響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸片球菌TK530發(fā)酵紅棗漿工藝

陸冉冉 劉慧燕 潘琳 方海田 王海寬 王彤 朱榮 姚會(huì)武 張振民

摘要：【目的】通過響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵紅棗漿工藝條件，為開發(fā)一種富含益生菌活性的棗漿飲品提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳曰罹鷶?shù)和感官評(píng)分為考察指標(biāo)，在料液比、發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時(shí)間等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken對(duì)乳酸片球菌TK530發(fā)酵紅棗漿工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝，并對(duì)發(fā)酵前后的紅棗漿營養(yǎng)指標(biāo)和抗氧化能力進(jìn)行測定分析。【結(jié)果】紅棗發(fā)酵飲料活菌數(shù)（Y1）與料液比（A）、接種量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）的二次回歸方程模型為：Y1（活菌數(shù)）=8.60+0.1150A+0.0288B+0.0038C-0.0525AB-0.0175AC+0.0100BC-0.4165A2-0.1790B2-0.1090C2（R2=0.9978），該模型擬合度較好，其中接種量與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)有極顯著影響（P<0.01，下同）。紅棗發(fā)酵飲料感官評(píng)分（Y2）與料液比（A）、接種量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）的二次回歸方程模型為：Y2（感官評(píng)分）=92.52+0.96A+0.49B+0.48C+0.45AB-3.43AC-1.93BC-7.51A2-5.01B2-3.58C2（R2=0.9924），該模型擬合度也較高，其中料液比與發(fā)酵時(shí)間、接種量與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分有極顯著影響，料液比有顯著影響（P<0.05，下同）。紅棗發(fā)酵飲品的最佳發(fā)酵工藝條件為：料液比1∶6、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量6%、發(fā)酵時(shí)間24 h，在此條件下，發(fā)酵紅棗漿中的活菌數(shù)為8.61 logCFU/mL，感官評(píng)分95.1分，與預(yù)測值接近。發(fā)酵后的紅棗漿pH 3.67，多酚含量0.84±0.014 mg/g，粗多糖含量0.22±0.018 mg/mL，總黃酮含量1.28±0.014 mg/mL，乳酸含量4.995±0.013 mg/mL，鐵離子還原力8.94±0.06 mg/100 mL，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率77.5%，2，2-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）自由基清除率64.3%，其中鐵離子還原力和ABTS自由基清除能力較發(fā)酵前紅棗漿顯著增強(qiáng)，DPPH自由基清除能力無顯著變化（P>0.05）。【結(jié)論】通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝制得的發(fā)酵紅棗漿飲品酸甜可口，色澤均勻，賦予產(chǎn)品特有的乳酸風(fēng)味，同時(shí)具有一定的抗氧化和自由基清除能力。

關(guān)鍵詞： 紅棗漿;乳酸片球菌;發(fā)酵;響應(yīng)面法;抗氧化活性

中圖分類號(hào)： S665.1;TS255.44? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）09-2245-09

Optimization of fermentation process of jujube pulp by Pediococcus acidilactici TK530 using response surface methodology

LU Ran-ran1， LIU Hui-yan1*， PAN Lin1， FANG Hai-tian1*， WANG Hai-kuan2，

WANG Tong1， ZHU Rong1， YAO Hui-wu1， ZHANG Zhen-min1

（1School of Food & wine/Ningxia Key Laboratory for Food Microbial-Applications Technology and Safety Control， Ningxia University， Yinchuan? 750021， China; 2College of Biotechnology， Tianjin University

