吲哚菁綠熒光成像技術在肝膽外科的應用進展

梅成杰，張中林，袁玉峰

(武漢大學中南醫(yī)院肝膽胰外科， 湖北 武漢430071)

吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)在機體內的攝取與排泄器官是肝臟，其在評估肝功能和肝血流的應用已經將近60年[1-2]。ICG熒光成像技術是近年出現(xiàn)的新型術中熒光導航技術，在腹部外科眾多領域中廣泛應用[3]。2008年Aoki等[4]首次報道ICG熒光成像技術應用于肝切除手術，實現(xiàn)解剖性肝段切除。2009年Gotoh等[5]與Ishizawa等[6]報道ICG熒光成像技術應用于肝癌切除術中病灶識別，對肝腫瘤特異性定位。2014年Kudo等[7]報道了第一批接受ICG熒光導航腹腔鏡肝切除術的病人肝腫瘤定界及切緣研究。近年來，得益于新型熒光成像系統(tǒng)和熒光導航設備在臨床上廣泛開發(fā)與應用，ICG熒光成像技術快速發(fā)展[8-9]。ICG熒光成像引導肝切除術相比傳統(tǒng)肝切除術在追求“精準肝切除”上具有顯著的優(yōu)勢[10]，在膽道系統(tǒng)疾病的應用上也進行了有益的探索[11]。本文回顧總結PubMed、Embase和Medline數(shù)據(jù)庫相關臨床研究并結合筆者經驗闡述ICG熒光成像技術在肝膽外科的應用進展及存在的問題。

一、 ICG熒光成像的原理

ICG相比其他花青染料，具有適合的激發(fā)和發(fā)射波長，其激發(fā)波長為750～810 nm，發(fā)射波長為840 nm左右，當熒光透過生物組織時，血紅蛋白吸收了所有小于700 nm波長的光，水又吸收超過900 nm的紅外光[12]。因此，ICG在近紅外光激發(fā)后，通過近紅外熒光攝像機掃描術野及計算機圖像處理后，將熒光信號(一般是綠色熒光)呈現(xiàn)給術者。

術前靜脈注射ICG后，98%～99%ICG分子能與血漿高分子蛋白如白蛋白、膜蛋白快速結合，并能在37 ℃條件下保持良好的光譜穩(wěn)定性[12]。ICG在體內僅通過肝膽管系統(tǒng)代謝。通過肝細胞主動轉運攝取并由膽道系統(tǒng)排泄，并且不經過腸肝循環(huán)。因此，ICG從血漿到膽汁的代謝速率反映了肝臟的代謝功能。在正常肝組織中，ICG能夠經肝膽系統(tǒng)在12～24 h內排泄。當存在肝腫瘤或肝硬化結節(jié)時，相應膽道排泄功能受損，ICG滯留在病灶內，這些病灶在術中通過熒光成像設備呈現(xiàn)[13]。此外，通過在術中經目標肝段門靜脈注射，或阻斷目標肝段門靜脈后經外周靜脈注射ICG，可實現(xiàn)目標肝段正顯影或負顯影；也可以利用ICG經膽道排泄的特性實現(xiàn)術中膽道造影。

二、ICG熒光成像的使用方法

1.ICG熒光成像系統(tǒng)設備 目前國內外主要熒光成像系統(tǒng)設備有日本Hamamatsu Photonics公司的Photodynamic Eye系統(tǒng)，加拿大Novadaq公司的Pinpoint系統(tǒng)和SPY系統(tǒng)，法國Fluoptics公司的Fluobeam系統(tǒng)[14]，以及中國OptoMedic公司的FloNavi系統(tǒng)[15-16]。隨著技術研發(fā)和經驗積累，ICG熒光成像系統(tǒng)與腹腔鏡和機器人手術系統(tǒng)更完美地結合應用，幫助手術醫(yī)生清晰準確地解剖肝臟。

