條件重編程培養(yǎng)技術(shù)體外長(zhǎng)時(shí)程分離培養(yǎng)原代細(xì)胞的應(yīng)用進(jìn)展

葉方疊（綜述） 楊 宸（審校） 姜昊文

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院泌尿外科 上海 200032）

條件重編程（conditional reprogramming，CR）培養(yǎng)技術(shù)目前應(yīng)用于多種原代細(xì)胞系的培養(yǎng)，由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)體系改良，并經(jīng)過(guò)試驗(yàn)專用于培養(yǎng)動(dòng)物組織來(lái)源的上皮細(xì)胞。CR 培養(yǎng)的具體步驟是細(xì)胞與輻射過(guò)的小鼠成纖維J2 細(xì)胞（滋養(yǎng)細(xì)胞）在配有Rho 相關(guān)激酶（Rho-associated kinase，ROCK）抑制劑（Y-27632）的條件培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。ROCK 抑制劑可提高骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞和人角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞無(wú)限增殖，故加入Y-27632 的培養(yǎng)基可以用來(lái)增加患者來(lái)源的正?；蚰[瘤上皮細(xì)胞的細(xì)胞株，以及肝細(xì)胞系的存活能力。該模型保持了原代細(xì)胞的生物學(xué)特性，含有藥物代謝酶及相應(yīng)的輔助因子，可為藥敏試驗(yàn)提供相關(guān)信息，為研究藥物代謝和藥物相互作用提供了良好的體外模型，應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)有較好前景。CR 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)作為原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的新興技術(shù)，目前僅用于膀胱癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤等相關(guān)領(lǐng)域。隨著技術(shù)的逐步成熟，CR培養(yǎng)技術(shù)將廣泛應(yīng)用于各個(gè)系統(tǒng)腫瘤。本文對(duì)CR培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于不同腫瘤細(xì)胞及其在藥物代謝中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

CR 培養(yǎng)體系概述多年來(lái)科學(xué)家致力于尋找一種能對(duì)人類正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行永久體外培養(yǎng)的培養(yǎng)體系［1］，但是傳統(tǒng)的細(xì)胞體外培養(yǎng)方法會(huì)改變細(xì)胞的表型、染色體組型、蛋白表達(dá)量。更為重要的是腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)會(huì)喪失原代腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，同時(shí)沒(méi)有基因突變的正常細(xì)胞由于端粒酶等限制無(wú)法在體外培養(yǎng)中長(zhǎng)時(shí)間存活，阻礙了對(duì)不同疾病進(jìn)行分子和細(xì)胞層面的深入研究。

一般采用SV 病毒（simian vacuolating virus）大T 抗原與管家蛋白相互作用［2］誘導(dǎo)細(xì)胞體外永生化或者過(guò)表達(dá)人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）［3］，使細(xì)胞獲得持續(xù)增殖的生物學(xué)特性。然而，通過(guò)基因操作的方式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)可能會(huì)造成染色體不穩(wěn)定，比如在傳代之后造成不可逆的關(guān)鍵基因或者性狀的丟失。大多數(shù)原代細(xì)胞難以維持體外擴(kuò)增，一般經(jīng)過(guò)有限代數(shù)就會(huì)停止生長(zhǎng)并逐漸死亡。