of Science and Technology，Tianjin? 300457， China）

Abstract：【Objective】The response surface method was used to optimize the process conditions for fermenting red jujube pulp to provide a reference for the development of a jujube pulp drink rich in probiotic activity. 【Method】Using the number of viable bacteria and sensory scores as the inspection indicators，based on single-factor experiments such as material-liquid ratio，fermentation temperature，inoculation amount and fermentation time，Box-Behnken was used to optimize the fermentation process of red jujube pulp with Pediococcus acidilactici TK530，to determine the best fermentation process，and to determine the nutritional indicators and antioxidant capacity of red jujube pulp before and after fermentation. 【Result】The quadratic regression equation model of the number of viable bacteria of fermented red jujube beverage（Y1） and material-liquid ratio（A），the amount of inoculation（B） and the fermentation time（C） was：Y1（number of viable bacteria）=8.60+0.1150A+0.0288B+0.0038C-0.0525AB-0.0175AC+0.0100BC-0.4165A2-0.1790B2-0.1090C2（R2=0.9978），the model had a good fit， and the interaction between the amount of inoculation and the fermentation time? had extremely significant impact on the viable bacteria number（P<0.01，the same below）. The quadratic regression equation model of the sensory score（Y2） of fermented jujube beverage with the material-liquid ratio（A），inoculation amount（B） and fermentation time（C） was：Y2（sensory score）=92.52+0.96A+0.49B+0.48C+0.45AB-3.43AC-1.93BC-7.51A2-5.01B2-3.58C2（R2=0.9924），the model had a high degree of fit，and the interaction between the material-liquid ratio and fermentation time，interaction between inoculation amount and fermentation time had extremely significant impact on the sensory score， and had significant impact on material-liquid ratio（P<0.05， the same below）.? The optimal process conditions for fermented jujube beverages were： material-liquid ratio 1∶6，fermentation temperature 37 ℃，inoculation amount 6%，fermentation time 24 h. Under these conditions，the number of viable bacteria in fermented jujube pulp was 8.61 logCFU/mL，the sensory score was 95.1 points，which was close to the predicted value. The fermented red jujube pulp had pH 3.67，polyphenol content 0.84±0.014 mg/g，crude polysaccharide content 0.22±0.018 mg/mL， total flavonoid content 1.28±0.014 mg/mL，lactic acid content 4.995±0.013 mg/mL，iron ion reduction force 8.94±0.06 mg/100 mL，1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine（DPPH） free radical scavenging rate 77.5%，2，2-diazo-bis（3-ethylbenzothiazole）-6-sulfonic acid）（ABTS） free radical scavenging rate of 64.3%，of which the iron ion reducing force and ABTS free radical scavenging ability were significantly enhanced compared with the red jujube pulp before fermentation，and the DPPH free radical scavenging ability did not change significantly（P>0.05）. 【Conclusion】The fermented red jujube pulp drink prepared by optimizing the fermentation process through response surface experiments is sour and delicious，with uniform color，giving the product a unique lactic acid flavor，and has certain antioxidant and free radical scavenging activities.

Key words： jujube pulp; Pediococcus acidilactici; fermentation; response surface method; antioxidant activity

Foundation item： Ningxia Key Research and Development Project（2018BBF02008）; Ningxia Food Microbiology Application Technology and Safety Control Key Laboratory Platform Construction Project（2019YDDF0062）

