進(jìn)行了相關(guān)研究，他們使用CNI 誘導(dǎo)的神經(jīng)性ED 大鼠模型，記錄了在大鼠海綿體和主盆神經(jīng)節(jié)（major pelvic ganglion，MPG）注射同源神經(jīng)胚胎干（NES）細(xì)胞的結(jié)果。將26 只雄性SD 大鼠分成4 組：5 只進(jìn)行假手術(shù)；8 只（對(duì)照組）進(jìn)行雙側(cè)CN 鉗夾，并將干細(xì)胞培養(yǎng)基注入其陰莖海綿體；4 只經(jīng)鉗夾后，將NES 細(xì)胞注入MPG；最后9 只鉗夾后，使用NES 細(xì)胞進(jìn)行ICI。3 個(gè)月后通過海綿體神經(jīng)電刺激評(píng)估勃起反應(yīng)，測(cè)定陰莖海綿體內(nèi)壓（intracavernosal pressures，ICP），免疫組化染色評(píng)估陰莖組織中神經(jīng)型一氧化氮合酶（neural NO synthase，nNOS）的質(zhì)量差異。結(jié)果顯示第一組的ICP 均峰值為96.9（18.0）cmH2O，明顯高于其他組（P<0.05）；第2 組ICP 均峰值為30.5（8.3）cmH2O，顯著低于第3 組［55.1（19.2）］和第4 組［54.1（23.8）cmH2O］（P均<0.05），第3 組和第4 組之間的平均ICP 峰值無顯著差異。在注射NES 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組中，染色結(jié)果也明顯更好。這說明使用NES 細(xì)胞，可以改善神經(jīng)源性ED 大鼠模型的勃起功能。

成體干細(xì)胞（ASCs） 對(duì)ESCs 的種種限制使得可以從患者自身取得的ASCs 在近些年的研究中更受青睞，在有關(guān)ED 治療的研究中也是如此。應(yīng)用各類ASCs（如MSCs、ADSCs 等）進(jìn)行ED 治療的動(dòng)物研究大多都得出了勃起功能改善的結(jié)論，許多團(tuán)隊(duì)正以進(jìn)一步確定哪種細(xì)胞類型表現(xiàn)最佳以及優(yōu)化治療方案為目標(biāo)進(jìn)行嘗試。

Abdel 等［10］使 用 同 源MSCs 對(duì) 老 年 大 鼠 進(jìn) 行ICI 以評(píng)價(jià)其療效，100 只大鼠每只進(jìn)行100 萬個(gè)單位MSCs 的 單 次ICI。在 第3 周、4 周、3 個(gè) 月 和4 個(gè)月（每組25 只大鼠）進(jìn)行ICP 測(cè)定和病理學(xué)檢測(cè)，并分別設(shè)立成年和老年對(duì)照組。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，注射組組織中平均cGMP 含量均顯著增加（P<0.05），ICP 測(cè)量也顯示MSCs 移植組均峰值顯著增加。注射后第3 個(gè)月和4 個(gè)月的平均cGMP 水平和ICP 均峰值與注射后第3 和4 周相比顯著增加，提示長期療效優(yōu)于短期。

Kendirci 等［11］使 用p75 神經(jīng) 生長因子受 體的抗體激活的骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）對(duì)CNI大鼠進(jìn)行了ICI，他們發(fā)現(xiàn)注射和非注射組的大鼠都出現(xiàn)勃起功能的改善，但注射p75 激活的干細(xì)胞組表達(dá)出了更高濃度的β-成纖維細(xì)胞生長因子，揭示了一種加強(qiáng)干細(xì)胞修復(fù)功能的途徑。另一項(xiàng)研究［12］則比較了雙側(cè)CN 鉗夾后分別向海綿體或腹腔注射BMSCs，使用兩種注射方法后大鼠的海綿體內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、陰莖NOS 和神經(jīng)微絲含量均有上升，但I(xiàn)CI 顯著優(yōu)于IPI（P<0.05）。