2.ICG給藥方案 目前常用的注射用ICG規(guī)格是一瓶25 mg，自帶滅菌注射用水10 ml。ICG分子多環(huán)結構中的硫酸基決定了滅菌注射用水是ICG首選的溶劑，但ICG水溶液的穩(wěn)定性有限，應在稀釋6～10 h內使用，鹽溶液由于促進ICG分子聚集，不可用于ICG的配制[17]。ICG的給藥時間、注射途徑及注射劑量因病人體質及手術目的而不同，臨床研究建議也各有差異。我國2019年版《吲哚菁綠熒光染色在腹腔鏡肝切除術中應用的專家共識》[18]建議如下：

(1)腫瘤的識別與定位、明確腫瘤邊界、檢測殘余肝臟：靜脈注射ICG 0.05～0.5 mg/kg。①術前2～4 d。②明顯肝硬化：5～10 d。

(2)肝分段：①負顯示：術中靜脈注射ICG 1.0 ml (2.5 mg/ml)。②正顯示：術中經目標肝段門靜脈注射ICG 5 ml(0.025～0.05 mg/ml)。

(3)劃定肝預切線：① 非解剖性肝切除，術中靜脈注射ICG 0.05～0.5 mg/kg。② 解剖性肝切除，術中經靜脈注射ICG 0.05～0.5 mg/kg或經目標肝段門靜脈注射ICG 0.1～0.2 ml(2.5 mg/ml)。

(4)膽管成像：術中經靜脈或經目標肝段門靜脈注射ICG 1 ml(2.5 mg/ml)。

(5)活體肝移植：①切除供肝：術中經靜脈注射ICG 1 ml(2.5 mg/ml)或經目標肝段門靜脈注射ICG 0.1～0.2 ml(2.5 mg/ml)。②膽道重建：術中經膽囊管注射ICG 2 ml(2.5 mg/ml)。③血管重建：術中經靜脈注射ICG 1.5 ml(2.5 mg/ml)。

(6)檢查膽漏：術中經膽管注射ICG 5～10 ml(0.025～0.25 mg/ml)。

另有2019版《計算機輔助聯(lián)合吲哚菁綠分子熒光影像技術的在肝臟腫瘤診斷和手術導航中的應用指南》[17]建議如下：

(1)腫瘤識別、切緣界定、殘余肝檢測：靜脈注射ICG 0.25～0.5 mg/kg。① ICG15 min滯留率(ICG R15)≤7%，術前給藥時間>48 h時，更易獲得較好的顯影；術前給藥時間>5 d，能夠獲得滿意的顯影效果。② ICG R15>7%，術前給藥時間≥6 d。

(2)肝分段：① 負顯示：術中靜脈注射ICG 1.0 ml(2.5 mg/ml)。② 正顯示：術中經目標肝段門靜脈注射ICG 0.1 ml(2.5 mg/ml)與靛藍二磺酸鈉1 ml(1 mg/ml)。

(3)劃定肝預切線：①非解剖性肝切除，術前靜脈注射ICG 0.25～0.5 mg/kg。② 解剖性肝切除，術中經靜脈注射ICG 1 ml(2.5 mg/ml)或經目標肝段門靜脈注射ICG 0.1 ml(2.5 mg/ml)與靛藍二磺酸鈉1 ml(1 mg/ml)。