0 引言

【研究意義】紅棗（Ziziphus jujuba Mill.）為鼠李科棗屬植物果實(shí)，是寧夏特色水果之一，栽培歷史悠久。其中，同心圓棗是寧夏特有紅棗品種之一，既可鮮食又可制成干品，營養(yǎng)豐富，其果實(shí)中總糖含量52%，總酸含量0.86%，含有18種氨基酸，特別是含有幼兒體內(nèi)無法合成的精氨酸和組氨酸（關(guān)俊玲等，2002;鄒繼偉，2014），還含有蛋白質(zhì)、多酚等多種生物活性成分（張艷紅，2007;Gao et al.，2013;Koley et al.，2016）。紅棗多糖不僅能調(diào)節(jié)人體腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)、降低血清膽固醇、降低餐后血糖和預(yù)防肥胖癥（Coleman et al.，2013;王靜，2016），還具有護(hù)肝治肝、降血壓（Liu et al.，2016）、抗腫瘤（王小媛等，2019）、抗氧化、健脾胃，提高機(jī)體免疫力，防治心血管疾病等功效（任婷婷等，2019）。乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）是一種能夠利用碳源微生物發(fā)酵生長并產(chǎn)生乳酸和細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物的益生菌株，具有調(diào)節(jié)胃腸道菌群、抗氧化（蔣琰潔等，2015）和維持腸道微生態(tài)平衡的功能（Choi et al.，2012），以及較好的耐酸耐膽鹽、抑菌和生物防腐特性（李亞男，2018）。紅棗在日常生活中用途廣泛，有補(bǔ)氣養(yǎng)顏、增強(qiáng)人體免疫力等功效，隨著人民生活水平的日益提高，以紅棗為原料深加工制成的健康食品具有廣闊的市場和開發(fā)前景。因此，探討寧夏紅棗發(fā)酵工藝及其抗氧化活性對(duì)棗漿飲品的開發(fā)利用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前已有對(duì)紅棗進(jìn)行開發(fā)研究的報(bào)道。王畢妮等（2011）研究發(fā)現(xiàn)紅棗3個(gè)部位（棗肉、棗核和棗皮）的甲醇提取液均具有一定的抗氧化活性及清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羥基自由基（·OH）的能力，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。楊艷艷（2012）通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定了紅棗醋酒精發(fā)酵的最佳工藝條件，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)棗醋是一種有效的自由基清除劑，其清除·OH和超氧陰離子（O[-2]·）的能力隨樣品濃度的增加而增強(qiáng)。范改敬（2015）比較紅棗漿和紅棗漿發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)紅棗漿發(fā)酵液的清除能力強(qiáng)于紅棗漿。趙光遠(yuǎn)等（2015）優(yōu)化了紅棗酵素的制備工藝，并研究其抗氧化能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅棗酵素能夠清除機(jī)體內(nèi)多余的自由基和亞硝酸鹽，并阻斷亞硝酸胺合成。靳玉紅等（2016）研究表明，紅棗乳酸發(fā)酵飲料發(fā)酵48 h的體外抗氧化活性與發(fā)酵12 h無顯著性差異，但口感更加豐富柔和。韓雪等（2018）采用幾種不同乳酸菌對(duì)紅棗漿進(jìn)行發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵后紅棗漿的游離態(tài)酚酸含量、組成及抗氧化性進(jìn)行測定分析，結(jié)果表明植物乳桿菌發(fā)酵棗漿后抗氧化性最強(qiáng)，可開發(fā)成一種營養(yǎng)品或功能性食品加以利用。張麗華等（2019）研究表明，植物乳桿菌發(fā)酵棗汁具有一定的抗氧化和自由基清除能力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前有關(guān)乳酸菌發(fā)酵生理功能的研究已有不少報(bào)道，其在降低血清膽固醇（王今雨等，2013）、清除活性自由基（李盛鈺等，2013）和抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性（程龍等，2015）等方面均有一定功效，但將乳酸片球菌用于棗漿發(fā)酵的研究鮮見報(bào)道。乳酸片球菌能高效產(chǎn)生乳酸，并產(chǎn)生抑菌活性的細(xì)菌素，從而作為安全的生物防腐劑得以使用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以乳酸片球菌為研究菌株，采用響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸片球菌發(fā)酵棗漿的工藝條件，并測定其抗氧化活性，為提升寧夏紅棗的生物加工技術(shù)水平和高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

寧夏同心圓棗為市售，乳酸片球菌TK530由天津科技大學(xué)酶與應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室保藏并提供。MRS肉湯培養(yǎng)基和MRS瓊脂培養(yǎng)基購自上海羽朵生物科技有限公司;福林酚試劑和乳酸標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、苯酚、氫氧化鈉、DPPH自由基、2，2-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）自由基、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、硫酸和沒食子酸均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。主要儀器設(shè)備：LDZX-50KB立式蒸汽壓力滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）;離心機(jī)（德國Eppendorf公司）;Starter2C pH計(jì)（河南中良科學(xué)儀器有限公司）;破壁打漿機(jī)（Chigo-YM1701，志高集團(tuán)）;BX43普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）;1260 Infinity型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;酶標(biāo)儀（HPX-9162MBE）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（湖北省黃石市醫(yī)療器械廠）;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（上海智誠分析儀器制造有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 乳酸菌活化與擴(kuò)培 將凍存管中保藏的乳酸片球菌TK530接種到滅菌的MRS培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h后，按照4%的接種量接入裝有50 mL液體MRS的藍(lán)蓋瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)37 ℃ 18 h。菌株傳代3次，使活力最終達(dá)到最佳。