上述實(shí)驗(yàn)表明，干細(xì)胞注射有助于恢復(fù)陰莖的勃起以及其他生理功能［13］，這些基于干細(xì)胞的臨床前研究強(qiáng)調(diào)了干細(xì)胞治療后動(dòng)物ED 的恢復(fù)情況。而其治療作用機(jī)制仍不明確。ADSCs 和USCs 由于其豐富的自體來源、易于分離和較強(qiáng)的擴(kuò)增能力受到了特別關(guān)注，并且開始應(yīng)用于體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)［14］。Liu 等［15］通 過 病 毒 轉(zhuǎn) 染，制 備 出 表 達(dá) 大 量VEGF 的ADSCs。他們發(fā)現(xiàn)使用其進(jìn)行ICI 后，通過刺激內(nèi)皮功能和增加平滑肌和周細(xì)胞的含量，DMED 大鼠的勃起功能明顯改善。這樣的療法結(jié)合了干細(xì)胞注射與基因治療，Qiu 等［16］在MSCs 中也進(jìn)行過類似實(shí)驗(yàn)，表達(dá)VEGF 的MSCs 也表現(xiàn)出相同的優(yōu)勢(shì)。此外，ADSCs 注射聯(lián)合胰島素治療在鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的DMED 大鼠中能產(chǎn)生更好 的 治 療 效 果［17］。Zhou 等［18］發(fā) 現(xiàn)ADSCs 可 表 達(dá)VEGF，金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）和脂多糖誘導(dǎo)的CXC 趨化因子（LIX）。與對(duì)照組相比，ADSCs 注射組可恢復(fù)部分海綿體內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及nNOS 陽性神經(jīng)細(xì)胞的功能，并減少未經(jīng)胰島素治療的DMED 大鼠的細(xì)胞凋亡，可以將DMED 大鼠的ED 癥狀和病理表現(xiàn)改善至接近正常水 平［18］。Zhang 等［19］制 備 過 量 表 達(dá) 誘 導(dǎo) 型NOS（iNOS）的腺病毒感染了ADSCs，對(duì)DMED 大鼠進(jìn)行注射的同時(shí)，分離提取了大鼠海綿體平滑肌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示ADSCs-iNOS 可以顯著改善DMED 大鼠的勃起功能。體外則可以通過增加NO 生成和抑制海綿體平滑肌中的Ⅰ型膠原和Ⅳ型膠原表達(dá)以減少陰莖纖維化來達(dá)到治療效果。

Xu 等［20］在CNI 大 鼠 模 型 上 比 較 了 用 游 離 的ADSCs 進(jìn)行ICI 和用懸滴法培養(yǎng)ADSCs 3 天產(chǎn)生的微組織（micro-tissue，MT）進(jìn)行ICI。發(fā)現(xiàn)注射MT 組的細(xì)胞恢復(fù)數(shù)量增加，且ICP/MAP 也顯著上升，說明MT 注射更能改善勃起功能。Lin 等［21］將納米顆粒吸附ADSCs 來維持注射后的細(xì)胞簇。他們將這些干細(xì)胞簇注射到大鼠體內(nèi)觀察3 天，發(fā)現(xiàn)與單純注射ADSCs 相比，納米顆粒吸附組改善勃起功能更佳。

USCs 可以很容易地從尿液中分離出來，表達(dá)出多能祖細(xì)胞的性質(zhì)，并具有應(yīng)用于組織工程的潛力［22-26］。USCs 分泌促血管生成因子，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化，可能在糖尿病性ED 中有作用。Ouyang等［27］使用人類USCs 和FGF2 轉(zhuǎn)染的人類USCs 對(duì)2型DMED 大鼠進(jìn)行ICI 來確定這種療法是否具有改善勃起功能障礙的可能性。使用高脂飲食和STZ 誘導(dǎo)2 型DMED 大鼠進(jìn)行分組ICI。結(jié)果顯示雖然注射部位細(xì)胞數(shù)目增加不明顯，但是實(shí)驗(yàn)組ICP/MAP 明顯增加，且海綿體組織的內(nèi)皮和平滑肌標(biāo)記物的表達(dá)也明顯增加，推測(cè)可能是USCs 或USCs-FGF2 的旁分泌作用通過募集原有細(xì)胞和增加內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和平滑肌含量來誘導(dǎo)2 型糖尿病大鼠 勃 起功能的 改 善。Zhang 等［28］對(duì)USCs 的治療機(jī)制進(jìn)行了探索，使用高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）處理大鼠海綿體血管內(nèi)皮細(xì)胞模擬糖尿病環(huán)境。然后對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)評(píng)估USCs 體外保護(hù)作用。最后得出自噬功能障礙與DMED 大鼠海綿體內(nèi)皮功能和勃起功能障礙有關(guān)。且USCs 可上調(diào)海綿體內(nèi)皮細(xì)胞的自噬活性，有助于改善海綿體內(nèi)皮功能障礙，并最終有望改善糖尿病引起的勃起功能障礙。