CR 培養(yǎng)技術(shù)由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)體系改良并經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，專用于培養(yǎng)動(dòng)物組織來(lái)源的上皮細(xì)胞。經(jīng)過(guò)CR 培養(yǎng)體系建立的原代細(xì)胞可以維持來(lái)源組織的染色體特征，并保持正常組織來(lái)源的生物學(xué)特性。例如人類前列腺癌的CR 細(xì)胞維持了來(lái)源組織第13 號(hào)染色體的突變，故原代細(xì)胞具有在基質(zhì)膠中生長(zhǎng)和在免疫缺陷小鼠皮下成瘤等生物學(xué)特征［4］。CR 技術(shù)用于肺部上皮、乳腺上皮［5］、結(jié)腸上皮、食管上皮［6］、包皮上皮和子宮頸陰道部及尿液脫落膀胱癌細(xì)胞，均獲得成功［7-8］。同時(shí)，重編程培養(yǎng)細(xì)胞（CR cell，CRC）在成人上皮細(xì)胞中表現(xiàn)出干細(xì)胞特性［9］。不同于其他細(xì)胞模型，CR 技術(shù)可以早期建立患者來(lái)源的正?；蚰[瘤細(xì)胞培養(yǎng)株，并保持無(wú)限擴(kuò)增而無(wú)需基因處理，從而保留了原代細(xì)胞的性狀和染色體特性。Y-27632 對(duì)細(xì)胞的永生化誘導(dǎo)和人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV-16）E6和E7 致癌基因誘導(dǎo)永生化的作用相同，E6 和滋養(yǎng)細(xì)胞的作用都是激活端粒酶，然而E7 和Y-27632 都能破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架并使Rho13 失活［10］。CR培養(yǎng)是可逆的，將培養(yǎng)細(xì)胞移出CR 培養(yǎng)基，根據(jù)培養(yǎng)條件不同，細(xì)胞停止增殖或終末分化。CRC 區(qū)別于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，EC）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPC），CRC不是挑選的結(jié)果，也不是通過(guò)基因操作誘導(dǎo)的結(jié)果。CR 技術(shù)能快速建立所需細(xì)胞模型，維持原代細(xì)胞的表型、腫瘤異質(zhì)性（主要指腫瘤內(nèi)異質(zhì)性）［11］、染色體組型和藥物敏感性等特征。

近年來(lái)，患者來(lái)源的異種移植物（patientderived tumor xenograft，PDX）逐漸發(fā)展成為更加系統(tǒng)的研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的模型。泛組織來(lái)源的CRC 可用于類器官PDX 模型的建立，因此CR 技術(shù)具有基礎(chǔ)研究、臨床診斷、治療和再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用前景（圖1）。

CR 應(yīng)用

CR 建立穩(wěn)定的患者來(lái)源的PDX 細(xì)胞株 目前抗腫瘤活性藥物的篩查依舊使用標(biāo)準(zhǔn)的癌癥細(xì)胞系。由于腫瘤細(xì)胞系易于擴(kuò)增的特性，利用這些細(xì)胞系已經(jīng)對(duì)癌癥的惡變機(jī)制以及藥物反應(yīng)有了一定的了解。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在藥物毒性作用下腫瘤細(xì)胞系選擇壓力導(dǎo)致細(xì)胞系發(fā)生分化，故難以代表原來(lái)腫瘤的特性。因此需要建立更多的代表腫瘤生物學(xué)特性的細(xì)胞株，用于藥物臨床前期的抗癌藥效篩選及驗(yàn)證。

PDX 是患者腫瘤和基質(zhì)組織直接移植入嚴(yán)重免疫缺陷小鼠，并在體內(nèi)維持，可用于臨床前藥物試驗(yàn)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)試驗(yàn)［12］。PDX 模型相比于標(biāo)準(zhǔn)癌癥細(xì)胞株，優(yōu)點(diǎn)在于維持了腫瘤的生物學(xué)特性，缺點(diǎn)是動(dòng)物消耗大，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，移植率不一致，缺乏持續(xù)的體外生長(zhǎng)，不適合大批量使用。傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的PDX 細(xì)胞多數(shù)停止增殖或在幾代內(nèi)發(fā)生凋亡。

Borodovsky 等［13］將CR 技術(shù)與PDX 技術(shù)結(jié)合，在體外以較高成功率傳代培養(yǎng)患者來(lái)源的PDX 組織。標(biāo)準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞系不能明確代表原代腫瘤的遺傳學(xué)和異質(zhì)性，所以在臨床藥物敏感試驗(yàn)以及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中作用有限。作者通過(guò)300 個(gè)基因?qū)ν砥趥鞔腃R-PDX 細(xì)胞系進(jìn)行靶向序列分析，數(shù)據(jù)顯示CR-PDX 成功維持了同位基因的頻率，沒(méi)有發(fā)生基因漂移，證明CR-PDX 維持了遺傳學(xué)的穩(wěn)定性。另一方面，結(jié)果證明CR-PDX 與原發(fā)腫瘤的藥物敏感性相同，可以用作藥物篩查試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞系的優(yōu)點(diǎn)在于能夠通過(guò)靶向敲除基因改變基因表達(dá)來(lái)判斷基因型和表型的關(guān)系。用靶向或打亂的對(duì)照小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染CR-PDX 細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）證明敲除成功，在研究結(jié)束時(shí)評(píng)估基因敲除對(duì)存活率的影響，研究數(shù)據(jù)顯示CR-PDX 細(xì)胞可以用來(lái)進(jìn)行基因操作研究，以探討細(xì)胞生理學(xué)，并為臨床相關(guān)細(xì)胞群的機(jī)制研究提供證據(jù)［13］。