1. 2. 2 紅棗漿制備 挑選無霉變的紅棗，用水沖洗表面污垢后去核。按料水比1∶6浸泡4 h后用破壁機(jī)打漿12 min，然后用高壓滅菌鍋進(jìn)行殺菌（80 ℃，30 min）。結(jié)束后，將制備好的菌液按不同的接種量接入紅棗漿中，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵。發(fā)酵期間，每隔6 h取樣1次，取樣完成后，迅速放入冰箱中冷藏待測。

1. 2. 3 發(fā)酵紅棗漿單因素試驗(yàn) 固定料液比1∶6（g/mL，下同）、發(fā)酵時(shí)間24 h、接種量4%，考察不同發(fā)酵溫度（31、34、37、40和43 ℃）對(duì)發(fā)酵紅棗漿品質(zhì)的影響;固定發(fā)酵時(shí)間24 h、接種量6%、發(fā)酵溫度37 ℃，考察不同料液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7和1∶8）對(duì)發(fā)酵紅棗漿品質(zhì)的影響;固定發(fā)酵時(shí)間24 h、料液比1∶6、發(fā)酵溫度37 ℃，考察不同接種量（2%、4%、6%、8%和10%）對(duì)發(fā)酵紅棗漿品質(zhì)的影響;固定接種量6%、料液比1∶6、發(fā)酵溫度37 ℃，考察不同發(fā)酵時(shí)間（12、18、24、30和36 h）對(duì)發(fā)酵紅棗漿品質(zhì)的影響。以發(fā)酵紅棗漿的活菌數(shù)和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1. 2. 4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定料液比、接種量和發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素的水平值，運(yùn)用Design-Expert 11進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1. 2. 5 感官評(píng)分 為評(píng)價(jià)發(fā)酵后的紅棗漿品質(zhì)，隨機(jī)請具有食品感官評(píng)價(jià)課程背景的10位老師和學(xué)生組成感官評(píng)定小組進(jìn)行無記名打分，分別從色澤、香味、組織狀態(tài)和酸甜度（表2）對(duì)發(fā)酵紅棗漿進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。取平均值作評(píng)分結(jié)果，總分為100分。

1. 2. 6 指標(biāo)測定 參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》的方法測定活菌數(shù);采用精密pH計(jì)測定pH;參照SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚—硫酸法》的方法測定粗多糖含量;參考GB/T 31740.2—2015《茶制品》的福林酚法測定多酚含量;參考梁艷花（2015）的方法測定鐵離子還原能力;采用硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法測定總黃酮含量;參照GB/T 5009.157—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品有機(jī)酸的測定》的方法測定乳酸含量;參考張麗華等（2019）的方法測定清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 2018和Design-Expert 11對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 1 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵紅棗漿品質(zhì)的影響 從圖1可看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵紅棗漿的活菌數(shù)和感官評(píng)分均呈先升高后降低的變化趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度升至37 ℃時(shí)，活菌數(shù)和感官評(píng)分均達(dá)最大值，分別為8.09 logCFU/mL和79.8分，發(fā)酵紅棗漿風(fēng)味和口感較佳。乳酸菌的生長繁殖與發(fā)酵溫度密切相關(guān)，直接影響紅棗漿的發(fā)酵品質(zhì)，發(fā)酵溫度過低會(huì)影響乳酸片球菌的正常生長，不能完全利用營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)酸速率降低;發(fā)酵溫度過高則會(huì)抑制乳酸菌的生長速率，只有在適宜的溫度條件下乳酸菌才能正常生長，發(fā)酵才能徹底。因此，選取最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

2. 1. 2 料液比對(duì)發(fā)酵紅棗漿品質(zhì)的影響 從圖2可看出，隨著料液比的減小，發(fā)酵紅棗漿的活菌數(shù)和感官評(píng)分均呈先升高后降低的變化趨勢。料液比為1∶5時(shí)含水量較少，不利于乳酸菌對(duì)料液的充分發(fā)酵;料液比為1∶7時(shí)，含水量較大會(huì)導(dǎo)致料液中營養(yǎng)物質(zhì)含量相對(duì)較低，從而降低乳酸菌的正常生長速率;料液比為1∶6時(shí)，發(fā)酵紅棗漿的活菌數(shù)和感官評(píng)分均達(dá)最大值，風(fēng)味和組織狀態(tài)均較好。因此，選取料液比1∶5、1∶6和1∶7 3個(gè)水平進(jìn)行下一步優(yōu)化。