干細(xì)胞外泌體（exosomes） 有一些觀點(diǎn)認(rèn)為注射干細(xì)胞改善性功能是由細(xì)胞的植入和分化造成的，但大多數(shù)意見還是以旁分泌機(jī)制為主。旁分泌機(jī)制強(qiáng)調(diào)勃起功能的改善是由于干細(xì)胞注射后分泌的細(xì)胞外囊泡（或外泌體）引起的，其內(nèi)容物包括細(xì)胞保護(hù)分子、抗纖維化分子和抗凋亡分子［29］。近幾年，隨著有關(guān)各類干細(xì)胞衍生物外泌體研究的不斷深入，也有一些學(xué)者開始將干細(xì)胞外泌體直接應(yīng)用于ED 的治療［30］，不失為另一種很有前景的治療方向。

Chen 等［30］使用超速離心的方法從培養(yǎng)ADSCs的上清液中分離出EXOs。將構(gòu)建好的2 型DMED大鼠模型分成3 組，分別用ADSCs 衍生的EXOs、ADSC 或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）進(jìn)行ICI。結(jié)果顯示，與ADSCs 類 似，ADSCs 衍生 的EXOs 能 夠 通過抑制細(xì)胞凋亡來增加海綿體內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的數(shù)量，從而促進(jìn)2 型糖尿病大鼠勃起功能的恢復(fù)。Ouyang 等［31］使 用 同 樣 方 法 獲 得 了MSCs 的EXOs。將雙側(cè)CNI 模擬神經(jīng)性ED 的大鼠模型分成3 組，分 別 用PBS、MSCs 或MSCs-EXOs 進(jìn) 行ICI，并且還分離培養(yǎng)了陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞（corpus cavernosum smooth muscle cells，CCSMCs）用于體外實(shí)驗(yàn)。結(jié)論顯示，MSCs-EXOs 可通過抑制CCSMCs 中的細(xì)胞凋亡來改善CNI 誘導(dǎo)的大鼠ED，其效力與MSCs 處理組相似。另一組研究人員使用USCs-EXOs 也得到了相似的結(jié)論，他們還通過RNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn)USCs-EXOs 中富集了促進(jìn)血管生成的多種的miRNA（miR-21-5p，let-7 家族，miR-10家族，miR-30 家族和miR-148a-3p）［31］。因此，與傳統(tǒng)的干細(xì)胞注射療法相比，EXOs 這種無細(xì)胞的細(xì)胞衍生療法在ED 治療方面可能具有更大的應(yīng)用潛力。

臨床試驗(yàn)Bahk 等［33］使用1.5×107單位的臍帶血干細(xì)胞對(duì)7 名糖尿病伴發(fā)ED 的患者（藥物治療至少6 個(gè)月未能正常勃起）進(jìn)行了ICI，之后與口服PDE5i 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可明顯改善性功能。跟蹤檢測(cè)9個(gè)月后沒有患者表現(xiàn)出對(duì)注射的不良反應(yīng)，3 名參與者在1 個(gè)月內(nèi)恢復(fù)了晨勃，2 名參與者6 個(gè)月后在口服PDE5i 的情況下成功完成性生活，除1 名以外的所有參與者都表示性欲增加。