CR 培養(yǎng)的尿液來(lái)源的膀胱癌細(xì)胞在精準(zhǔn)治療膀胱癌中的作用 在中國(guó)，膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中最常見(jiàn)的腫瘤［14］。膀胱癌的癥狀不明顯，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)大部分是中晚期，膀胱癌的治療方案不僅和臨床分期有關(guān)，而且與患者個(gè)體臨床情況有關(guān)。根據(jù)膀胱癌的不同分型，無(wú)肌層浸潤(rùn)膀胱癌的5 年生存率為60%~70%［15］，肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的5 年生存率僅為35%。因此，需要一種新型無(wú)創(chuàng)模型來(lái)早期診斷膀胱癌，并根據(jù)患者個(gè)體臨床情況選擇適當(dāng)?shù)姆呕熂笆中g(shù)，以提高患者生存率和改善患者生存質(zhì)量。

膀胱癌患者進(jìn)行活檢來(lái)獲取腫瘤組織構(gòu)建PDX 的藥敏模型和確認(rèn)膀胱癌患者的臨床分期屬于有創(chuàng)操作。尿液病理能提供精確、動(dòng)態(tài)的臨床信息，可以捕獲復(fù)雜的基因突變情況以及原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤的特點(diǎn)，同時(shí)尿液是易于獲取且無(wú)創(chuàng)檢查，已廣泛應(yīng)用于臨床，通過(guò)細(xì)胞學(xué)和生物標(biāo)記物來(lái)診斷膀胱癌。因此，通過(guò)CR 技術(shù)建立的尿液來(lái)源的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是臨床上理想的方法（圖2）。

我們實(shí)驗(yàn)室通過(guò)CR 技術(shù)建立源于原發(fā)腫瘤樣本和尿液的腫瘤細(xì)胞集落，并進(jìn)行3D 培養(yǎng)形成球體，HE 染色結(jié)果顯示CRC 表現(xiàn)出的腫瘤細(xì)胞特性與相應(yīng)的腫瘤病理切片相同；使用IHC 染色尿液中CRC 觀察細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物（GATA3、P40、P63）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)原發(fā)性腫瘤細(xì)胞相一致；對(duì)尿液CRC 進(jìn)行全外顯子測(cè)序（whole exome sequencing，WES）分析，與相應(yīng)的親代腫瘤進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CR 細(xì)胞與原發(fā)腫瘤組織共有79.7%~82.6%的變異譜。對(duì)原發(fā)腫瘤和尿液CRC 變異率分析表明，單核苷酸變異和插入、缺失在培養(yǎng)過(guò)程中保持一致［16］。因此，CR 技術(shù)維持了原發(fā)腫瘤細(xì)胞的分子特性以及遺傳結(jié)構(gòu)。這種快速有效建立尿液或患者來(lái)源的膀胱癌CRC 的方法有利于進(jìn)行大范圍的藥物篩查試驗(yàn)，以及了解細(xì)胞發(fā)生耐藥性的機(jī)制，這種新穎、無(wú)創(chuàng)、快速建立體外膀胱腫瘤系統(tǒng)的方法為特異患者的藥物反應(yīng)和個(gè)體化藥物治療提供了基礎(chǔ)［17］。