(4)檢測肝斷面膽漏：術中經膽囊管注射ICG 5～10 ml(2.5 mg/ml)。

(5)活體肝移植：① 膽道重建，術中經膽囊管注射ICG 2 ml(2.5 mg/ml)。② 血管重建，術中經靜脈注射ICG 1.5 ml(2.5 mg/ml)。

ICG注射時間、劑量及方法取決于ICG熒光導航方式及手術目的，不同病人之間可因基礎肝臟狀態(tài)而存在巨大差異。筆者團隊體會，肝葉反染經外周靜脈注射的ICG(1.25～2.5 mg)，或正染經支配門靜脈注射(0.125～0.25 mg)，多可達到滿意實施熒光引導手術的目的。我們甚至嘗試過常規(guī)劑量1/10的ICG進行右后葉反染切除引導，亦非常滿意?？梢?，肝臟組織對ICG蓄積明顯，熒光敏感，一定范圍(而非特定劑量)的ICG劑量均可達到良好染色效果。但是過大劑量時，熒光反應重，隨著手術時間的延長，邊界可出現(xiàn)浸染效應，導致切肝正染時“多切”或反染時“少切”。因此，筆者建議，應以能實施實現(xiàn)目標肝葉與相鄰肝組織的可視熒光分界的最小ICG劑量為準，而沒必要追求大劑量、重染色。對于肝外膽道排泄性造影，本中心經驗是1 mg劑量外周靜脈注射基本能夠滿足膽囊/膽管手術顯影需求且能夠避免等待時間過長、肝門區(qū)浸染等問題。

三、ICG熒光成像在肝膽外科的應用

1.肝腫瘤檢測識別 分子熒光成像技術在檢測肝表面潛在的微小腫瘤結節(jié)(包括轉移性腫瘤)具有高度敏感性，相比術前影像和術中超聲在顯示肝包膜附近的微小病變具有明顯優(yōu)勢[19]。Boogerd等[20]對26例疑似肝癌的病人行不同方式檢查的敏感度分別為80%(CT)，84%(MRI)，86%(腹腔鏡超聲)和92%(ICG熒光成像);3個轉移瘤(12%)僅由ICG熒光成像識別。Kaibori等[21]對比ICG和5-氨基乙酰丙酸兩種染料熒光成像，檢測腫瘤敏感度為96%比57%，特異度為50%比100%,準確度為94%比58%。Terasawa等[22]對53例術后病例回顧性研究發(fā)現(xiàn)，ICG熒光成像成功顯示45個病灶(85%)，其中3個結直腸肝轉移病灶無法通過術中超聲確定。術中通過ICG熒光成像能夠識別小至1 mm的淺表腫瘤。

Abo等[23]回顧117例病人研究指出術中超聲對惡性肝腫瘤的診斷準確性(94%)優(yōu)于ICG熒光成像(75%)，ICG熒光成像診斷假陽性率與假陰性率分別為24%和9%。Kose等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在144個肝腫瘤病灶中(62個淺表病灶與82個深部病灶)，腹腔鏡超聲檢查確定了92%，ICG熒光成像確定了43%。ICG熒光成像能檢測95%的淺表病灶，但深部病灶為4%。ICG熒光成像僅特異性檢出3%的淺表病灶，ICG熒光檢測受腫瘤病變在肝組織深度制約明顯。Peyrat 等[25]報道ICG熒光法檢測腫瘤的最大深度為13 mm。提示ICG熒光成像聯(lián)合術中超聲可較準確地檢測肝腫瘤。Masuda等[26]通過對84個終末期肝病活體肝移植病人的肝切除灶檢測發(fā)現(xiàn)， ICG熒光成像的敏感性、特異性和準確性分別為72.2%、31.8%和40.5%，而多排螺旋CT(MDCT)的敏感性、特異性和準確性分別為66.7%、92.4%和86.9%。對于伴肝硬化肝癌病人，ICG熒光成像檢測特異性明顯較低。

術中ICG熒光輔助識別肝表面微小腫瘤病灶最大的困境在于,非特異性熒光非常普遍——顯著肝硬化者尤甚,導致特異性不高。筆者單位送檢術中偶然發(fā)現(xiàn)的在普通白光下不易識別病灶(包括表淺及深部病灶)8枚，其中2枚證實為腫瘤性病變(原發(fā)性肝癌1枚，乳腺癌轉移瘤1枚)，占術中意外發(fā)現(xiàn)熒光病灶的25%(2/8)，另6枚證實為匯管區(qū)組織慢性炎癥并膽管增生，其在術中熒光顯像推測為肝內局部微膽管擴張并局限性膽汁淤積所致[27]。導致肝內異常局灶性熒光的因素眾多，肝臟表面微小囊腫、部分肝硬化結節(jié)、肝臟局灶性結節(jié)性增生(FNH)等也在術中熒光融合中表現(xiàn)為局灶性綠色熒光結節(jié)。術前影像不易呈現(xiàn)靠近肝包膜的微小病灶，即便是術中超聲，對顯著肝硬化病人肝表面微小病灶的識別也非常困難。因此，ICG熒光標記與術中超聲相結合，能夠取長補短，為術中發(fā)現(xiàn)與識別腫瘤肝內轉移的有效手段。