Demour 等［34］首先進(jìn)行了Ⅰ期臨床試驗(yàn)并實(shí)現(xiàn)了長期隨訪，首次使用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）進(jìn)行連續(xù)2 次的ICI。參與者是4 名糖尿病性難治性ED 患者，并隨訪了2 年。結(jié)論是注射耐受性良好，患者沒有顯著的不良反應(yīng)，勃起功能和硬度也有顯著的改善。

Yiou 等［35］對(duì)行RP 后出 現(xiàn)ED 的12 名 患 者（最大劑量藥物治療無效）給予BMSCs 的ICI，4 組相同情況的患者注射劑量逐步增加BMSCs（分別為2×107，2×108，1×109和2×109）。之后全面 評(píng)估勃起功能。12 名患者在聯(lián)合口服PDE5i 的情況下有9 名出現(xiàn)性功能明顯改善。分組比較后發(fā)現(xiàn)，隨著注射劑量增加，自發(fā)勃起發(fā)生率增加，且該研究沒有報(bào)告嚴(yán)重的注射后不良反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)的第二階段［36］增加了6 名患者，并注射了第一階段確定的最佳劑量（1×109）的BMSCs，結(jié)果顯示，在第一階段參加實(shí)驗(yàn)的患者中，沒有前列腺癌復(fù)發(fā)，但勃起功能較1 年前時(shí)間點(diǎn)相比略低，這表明使用BMSCs 進(jìn)行ICI 是安全的，但隨著時(shí)間的推移可能需要重復(fù)多次的注射以維持更好的療效。

Haahr 等［37］使 用ASCs 對(duì)17 名 有RP 手 術(shù) 史 的ED 患者（藥物治療無法恢復(fù)）進(jìn)行ICI，以確定安全性、耐受性以及療效。結(jié)果顯示海綿體內(nèi)注射ASCs具有良好的耐受性，僅5 例患者出現(xiàn)與吸脂有關(guān)的輕微不良事件，2 例患者在注射部位出現(xiàn)紅腫或腫脹，1例患者出現(xiàn)陰囊和陰莖血腫，并發(fā)現(xiàn)其中有8 名能夠在沒有使用口服藥物的情況下實(shí)現(xiàn)勃起并完成性交。隨訪1 年后分析顯示［38］，RP 術(shù)后恢復(fù)了尿控力的患者通過注射可以明顯改善性功能。

未來方向無論是針對(duì)ED 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是臨床試驗(yàn)，干細(xì)胞相關(guān)療法大都顯示出對(duì)ED 癥狀的明顯改善，但關(guān)于ED 的干細(xì)胞療法仍然存在許多問題。比如，干細(xì)胞的免疫原性的問題，同種異體或自體的干細(xì)胞的選擇都有待明確。雖然自體干細(xì)胞會(huì)減輕免疫原性問題，但其獲得比同種異體的干細(xì)胞更加復(fù)雜。某些類型的干細(xì)胞可能會(huì)在后續(xù)增殖的過程中產(chǎn)生不良影響，且不同類型的干細(xì)胞，細(xì)胞的最佳傳代數(shù)可能不同［39］。注射的最佳細(xì)胞濃度，注射量是否應(yīng)基于患者體重或基于靶器官內(nèi)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)濃度也有待確定［40］。標(biāo)準(zhǔn)的給藥時(shí)間表也尚未建立，確定單次注射是否足夠還是在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行多次注射也是很有必要的。此外，干細(xì)胞治療效果的詳細(xì)機(jī)制也有待闡明，這也有助于明確將來的應(yīng)用治療范圍［41］。干細(xì)胞外泌體的研究可能會(huì)解決一些直接應(yīng)用干細(xì)胞進(jìn)行治療的障礙，但其分離方法較為困難，治療機(jī)制以及注射后的長期療效也尚未闡明。在大規(guī)模臨床試驗(yàn)之前，必須建立起規(guī)范的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，諸如國際勃起功能指數(shù)和勃起硬度量表。相信隨著ED 相關(guān)機(jī)制的研究不斷進(jìn)行以及對(duì)干細(xì)胞及其衍生物的認(rèn)識(shí)不斷深入，干細(xì)胞療法將會(huì)在ED 的治療中發(fā)揮更加重要的作用。