2. 1. 3 接種量對(duì)發(fā)酵紅棗漿品質(zhì)的影響 如圖3所示，隨著接種量的增大，發(fā)酵紅棗漿的活菌數(shù)和感官評(píng)分呈先上升后下降的變化趨勢，當(dāng)接種量為8%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)最大值8.30 logCFU/mL，感官評(píng)分為90.3分，相對(duì)于接種量6%的感官評(píng)分較低。這是由于最初的接種量過低，發(fā)酵時(shí)間長、乳酸菌發(fā)酵代謝緩慢，隨著接種量增大，料液中的營養(yǎng)物質(zhì)含量有限，乳酸菌數(shù)量增多，發(fā)酵產(chǎn)物迅速積累，酸度液迅速上升，當(dāng)酸度上升到一定水平時(shí)，影響發(fā)酵紅棗漿感官和乳酸菌生長。因此，選取接種量4%、6%和8% 3個(gè)水平進(jìn)行下一步優(yōu)化。

2. 1. 4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵紅棗漿品質(zhì)的影響 由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵紅棗漿的活菌數(shù)和感官評(píng)分也呈先上升后下降的變化趨勢。在發(fā)酵24 h后，活菌數(shù)趨于穩(wěn)定;發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，感官評(píng)分達(dá)最大值90.1分，發(fā)酵時(shí)間為30 h時(shí)，活菌數(shù)達(dá)最大值8.38 logCFU/mL，感官評(píng)分降低。發(fā)酵時(shí)間短，乳酸片球菌活力未充分發(fā)揮作用而導(dǎo)致發(fā)酵不完全，紅棗漿中的生長物質(zhì)未被充分利用，活菌數(shù)偏低;隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，產(chǎn)生的大量乳酸會(huì)抑制乳酸菌生長，使菌株的生長和代謝受到抑制。因此，選取發(fā)酵時(shí)間18、24和30 h 3個(gè)水平進(jìn)行下一步優(yōu)化。

2. 2 紅棗漿發(fā)酵工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以料液比（A）、接種量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量，活菌數(shù)和感官評(píng)分為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

2. 2. 1 回歸方程擬合及方差分析結(jié)果 以活菌數(shù)為響應(yīng)值，回歸分析見表4，對(duì)各因素回歸擬合后，得到回歸方程：Y1（活菌數(shù)）=8.60+0.1150A+0.0288B+0.0038C-0.0525AB-0.0175AC+0.0100BC-0.4165A2-0.1790B2-0.1090C2。該回歸模型P<0.01，說明模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05，下同），說明沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象;R2為0.9978，表明紅棗漿發(fā)酵過程中以活菌數(shù)變化建立的模型與實(shí)際情況的擬合程度較高。試驗(yàn)誤差較小，模型調(diào)整確定系數(shù)R2為0.9950， 說明該回歸模型能解釋99.50%響應(yīng)值的變化，可用于預(yù)測和分析活菌數(shù)。一次項(xiàng)A、C，二次項(xiàng)BC及平方項(xiàng)A2、B2對(duì)發(fā)酵紅棗漿的活菌數(shù)均有極顯著影響（P<0.01，下同），而一次項(xiàng)B和交互項(xiàng)AB、AC對(duì)活菌數(shù)影響不顯著。根據(jù)F值大小可知，各因素對(duì)發(fā)酵紅棗漿活菌數(shù)影響的排序?yàn)镃>A>B，即發(fā)酵時(shí)間>料液比>接種量。