2.肝腫瘤熒光表現(xiàn) 肝腫瘤導致膽汁排泄微環(huán)境的改變。術前靜脈注射ICG后，正常肝臟組織可在12～24 h內完成對ICG的排泄，而腫瘤實質中的微膽管破壞則導致ICG排泄受阻[28]。分化良好肝癌組織內Na+-?；悄懰猁}共轉運多肽和有機陰離子轉運蛋白攝取和積聚ICG，形成完整熒光信號[13]。而低分化肝癌組織的轉運蛋白下調，周圍非癌性肝組織膽管結構紊亂，ICG排泄受阻，形成邊緣型熒光信號[29]。轉移性肝腫瘤缺乏正常肝細胞功能，壓迫周圍正常肝組織膽汁排泄，通常也表現(xiàn)為邊緣型熒光[30-31]。

Kaibori等[32]根據(jù)熒光成像特點將190例肝癌切除標本的ICG熒光圖像分為兩組[癌性成像組(HC組)和周圍組織成像組(HS組)]。他們發(fā)現(xiàn)，肝硬化組織在HC組明顯多于HS組。在HC組病人中，高分化肝癌組織通常表現(xiàn)為部分熒光型，比例高于全熒光型(48%比10%)。HS組中，低分化肝癌組織全部表現(xiàn)為環(huán)型熒光。He等[33]研究提示ICG熒光成像對靜脈癌栓能夠呈現(xiàn)3種熒光：完整熒光(高分化66.7%，中低分33.3%)，部分熒光(中低分化76%，低分化24%)，邊緣熒光(中低分化60%，低分化40%)。此外，ICG熒光成像技術對肝癌在腹腔的轉移灶也可以顯示出清晰完整的熒光信號。

3.肝切緣界定 腫瘤完全切除率(R0)是判斷手術療效的標準之一。在普通肝切除術中，肉眼很難判斷腫瘤與切緣的安全距離，安全切除距離不夠可能導致腫瘤殘余。另一方面，外科醫(yī)生需要為病人保留足夠的殘余肝來維持肝功能。因此，準確的切除范圍對病人的預后至關重要。

Liu等[34]通過對50例肝切除病人(分為ICG熒光組與超聲組)比較發(fā)現(xiàn)，ICG熒光組R0切除率為100%(25例完全切除)，超聲組R0切除率為96%(24例完全切除)。ICG熒光組有1例手術切緣距腫瘤1 cm內，而超聲組有7例(P=0.049),表明ICG熒光成像可保證腫瘤與切除邊緣之間的安全距離。數(shù)項研究[35-37]均表明ICG熒光導航肝切除相比普通肝切除具有更高的R0切除率。

筆者體會，術前ICG注射引導的腫瘤熒光顯像對腫瘤深在的中央區(qū)或右后區(qū)肝臟手術具有特別重要的價值[38]。中央區(qū)深部腫瘤，或者深在的右后區(qū)腫瘤，即使結合術中超聲，切肝過程中仍存在深部肝組織中不易定位、容易偏離的難題，若結合術中ICG熒光，則可實現(xiàn)實時定位腫瘤，避免切少(切破腫瘤或切緣不足)或切多(誤切可保留或必須保留的重要管道)的危險，從而提高腫瘤根治性和手術安全性。