CR 用于體外長(zhǎng)期培養(yǎng)原代肝細(xì)胞 盡管肝細(xì)胞在體內(nèi)擁有相當(dāng)強(qiáng)的增殖能力，但在體外保持增殖和分化能力相當(dāng)困難，理想的培養(yǎng)方法應(yīng)滿足細(xì)胞數(shù)量大、密度高、細(xì)胞功能強(qiáng)而持久、易獲取等臨床應(yīng)用需求。前期研究主要在于培養(yǎng)永生化肝細(xì)胞，但永生化肝細(xì)胞勢(shì)必會(huì)丟失一部分原代肝細(xì)胞性狀，且在體外不能維持正常增殖和功能，所以需要一種新型技術(shù)培養(yǎng)非永生化肝細(xì)胞以維持原代肝細(xì)胞基因型、表型和功能。通過(guò)評(píng)價(jià)CYP3A4、1A1 和2C9 的活性以及白蛋白、s100a4、krt8、krt18、cyp1a1、cyp3a4、cyp2b6、cyp2c8、cyp2c9 和cyp2d6 的mRNA 表達(dá)情況來(lái)評(píng)估肝細(xì)胞功能；同時(shí)使用短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）分析比較這些細(xì)胞的DNA 指紋圖譜：它們與原代肝組織擁有同一組織來(lái)源［18］。來(lái)源于年輕患者的原代肝細(xì)胞培養(yǎng)的CRC 能在體外培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)3 個(gè)月，即使來(lái)源于年老患者的原代肝細(xì)胞培養(yǎng)的CRC 也能培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)2~3 個(gè)月，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)市面上的肝細(xì)胞株，最為重要的是這些CRC 在培養(yǎng)早期保持較高水平的CYP3A4、1A1 和2C9，意味著CRC 在早期具有較強(qiáng)的肝細(xì)胞功能。CR 培養(yǎng)的成本低，耗材少，可為臨床肝病研究以及解決肝源不足提供可行的體外培養(yǎng)模型（圖3）。

CR 提供去勢(shì)抵抗性前列腺癌藥物篩查模型（圖4） 據(jù)統(tǒng)計(jì)，至2019 年曾經(jīng)被診斷患有前列腺癌美國(guó)男性將超360 萬(wàn)人，確診患者的中位年齡為66 歲［19］。早期前列腺癌可以通過(guò)外科手段干預(yù)治療，進(jìn)展期前列腺癌缺乏有效的治療手段，常規(guī)的去勢(shì)藥物或者手術(shù)治療均會(huì)導(dǎo)致前列腺癌發(fā)展成為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）［20］。個(gè)體化癌癥治療基于患者的腫瘤譜系、組織病理學(xué)、表達(dá)分析和/或腫瘤DNA 或RNA 分析，因此需要一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的CRPC 模型來(lái)進(jìn)行藥物和放療療效篩查［21］。不同于其他腫瘤細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞不易獲取，來(lái)源單一，最常見(jiàn)的前列腺癌模型是PC-3、DU145 和LNCaP，均來(lái)源于轉(zhuǎn)移癌，既不能涵蓋全部前列腺癌，也不能代表個(gè)體原代前列腺癌細(xì)胞［22］。