以感官評(píng)分為響應(yīng)值，回歸分析見表5，對(duì)各因素回歸擬合后，得到回歸方程：Y2（感官評(píng)分）=92.52+0.96A+0.49B+0.48C+0.45AB-3.43AC-1.93BC-7.51A2-5.01B2-3.58C2。該回歸模型P<0.01，說明該模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說明沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象;R2為0.9924，說明紅棗漿發(fā)酵過程中以感官評(píng)分變化建立的該模型與實(shí)際情況的擬合程度較高。試驗(yàn)誤差較小，模型調(diào)整確定系數(shù)R2為0.9826，說明該模型能解釋98.26%響應(yīng)值的變化，可用該模型預(yù)測和分析感官評(píng)分。各項(xiàng)方差分析結(jié)果表明，二次項(xiàng)AC和BC，平方項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)發(fā)酵紅棗漿感官評(píng)分有極顯著影響;一次項(xiàng)A對(duì)感官評(píng)分有顯著影響（P<0.05，下同）。根據(jù)F值大小可知，各因素對(duì)發(fā)酵紅棗漿感官評(píng)分影響的排序?yàn)锳>B>C，即料液比>接種量>發(fā)酵時(shí)間。

2. 2. 2 響應(yīng)面圖分析結(jié)果 響應(yīng)面的曲線越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變越敏感，反之曲面坡度越平緩，表明操作條件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響越?。n瑨等，2017）。由圖5可直觀看出接種量與發(fā)酵時(shí)間交互形成的曲面坡度很陡峭，說明兩者交互作用對(duì)活菌數(shù)的影響很大，達(dá)到極顯著水平。

由圖6和圖7可直觀看出各因素交互作用對(duì)發(fā)酵紅棗漿感官評(píng)分的影響。料液比與發(fā)酵時(shí)間交互作用的曲面較陡峭，說明兩者交互作用變化明顯，對(duì)感官評(píng)分的影響達(dá)極顯著水平;接種量與發(fā)酵時(shí)間交互形成的坡度也很陡峭，說明兩因素的交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響也達(dá)極顯著水平。該結(jié)果與表5的方差分析結(jié)果一致。

2. 2. 3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 通過Design-Expert 11分析得到乳酸片球菌發(fā)酵紅棗漿的優(yōu)化工藝條件：料液比1∶6.03、接菌量5.971%、發(fā)酵時(shí)間23.70 h，在此條件下的發(fā)酵紅棗漿活菌數(shù)為8.60 logCFU/mL，感官評(píng)分為92.2分。為驗(yàn)證模型預(yù)測理論值的準(zhǔn)確性和真實(shí)性，同時(shí)為方便實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵工藝的條件調(diào)整為：料液比1∶6，接種量6%，發(fā)酵時(shí)間24 h。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到發(fā)酵紅棗漿的活菌數(shù)平均值為8.61 logCFU/mL，感官評(píng)分95.1分，與理論預(yù)測值基本接近，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的發(fā)酵條件具有一定的可行性。

2. 3 發(fā)酵紅棗漿活性物質(zhì)含量測定結(jié)果

由表6可知，紅棗漿在優(yōu)化條件下進(jìn)行發(fā)酵后，其pH、多酚和粗多糖含量下降，因在發(fā)酵前期紅棗漿已含有豐富的糖類，在發(fā)酵過程中乳酸片球菌進(jìn)行生長消耗了棗漿中含有的糖分，使得多糖含量下降;活菌數(shù)、總黃酮和乳酸含量升高，可能乳酸菌能釋放結(jié)合態(tài)黃酮成為游離態(tài)黃酮，使得總黃酮含量增加，但發(fā)酵前后含量差異不顯著，說明在優(yōu)化的發(fā)酵條件下制備獲得的紅棗乳酸發(fā)酵飲料中的活性成分得到很好地保留。

2. 4 發(fā)酵紅棗漿的體外抗氧化能力測定結(jié)果

將發(fā)酵前后紅棗漿的3種抗氧化能力進(jìn)行比較，如表7所示，與未發(fā)酵的紅棗漿相比，經(jīng)乳酸片球菌發(fā)酵后的紅棗漿鐵離子還原力和ABTS自由基清除能力顯著增強(qiáng)，而DPPH自由基清除能力無顯著變化。表明發(fā)酵紅棗漿具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