4.肝段染色定位 解剖性肝切除相比常規(guī)肝切除可能有更多的腫瘤學獲益[39]，也存有爭議[40-41]。肝臟解剖結構復雜，脈管結構變異多，肝臟段-段間實際分界呈地圖狀立體交錯分布，既往以肝血流阻斷和術中超聲為基礎的解剖性肝切除術，很難做到真正意義上的“解剖性”切除[42]。Ishizawa等[43]首次報道了他們在腹腔鏡手術中應用ICG熒光成像顯示肝段的兩種方法——經目標肝段門靜脈分支注射ICG(正染)和結扎目標肝段肝蒂后經外周靜脈注射ICG(負染)。此后，Kobayashi等[44]根據(jù)腫瘤分級及門靜脈栓塞情況，將肝段染色分為單染、多染、復染、陰性染色及反陰性染色5種染色方式。便于實時清晰顯示門靜脈區(qū)，增強了對門靜脈區(qū)解剖切除的效果。Ueno等[45]報道了聯(lián)合血管造影和ICG熒光成像技術進行肝臟精準切除，增強了染料的視覺效果。值得注意的是，過多的ICG進入體循環(huán)會導致全肝染色，控制肝動脈或間歇性阻斷肝血流可以延長肝段熒光顯像可視化時間[46]。

我國2019年版ICG熒光導航手術應用指南[17]建議，根據(jù)肝段位置、肝蒂解剖難度，S1、S4宜使用負染色法，S2、S3、S5、S6正負染色均易實現(xiàn)，S7、S8宜使用正染色法。Inoue等[47]研究顯示，ICG熒光成像技術在24例病人中有23例(95.8%)達到有效分界肝段，而常規(guī)肝段分界技術僅在10例病人中達到有效分界(41.7%)。Miyata等[46]比較了ICG染色和靛胭脂染色對肝橫斷面切線的顯影效果，發(fā)現(xiàn)靛胭脂染色技術有效識別17例(57%)，ICG染色對肝段有效識別是100%。Yang等[48]采用聯(lián)合ICG熒光成像與三維實質染色引導下肝切除，實現(xiàn)了三維可視化系統(tǒng)計算的預測肝切除體積與實際肝切除體積的一致。

以ICG熒光標記肝段為基礎的解剖性肝臟手術，有兩點值得注意：首先，由于肝臟解剖學上天然分布的眾多肝段供血管道變異，不管采用正染或反染方法，均有成功率限制，技術上面臨天然瓶頸。其次，熒光肝分標記技術用于引導解剖性肝切除手術雖然提供了前所未有的精準性，但不等于絕對化解剖性肝段，臨床具體應用需兼顧腫瘤學根治性和外科學安全性的綜合考量。筆者工作中曾遇到肝段熒光界限與肝靜脈分段不一致、ICG熒光邊界非最佳腫瘤切緣的情況，術中臨時變更手術計劃，改行循肝右靜脈的解剖性右后葉切除手術。因此，把ICG熒光成像技術，與基于薄層影像的術前可視化三維重建及流域分布/體積評估技術、肝血流阻斷技術、術中超聲技術等手段綜合起來，靈活運用，對病人采取合理的個體化手術方案，是關鍵所在。

5.膽道顯像及膽漏檢測 術中常規(guī)膽道造影由于耗時，輻射暴露且本身易損傷膽管，臨床上褒貶不一[49]。ICG在機體內唯一排泄途徑是經膽道排泄的特點意味其可以作為術中膽道顯影新的方法，用于顯影肝外膽管以減少醫(yī)源性膽管損傷，或識別術中膽漏。Daskalaki等[50]報道了184例進行ICG熒光膽道造影，在99%的病例中可以看到至少一個膽道結構，膽囊管、膽總管和肝總管成功顯影率分別占97.8%、96.1%和94%，且無發(fā)生膽道損傷。Pesce等[11]研究提示在解剖卡洛氏三角后，膽囊管、肝總管、膽總管識別率顯著提升。系統(tǒng)評價[51-52]提示，ICG熒光造影可以顯著提升對重要膽道解剖結構的檢測敏感度，對于萎縮性膽囊、再次膽囊或膽管手術等肝門區(qū)膽道結構顯示不清的手術，有助于預防膽管損傷。