人類前列腺的上皮組織有3 種類型：分泌性上皮細(xì)胞、基底細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞［23］。分泌性上皮細(xì)胞是柱狀上皮細(xì)胞，含有前列腺特異性抗原、前列腺酸性磷酸酶和細(xì)胞標(biāo)記物，如細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）和 雄 激 素 受 體（androgen receptor，AR）?；准?xì)胞位于分泌性上皮細(xì)胞下層，表達(dá)標(biāo)記物包括CK5 和CK14，僅表達(dá)低水平AR，基底細(xì)胞具有干細(xì)胞功能［24］。神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞是罕見(jiàn)的細(xì)胞類型，表達(dá)內(nèi)分泌標(biāo)志物，如突觸素和嗜鉻蛋白A，而不表達(dá)AR。建立和長(zhǎng)期維持來(lái)源于患者的前列腺腫瘤組織樣本的體外培養(yǎng)一直難以實(shí)現(xiàn)。近年來(lái)CR 技術(shù)的誕生使原代細(xì)胞體外培養(yǎng)有了突破性的進(jìn)展，生成了患者來(lái)源的去勢(shì)敏感的前列腺腫瘤到去勢(shì)抵抗的前列腺腫瘤的CRC，以及正常前列腺組織來(lái)源的CRC 作為對(duì)照組［25］。通過(guò)qRT-PCR 和流式細(xì)胞術(shù)比較源于患者腫瘤病理標(biāo)本的CRC 和已建立的前列腺癌細(xì)胞模型LNCaP，所有CRC 都表達(dá)高水平的基底細(xì)胞標(biāo)記物CK5、CK14 和TP63，幾乎不表達(dá)分泌性上皮細(xì)胞標(biāo)記物（如AR 和CK18），蛋白質(zhì)表達(dá)水平與LNCaP 相似，用基因組學(xué)、蛋白組學(xué)對(duì)這些CRC 進(jìn)一步確認(rèn)，表明CR 技術(shù)成功培養(yǎng)了細(xì)胞模型。通過(guò)CR 技術(shù)獲取的CRC-CRPC 用于藥物敏感試驗(yàn)，分別使用306 種臨床或新興抗腫瘤藥物，分成5 種濃度階梯，在72 h 后檢測(cè)細(xì)胞的生存率，以確定腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性［26-27］，顯示出幾種潛在抗腫瘤藥物的療效，如紫杉烷類、甲帕克林、奧沙利鉑和韋納托克拉司。最有效的是Navitoclax（ABT-263），它與bcl-2 家族成員過(guò)表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。該研究建立的CRC 培養(yǎng)體系既驗(yàn)證了新興的抗前列腺癌藥物的療效，也為CRPC 新藥的重新定位提供了依據(jù)。CR 技術(shù)可以用來(lái)對(duì)前列腺癌進(jìn)行大范圍的藥物篩查，以獲取最好的藥效學(xué)（圖4）。

CR 用于人類NSCLC 建模 NSCLC 占肺癌總數(shù)13%，NSCLC 占肺癌總數(shù)87%。肺癌診斷時(shí)多數(shù)為中晚期，約18%選擇手術(shù)治療，62%采取放化療。化療是治療惡性腫瘤最重要的手段之一，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥常常導(dǎo)致化療失敗。臨床前試驗(yàn)有助于新藥的開(kāi)發(fā)和個(gè)體化治療。目前的NSCLC 臨床前模型不能很好地反映患者腫瘤內(nèi)和腫瘤間的異質(zhì)性，因此以細(xì)胞為基礎(chǔ)的NSCLC體外模型成為研究熱點(diǎn)。Hynds 等［28］分享了從12例肺腺癌患者（Ⅱ期9 例，Ⅲ期3 例）中獲得原發(fā)性NSCLC 細(xì)胞培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)，以及如何提高NSCLC 體外培養(yǎng)的成功率。

利用CR 技術(shù)對(duì)NSCLC 原代細(xì)胞與小鼠成纖維細(xì)胞J3 共培養(yǎng)（加入ROCK 抑制劑），獲得10 組（83.3%）原代上皮細(xì)胞培養(yǎng)物。為了驗(yàn)證CR 技術(shù)培養(yǎng)的原代腫瘤細(xì)胞是否被正常基底細(xì)胞污染，對(duì)其中4 個(gè)細(xì)胞株進(jìn)行3D 培養(yǎng)分化，結(jié)果顯示細(xì)胞形成管腔，形成了含有分化的氣道上皮細(xì)胞類型的上皮球狀物，提示在腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)中擴(kuò)增了正常氣道基底細(xì)胞，并過(guò)度增殖。通過(guò)向免疫缺陷小鼠注射1×106細(xì)胞懸液進(jìn)行高通量測(cè)序，僅1 例表現(xiàn)原代腫瘤細(xì)胞特性，表明原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中NSCLC 樣本被正?；准?xì)胞所污染。因此，CR 技術(shù)用于NSCLC 培養(yǎng)的關(guān)鍵在于分離腫瘤細(xì)胞和正常基底細(xì)胞。除疾病階段對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)成功率有影響外，腫瘤基因型可能也是培養(yǎng)成功的決定因素之一。在進(jìn)行肺部腫瘤原代培養(yǎng)時(shí)應(yīng)徹底分離腫瘤細(xì)胞和正?；准?xì)胞，以防在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中因正?；准?xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)而抑制原代腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。CR 技術(shù)有望作為建立NSCLC 模型的新手段（圖5）。