3 討論

目前，紅棗飲品加工工藝大多通過正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，但存在紅棗利用不充分、發(fā)酵工藝繁瑣及滅菌溫度高等問題。因此，研究開發(fā)一種利用率高、同時(shí)盡可能保持棗漿中活性成分的工藝十分有必要。本研究以料液比、發(fā)酵時(shí)間和接種量為考察因素，以活菌數(shù)和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化乳酸片球菌發(fā)酵紅棗漿的工藝條件。通過乳酸片球菌充分利用紅棗漿中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵，結(jié)果表明，乳酸片球菌在紅棗漿中生長良好，活菌數(shù)達(dá)8.61 logCFU/mL。趙光遠(yuǎn)等（2015）通過分段式發(fā)酵得到紅棗酵素的最佳工藝條件，之后再進(jìn)行糖和檸檬酸調(diào)配，制得一款酸甜可口的酵素飲料，但其發(fā)酵時(shí)間過長，工藝上需進(jìn)行不同發(fā)酵溫度的控制，生產(chǎn)成本過高。本研究通過響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，得到發(fā)酵紅棗漿的最優(yōu)工藝條件：料液比1∶6、接種量6%、發(fā)酵時(shí)間24 h，在此優(yōu)化條件下得到發(fā)酵液中活菌數(shù)平均值為8.61 logCFU/mL，感官評(píng)分95.1分，與理論預(yù)測值基本接近，通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的乳酸片球菌發(fā)酵紅棗漿的工藝參數(shù)穩(wěn)定可靠。獲得的紅棗漿發(fā)酵飲料活菌數(shù)和感官評(píng)分略高于張麗華等（2019）發(fā)酵紅棗汁的研究結(jié)果，可能是研究的棗材料不同，以及滅菌溫度不同導(dǎo)致棗漿中的活性成分保留量不同，從而影響活菌數(shù)和感官評(píng)分等指標(biāo)。通過測定紅棗漿發(fā)酵前后成分含量變化情況，發(fā)現(xiàn)粗多糖和多酚含量較發(fā)酵前有所下降，而總黃酮和乳酸含量上升。這可能是由于乳酸菌在生長過程中消耗了碳源導(dǎo)致多糖含量下降，轉(zhuǎn)化成代謝產(chǎn)物，從而導(dǎo)致乳酸增加;多酚類物質(zhì)在乳酸菌發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化成黃酮類物質(zhì)，導(dǎo)致黃酮含量有所上升，與靳玉紅等（2016）的研究結(jié)果一致。

鐵離子還原力通過自身氧化還原作用，提供電子清除自由基，還原能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。DPPH自由基是一種十分穩(wěn)定的自由基，其穩(wěn)定性來自共振穩(wěn)定作用及3個(gè)苯環(huán)的空間障礙。本研究結(jié)果顯示，發(fā)酵紅棗漿的鐵離子還原力為8.94 mg/100 mL，DPPH自由基清除率為77.5%，ABTS自由基清除率為64.3%，其中鐵離子還原力和ABTS自由基清除能力較發(fā)酵前紅棗漿顯著增強(qiáng)，DPPH自由基清除能力有所下降，但差異不顯著。這與梁艷花（2015）研究發(fā)現(xiàn)紅棗乳酸飲料對(duì)ABTS自由基的清除能力強(qiáng)于紅棗汁的結(jié)果一致，但與張麗華等（2019）研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后紅棗汁對(duì)DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力較發(fā)酵前有所降低的結(jié)果不完全相同，可能是乳酸菌種類和發(fā)酵工藝方式不同所致。本研究對(duì)紅棗漿發(fā)酵前后的抗氧化活性進(jìn)行測定，從總體上看，通過乳酸片球菌發(fā)酵紅棗漿具有較強(qiáng)的抗氧化能力，該研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究紅棗的活性成分抗氧化機(jī)理和提高寧夏紅棗產(chǎn)業(yè)化技術(shù)提供參考。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝（料液比1∶6，乳酸片球菌接種量6%，在37 ℃下發(fā)酵24 h）制得的發(fā)酵紅棗漿飲品酸甜可口，色澤均勻，賦予產(chǎn)品特有的乳酸風(fēng)味，同時(shí)具有一定的抗氧化和自由基清除能力。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）