根據(jù)ICG注射途徑不同可分為外周靜脈注射(排泄性膽道造影)和膽道注射顯影兩種方式，用于肝外膽道顯影或膽漏檢測。外周靜脈注射后最快10 min后肝外膽管即可呈現(xiàn)熒光；直接膽道注射(經肝內、外膽管、膽囊或膽囊頸管)適宜濃度的ICG可產生即時性熒光。因與蛋白結合的ICG熒光濃度約0.25 mg/ml，ICG在較高濃度下對近紅外光的吸收能力降低，故為獲得膽管內注射ICG后膽管的清晰熒光圖像，可將ICG溶液稀釋到0.025 mg/ml用于造影。既往曾有Graves等[53]報道11例經膽囊直接注射ICG，僅1例因膽囊管被結石完全阻塞而未能顯示膽囊管的全長，但在本中心的實踐中發(fā)現(xiàn)，因膽囊質軟，容積較大，操作中易膽汁滲漏、污染術區(qū)視野。

膽漏是肝切除術后常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率一直維持在4%～13.8%[54]。Sakaguchi等[55]較早報道了在27例肝切除術后進行ICG熒光成像后，修復8例膽漏，且術后無膽漏發(fā)生，而32例進行常規(guī)注水檢測法術后發(fā)生了2例膽漏。Kaibori等[56]研究對比ICG熒光成像手術組與對照組，術后膽漏率分別為0%與10%。筆者體會，不管是正染還是反染，肝實質離斷后斷面浸染會顯著降低ICG熒光識別膽漏的分辨度和效率，因此，應在斷面完全止血并清洗去污后進行，必要時追加注射ICG，盡管可能存在視覺上的困難，但該方法仍不失為發(fā)現(xiàn)膽漏的有益手段。

6.病人預后 Handgraaf等[57]多中心回顧性分析ICG熒光成像引導下結直腸癌肝轉移切除術后病人。86例病人中4年無復發(fā)生存率為47%，相比87例常規(guī)肝切除病人為39%[多變量分析風險比為0.73，95%CI(0.42，1.28)，P=0.28]。 4年總生存率分別為62%和59%(P=0.79)。45例病人通過ICG熒光成像切除了肝外轉移灶，并在3年隨訪中未發(fā)生復發(fā)。Zhang等[58]對30例ICG熒光導航腹腔鏡肝切除手術病人和34例常規(guī)腹腔鏡肝切除病人回顧性分析，結果顯示，ICG組失血量更少(P=0.047)，術中輸血率更低(P=0.045)，術后住院時間更短(P<0.001)。Qi等[59]通過納入587例病人進行Meta分析，提示ICG熒光成像導航肝切除術有效減少手術時間、失血量、住院時間和術后并發(fā)癥，而術后死亡率、1年復發(fā)率無顯著差異。

四、問題與展望

ICG熒光成像技術作為一種新型醫(yī)療影像技術，聯(lián)合腹腔鏡或機器人平臺在肝膽外科領域，尤其是淺表微小腫瘤識別，輔助精準肝切除，降低術后并發(fā)癥等方面發(fā)揮了極大的作用。但也有諸多問題有待于解決：第一，肝臟ICG顯影敏感，各種小結節(jié)的非特異性熒光顯像十分普遍，是ICG應用過程中面臨的困惑之一。第二，ICG代謝受肝臟基礎狀況影響較大，如何根據(jù)肝功能狀態(tài)確定個體化給藥按劑量，達到最佳熒光成像效果，也是臨床應用中面臨的問題。第三，術中ICG注射熒光有可識別術中膽漏的優(yōu)點，但時有肝斷面浸染導致膽漏識別效率不高甚至無法識別的問題。第四，肝臟解剖結構復雜，管道變異多，受此影響導致的解剖性目標肝段顯影成功率有限。因此，在諸多不利因素客觀存在的現(xiàn)實中，將各種手段合理結合、運用，才能有助于發(fā)揮ICG熒光引導肝臟外科手術的最大價值。