CR 培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤保留了原代腫瘤的異質(zhì)性（圖6） 神經(jīng)母細(xì)胞瘤是嬰幼兒最常見(jiàn)的顱外腫瘤，屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的任意神經(jīng)脊部分，常見(jiàn)發(fā)生部位是腎上腺。近一半的神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生于2 歲以內(nèi)的嬰幼兒。不同神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后差別很大，約一半的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者盡管接受了強(qiáng)化的多模式治療，但預(yù)后不佳，而其他患者腫瘤可自行消退或分化為良性神經(jīng)節(jié)神經(jīng)瘤［29］，即神經(jīng)母細(xì)胞瘤間存在廣泛的腫瘤異質(zhì)性。因此，需要準(zhǔn)確的臨床前模型測(cè)試新的治療方法。CR 技術(shù)可以利用患者來(lái)源的少量細(xì)胞進(jìn)行快速繁殖，并維持腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，克服傳統(tǒng)細(xì)胞系的缺點(diǎn)?，F(xiàn)階段CR 技術(shù)成功建立了以TH-MYCN 小鼠轉(zhuǎn)基因纖維母細(xì)胞瘤模型中分離出來(lái)的腫瘤細(xì)胞株為原代細(xì)胞的細(xì)胞系（圖6），保留了懸浮生長(zhǎng)的能力，并成功傳代、冷凍和生物包埋，細(xì)胞系維持了原代腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，有利于解決成纖維母細(xì)胞瘤患者中廣泛存在的腫瘤間異質(zhì)性的問(wèn)題［30］。

CR 的優(yōu)缺點(diǎn)CR 能快速有效地體外培養(yǎng)原代細(xì)胞，并且保持染色體組型的完整性，只需要微量細(xì)胞量即可建系。CR 能迅速將患者腫瘤相關(guān)信息提供給臨床，達(dá)到精準(zhǔn)的抗腫瘤藥物敏感性篩查以及免疫治療。對(duì)患者腫瘤穿刺標(biāo)本進(jìn)行CR 培養(yǎng)，短時(shí)間內(nèi)就能提供精確的治療方案，即個(gè)體化醫(yī)療。CR 還可以用于擴(kuò)增癌旁組織（或癌前病變組織）、明確癌癥侵襲范圍及提前發(fā)現(xiàn)癌癥。

CR 技術(shù)用于3T3 小鼠成纖維細(xì)胞引起的人基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，以至于無(wú)法評(píng)估人基質(zhì)細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)發(fā)育及藥物敏感性的影響。其次，Y-27632 可能潛在干擾腫瘤細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)和入侵試驗(yàn)。第三，人類活組織標(biāo)本中含有正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，在CR 培養(yǎng)時(shí)正常細(xì)胞可能生長(zhǎng)快于腫瘤細(xì)胞，甚至侵占整個(gè)培養(yǎng)基。最后，滋養(yǎng)細(xì)胞與目標(biāo)細(xì)胞共培養(yǎng)存在污染目標(biāo)細(xì)胞的可能。

結(jié)語(yǔ)CR 技術(shù)作為一門新興方法，相比于傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)能夠快速、有效地建立細(xì)胞系，為基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)提供系統(tǒng)的分子模型，有助于從細(xì)胞分子角度了解腫瘤的發(fā)病機(jī)制。科學(xué)家致力于建立人類腫瘤樣本來(lái)源相關(guān)的成纖維細(xì)胞模型，以期為基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究提供一個(gè)更具潛力的癌癥模型系統(tǒng)，用以捕獲腫瘤細(xì)胞群和基質(zhì)成分（成纖維細(xì)胞）的相互作用。目前正在嘗試用CR 技術(shù)解決疾病，如通過(guò)基因編輯技術(shù)修復(fù)CRC，校正導(dǎo)致疾病的缺陷基因，再將修復(fù)的細(xì)胞導(dǎo)入機(jī)體，重新生長(zhǎng)得到這些校正的健康細(xì)胞，由于源自自身組織，避免了免疫排斥。